一种白光实时细胞体积精密测量仪的制作方法

本发明涉及精密检测技术领域，尤其涉及一种白光实时细胞体积精密测量仪。

背景技术：

最早实现透明细胞观察的是因为发明相衬成像技术而获得诺贝尔奖的泽尼克教授。90年代以来典型的以细胞为对象的检测仪器为流式细胞仪。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标。2000年以来随着定量位相成像技术的发展，出现了各种各样的以透明细胞为研究对象的光学系统。由光路结构上来看定量位相成像技术有共路和双光路两种形式，又由使用的光源来看有使用激光的和使用白光的定量位相成像技术。相比之下，共路型系统的抗振能力优于双光路型的系统。使用激光的系统由于散斑现象的存在使得成像效果落后于使用白光的系统。对于细胞的观察，由于荧光技术的使用在横向上已经获得了超越衍射极限的成就。但是细胞在观察前必需染色，它破坏了细胞的自然生命规律影响了细胞的生命活动。因此研究一种无染色的光学精密检测技术是有现实意义的。而定量位相成像技术在纵向上可提供超高分辨率的一种技术，其纵向光程精度可达0.1nm，而且它是一种无需染色的光学检测技术。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种实时精密检测细胞的表面精细轮廓或细胞的体积的白光实时细胞体积检测仪。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种白光实时细胞体积精密测量仪，其包括分光棱镜以及设置于分光棱镜上下方的显微镜光路和设置于分光棱镜一侧的成像光路，所述显微镜光路由上至下依次包括光学照明系统、孔径光阑、第一望远透镜对、聚光镜、载物台、物镜和分光棱镜，所述孔径光阑上设有随机分布的阵列针孔，所述成像光路由外至内依次包括ccd、傅里叶变换镜头、纯位相液晶光阀、第三望远透镜对，共轭光栅和第二望远透镜对，所述显微镜光路的光轴与分光棱镜垂直，所述成像光路的光轴与显微镜光路的光轴垂直，且显微镜光路的光轴与成像光路的光轴的交点在分光棱镜的分光面上。

进一步的，所述光学照明系统包括依次设置的三色led灯、起偏片和磨砂片。

进一步的，所述孔径光阑通过第一望远透镜对与聚光镜的后焦面共轭。

进一步的，所述孔径光阑上的随机阵列针孔与纯位相液晶光阀上显示纯位相光栅共轭。

进一步的，所述望远透镜对和之间还设置有视野光阑。

进一步的，所述载物台设置于六维调整台上。

进一步的，所述物镜为10x、20x或40x的低放大倍数数值孔径在0.3-0.85之间的无限远平场复消色差物镜。

进一步的，所述分光棱镜为直角宽带分光棱镜。

进一步的，所述液晶光阀为纯位相电寻址pal型液晶光阀，所述液晶光阀连接于电脑，由电脑控制其显示内容。

进一步的，所述显微镜光路还包括设置在分光棱镜下方的明场观察辅助光路，所述明场观察辅助光路从上到下依次包括成像透镜和ccd。

本发明采用以上技术方案，采用透射式显微镜光路系统，对孔径光阑上随机分布的阵列针孔在液晶面的共轭像，利用纯位相光栅衍射分光可得到自干涉的直射光和散射光。这种共路自干涉的结构相比于现有的定量位相成像技术而言具有更好的抗震抗干扰性能；相比于现有相衬技术中的环孔式孔径光阑，本发明的随机阵列针孔破坏原来环孔式孔径光阑对应的环孔式相位板的对称性，改善表面轮廓梯度较大的局部区域的成像的边晕效应，较好的保持像的空间频率分布与物的空间频率分布之间的一致性；在纯位相液晶光阀面上显示数字二元位相光栅和闪耀光栅，可通过改变液晶光阀的电压来调节数字二元位相光栅的高低位相差和闪耀光栅的闪耀角，依据实际情况对直射光和散射光的强度做适应性调整，从而调整图像的对比度，以提高分辨精度；纯位相液晶光阀离轴使用，具有更准确的光波前表达能力；由于离轴使用液晶光阀带来的色差由液晶光阀前方所设置的共轭光栅消除；本发明的静态观察样本的相位求解使用stoilov算法，通过调节液晶光阀可将直射光和散射光的相位差分别设为-π/2、0、π/2、π、3π/2，只需五次成像即可算出细胞的表面精细轮廓或细胞的体积，后期图像处理也只需简单的数学计算和位相解包裹运算；本发明的动态实时观察样本的相位求解需利用彩色ccd一次成像，获得rgb三种颜色即三个不同中心波长的不同位相偏差的图片，图片上每个点都对应得到三个方程，而每个方程中刚好有三个未知数即背景光强度，调制度和位相差，因此该方法可用于实时动态求解细胞的表面精细轮廓或细胞的体积。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

