柚皮苷对映异构体的分离方法与流程

本发明涉及化工与制药领域，特别是涉及柚皮苷对映异构体的分离方法。

背景技术：

柚皮苷(naringin)广泛存在于芸香科柑橘属植物中，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、神经保护、降血脂、改善糖尿病等多种生理活性，有较高的药用价值。其结构中c-2位是一个手性碳原子，存在一对对映异构体。研究表明，手性药物分子进入生物体时，不同构型的药物分子产生的生物活性如药效和药物动力学可能存在很大的差异，因此进行手性药物的拆分，对药物的质量控制、药效评价，以及新药开发都具有重要的意义。

但是，手性药物结构相似，分离困难，因此手性拆分仍是药物分析工作的一个难点。目前虽有文献报道采用高效液相色谱法或环糊精修饰手性毛细管胶束电动色谱法检测柚皮苷对映异构体，但这些方法仅限于检测分析，不适于放量制备。

超临界流体色谱(supercriticalfluidchromatography，sfc)，是以超临界流体co2作流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的技术，具有分离快、灵敏度高、经济和绿色环保等特点。它能方便将分析方法放大到半制备、制备的纯化方法，从而能够低成本、高效率的获得高纯度的单一对映体化合物。

虽然传统的超临界流体色谱检测对对映体化合物的分离提供了有效的途径，但是大多用于化合物纯品中所含对映体化合物的分离，难以推广到含对映体化合物的植物或中药原料中去，植物或中药原料中对映体化合物的分离依然面临困难。

技术实现要素：

基于此，本发明的主要目的是提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法不仅能够从柚皮苷纯品中分离对映异构体，特别是还能够从植物或中药原料中很好的分离柚皮苷对映异构体，避免植物或中药原料中所含的其他众多化合物群的干扰。本发明所述的分离方法包括制备方法、分析方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

制备供试品溶液；

以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

在其中一些实施例中，所述的多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为30～50℃，背压为1500～3000psi，检测波长283nm，采用的洗脱方式包括：流动相a的初始比例为100％～80％，于0～30min内变化至40％。

在其中一些实施例中，所述的多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为33～45℃，背压为1800～2500psi，检测波长283nm，采用的洗脱方式为：流动相a的初始比例为90％，于0～20min内变化至40％。

在其中一些实施例中，所述的多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为35℃，背压为2100psi，检测波长283nm，采用的洗脱方式为：0～15min，a由90％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％。

在其中一些实施例中，所述的多糖衍生物类手性色谱柱的填料包括直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯、直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)。

所述的超临界流体为超临界co2，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中的至少一种，或者所述的有机溶剂为甲醇与酸的混合液、乙醇与酸的混合液、乙腈与酸的混合液、异丙醇与酸的混合液。

在其中一些实施例中，所述的多糖衍生物类手性色谱柱的填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；所述的超临界流体为超临界co2，所述的有机溶剂为甲醇或0.2％甲酸-甲醇溶液。选用该填料时峰形、分离度都较好。

在其中一些实施例中，所述的超临界色谱法采用分析型超临界色谱仪，则：多糖衍生物类手性色谱柱的填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；流动相a为超临界co2、流动相b为甲醇；多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为35℃；背压2100psi；检测波长283nm；流速为1～5ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～15min，a由80％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％。

在其中一些实施例中，所述的超临界色谱法采用制备型超临界色谱仪，则：多糖衍生物类手性色谱柱的填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；流动相a为超临界co2、流动相b为甲醇；多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为35℃；背压2100psi；检测波长283nm；流速为5～300ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～15min，a由80％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％。

在其中一些实施例中，所述的供试品溶液为由柚皮苷纯品制备成的溶液。

在其中一些实施例中，所述的供试品溶液为由含柚皮苷的植物或中药提取物制备成的溶液。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明首次将超临界色谱技术应用到柚皮苷对映异构体的分离中来，特别是通过采用合适的超临界色谱条件构建柚皮苷对映异构体分离方法，该分离方法具有普适性，用其进行柚皮苷对映异构体分离时，供试品溶液不限于柚皮苷纯品制备的溶液，还能够适用于从植物或中药提取物(例如柑、橘、橙、柚、柠檬、化橘红、橘红、橘核、橘络、橘叶、青皮、陈皮、枳实、枳壳、酸枣仁、香橼、佛手、骨碎补等提取出来的含有柚皮苷的提取物)中很好的分离柚皮苷对映异构体，能够有效避免植物或中药提取物中所含的其他众多化合物群的干扰。此外，本发明方法不仅适用于含柚皮苷供试品的检测分析，还可实现快速、大量制备柚皮苷对映异构体单体，所获得的单体纯度较高，且该方法有机溶剂消耗量少，易于回收、更加环保。

附图说明

图1为实施例1所得sfc谱图；

图2为实施例2所得sfc谱图；

图3为实施例3所得sfc谱图；

图4为实施例4所得sfc图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：取柚皮苷加甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤选用的分析型超临界色谱仪为watersacquityupc²系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，色谱柱规格为4.6mm×150mm×3μm，流动相a为超临界co2、流动相b为乙醇，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温40℃；背压2000psi；检测波长283nm；流速为2ml/min；采用的洗脱方式为：0～20min内，a由90％变化为40％；进样体积为5μl。

结果请参见图1。根据图1可知，两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为2.37。

实施例2

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：采用常规的提取方法，从枳实中提取含有柚皮苷对映异构体的提取物；取该枳实提取物加甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤选用的分析型超临界色谱仪为watersacquityupc²系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填充为直链淀粉-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)，色谱柱规格为4.6mm×150mm×3μm，流动相a为超临界co2、流动相b为0.2％甲酸-乙腈溶液，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温48℃；背压1600psi；检测波长283nm；流速为3ml/min；采用的洗脱方式为：0～30min内，a由100％变化至40％；进样体积为5μl。

结果请参见图2。根据图2可知，两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为2.21，不受提取物中其他成分的干扰。

实施例3

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：采用常规的提取方法，从化橘红中提取含有柚皮苷对映异构体的提取物；取该化橘红提取物加乙醇溶解，滤过，取续滤液即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤选用的分析型超临界色谱仪为watersacquityupc²系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填充为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，色谱柱规格为4.6mm×150mm×5μm，流动相a为超临界co2、流动相b为0.2％甲酸-甲醇，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温35℃；背压2100psi；检测波长283nm；流速为1.5ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～8min，a由80％变化到50％，8～15min，a维持在50％，15～20min，a由50％变化至40％；进样体积为5μl。

结果请参见图3。根据图3可知，两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为2.69，不受提取物中其他成分的干扰。

实施例4

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：采用常规的提取方法，从柚中提取含有柚皮苷对映异构体的提取物，经分离纯化得到纯度约为80％的柚皮苷提取物；取该柚皮苷提取物加乙醇溶解，滤过，取续滤液即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤采用制备型超临界色谱法，选用的制备型超临界色谱仪为watersinvestigatorsfc系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填料为纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，色谱柱规格为10mm×250mm×5μm，流动相a为超临界co2、流动相b为甲醇，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温35℃；背压2100psi；检测波长283nm；流速为10ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～15min，a由80％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％；进样体积为50μl。

结果请参见图4。根据图4可知，两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为2.54，不受提取物中其他成分的干扰。根据出峰的先后顺序，依次为柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ，分别收集两流份，回收溶剂至干，得到纯度分别为99.2％和99.4％的的光学纯柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ。

实施例5

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：采用常规的提取方法，从骨补碎中提取含有柚皮苷对映异构体的提取物；取该骨碎补提取物加乙醇溶解，滤过，取续滤液即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤采用制备型超临界色谱法，选用的制备型超临界色谱仪为watersprep100qsfc系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填充为直链淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯，色谱柱规格为20mm×250mm×5μm，流动相a为超临界co2、流动相b为乙醇，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温45℃；背压2600psi；检测波长283nm；流速为80ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～15min，a由80％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％；进样体积为200μl。

结果两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为1.73，不受提取物中其他成分的干扰。根据出峰的先后顺序，依次为柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ，分别收集两流份，回收溶剂至干，得到纯度分别为99.1％和99.2％的的光学纯柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ。

实施例6

本实施例提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：

(1)制备供试品溶液：取市售柚皮苷提取物加乙醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

(2)以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相a、有机溶剂为流动相b，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。

该步骤选用的制备型超临界色谱仪为watersprep350qsfc系统，多糖衍生物类手性色谱柱的填充为直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)，色谱柱规格为50mm×250mm×10μm，流动相a为超临界co2、流动相b为乙醇，多糖衍生物类手性色谱柱的柱温45℃；背压2000psi；检测波长283nm；流速为250ml/min；采用的洗脱方式为：0～2min，a由90％变化至80％，2～15min，a由80％变化至50％，15～20min，a由50％变化至40％；进样体积为1ml。

结果两个柚皮苷对映异构体色谱峰可实现有效分离，分离度为1.94，不受提取物中其他成分的干扰。根据出峰的先后顺序，依次为柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ，分别收集两流份，回收溶剂至干，得到纯度分别为99.3％和99.5％的的光学纯柚皮苷ⅰ和柚皮苷ⅱ。

对比例1

本对比例是实施例2的对比例，与实施例2相比的差别主要是色谱条件不同，本对比例采用的色谱条件为：

所述的多糖衍生物类手性色谱柱的柱温为28℃，背压为3500psi，检测波长283nm，采用的洗脱方式为：流动相a的初始比例为70％，于35min内变化至30％。

结果：采用本对比例构建的分离方法进行检测时，不能很好的屏蔽掉提取物中其他化合物的干扰从而很好的分离柚皮苷对映异构体。

本发明方法所述的制备供试品溶液，具体是指将含柚皮苷的供试品加有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂溶解。其中，所述含柚皮苷的供试品可以是采用常规提取方法从植物或中药原料中提取出来的含柚皮苷的提取物，也可以是提取物经过分离提纯后得到的柚皮苷提取物，还可以是柚皮苷纯品(纯品，例如市购分析纯品、优质纯品等等)，以上供试品可以通过制备获得，也可直接购买得到；所述有机溶剂为常用有机溶剂，优选甲醇、乙醇。

色谱条件筛选实验：

(1)色谱柱的选择：发明人通过对柚皮苷结构、性质的分析，以及结合实验筛选发现多糖衍生物类手性色谱柱比较适合用于柚皮苷对映异构体的分离，包括以直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯、直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填料的多糖衍生物类手性色谱柱都可以将柚皮苷对映异构体分离，尤其是以纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填料的多糖衍生物类手性色谱柱，可以将柚皮苷对映异构体完全分离，分离度高于2.0，且峰形较好。此外，发明人还开展了本发明方法的耐用性及放量制备研究，考察了不同仪器、不同规格的分析柱、半制备柱及制备柱的分离效果，结果显示都可以很好地实现柚皮苷对映异构体分离。

(2)流动相的选择：超临界色谱法的流动相由超临界流体(流动相a)与有机溶剂(流动相b)组成，本发明方法中超临界流体选择常用的超临界co2；有机溶剂则考察了甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的至少一种对分离的影响，而且还考察了在这些混合溶剂中添加少量的酸是否能提高分离度或改善峰形，结果表明使用不同有机溶剂体系，在本发明方法限定的范围内，都可实现柚皮苷对映异构体的分离，只是峰形、分离度和出峰时间有所差异，综合分离度、峰形、出峰时间以及操作简便性等多种因素考虑，优选甲醇或0.2％甲酸-甲醇溶液。

(3)柱温的选择：实验中考察了30℃、33℃、35℃、40℃、45℃、48℃、50℃等不同柱温条件下，柚皮苷对映异构体的分离情况，结果表明，30～50℃的柱温范围内都能实现柚皮苷对映异构体的分离，优选35℃。

(4)背压的选择：实验中考察了1500psi、2000psi、2100psi、2500psi、3000psi、3500psi等不同背压条件下，柚皮苷对映异构体的分离情况，结果表明，在1500～3000psi范围内都可实现柚皮苷对映异构体的分离，优选2100psi。

(5)超临界流体色谱仪和流速的选择：对样品进行检测分析时，选择分析型超临界流体色谱仪，流速优选1～5ml/min；当需要放量制备光学纯的柚皮苷对映异构体时，则需选择相应量级的制备型超临界流体色谱仪，并提高流速至5～300ml/min。

(6)检测波长的选择：选择柚皮苷的最大吸收波长283nm作为本发明所述分离方法的检测波长。

根据出峰的先后顺序，分别收集两流份，回收溶剂至干，得到两个光学纯的柚皮苷对映异构体单体，所述的回收溶剂，可采用本领域任何常用方法完成。将分离得到的两个柚皮苷对映异构体单体分别制成溶液，按照本发明分离方法进行测定，采用峰面积归一化法计算化学纯度，两单体的纯度均达99.0％以上。

整体上来讲，本发明的方法不仅操作简便、快速、高效、经济和环保的优点，能够简单快速地分析及制备柚皮苷的两种光学纯异构体(纯度可达99.0％以上)，对含柚皮苷药物的质量控制、药效评价，以及进一步开发柚皮苷的医药用途具有十分重要的现实意义。特别是，本发明首次将超临界色谱技术应用到柚皮苷对映异构体的分离中来，特别是通过采用合适的超临界色谱条件构建柚皮苷对映异构体分离方法，该分离方法具有普适性，用其进行柚皮苷对映异构体分离时，供试品溶液不限于柚皮苷纯品制备的溶液，还能够适用于从植物或中药提取物(例如柑、橘、橙、柚、柠檬、化橘红、橘红、橘核、橘络、橘叶、青皮、陈皮、枳实、枳壳、酸枣仁、香橼、佛手、骨碎补等植物或中药原料中提取出来的含有柚皮苷的提取物)中很好的分离柚皮苷对映异构体，能够有效避免植物或中药提取物中所含的其他众多化合物群的干扰。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。