图1为本发明白光实时细胞体积精密测量仪的系统结构示意图；

图2为孔径光阑的阵列针孔的结构示意图；

图3为纯位相液晶光阀上显示的位相灰度图；

图4为数字二元位相光栅的剖面图；

图5为闪耀光栅的剖面图。

具体实施方式

如附图1所示，本发明包括分光棱镜112以及设置于分光棱镜112上下方的显微镜光路和一侧的成像光路；所述显微镜光路由上至下依次包括具有三色led灯101的科勒照明系统光源、孔径光阑105、第一望远透镜对106、108、聚光镜109、载物台110和物镜111及分光棱镜112，所述孔径光阑105上设有随机分布的阵列针孔；所述成像光路由外至内依次包括ccd125、傅里叶变换镜头124、纯位相液晶光阀122、第三望远透镜对119、121、共轭光栅117和检偏片118以及第二望远透镜对115、116，所述显微镜光路的光轴与分光棱镜112垂直，所述成像光路的光轴与显微镜光路的光轴垂直，且显微镜光路的光轴与成像光路的光轴的交点在分光棱镜112的分光面上。

本发明采用透射式显微镜光路系统，对孔径光阑上随机分布的阵列针孔在液晶面的共轭像，利用纯位相光栅衍射分光可得到自干涉的直射光和散射光。这种共路自干涉的结构相比于其它技术而言具有更好的抗震抗干扰性能；相比于现有相衬技术中的环孔式孔径光阑，本发明的阵列针孔式的孔径光阑还可以改善表面轮廓梯度较大的局部区域的成像的边晕效应；在纯位相液晶光阀面上显示数字二元位相光栅和闪耀光栅，可通过改变液晶光阀的电压来调节数字二元位相光栅的高低位相差和闪耀光栅的闪耀角，依据实际情况对直射光和散射光的强度做适应性调整，从而调整图像的对比度，以提高分辨精度；本发明的纯位相液晶光阀的离轴使用使得波前表达更加准确，进入ccd的光不混有杂光；由此在ccd面上产生的色差由设置的共轭光栅加以消除；本发明的静态观察样本的相位求解使用stoilov算法，通过调节液晶光阀可将直射光和散射光的相位差分别设为-π/2、0、π/2、π、3π/2，只需五次成像即可算出细胞的表面精细轮廓或细胞的体积，后期图像处理也只需简单的数学计算和位相解包裹运算；本发明的动态实时观察样本的相位求解需利用彩色ccd一次成像，获得rgb三种颜色即三个不同中心波长的不同位相偏差的图片，图片上每个点都对应得到三个方程，而每个方程中刚好有三个未知数即背景光强度，调制度和位相差，因此该方法可用于实时动态求解细胞的表面精细轮廓或细胞的体积。

进一步的，所述光学照明系统包括依次设置的三色led灯101、起偏片102和磨砂片103。

由上述描述可知，在卤素灯灯丝的前面设置磨砂片可使光场空间相干性减弱且三色光混合光强分布均匀，从而形成白光；磨砂片前叠放起偏片，使入射样本的光为p偏光。

进一步的，所述孔径光阑105通过第一望远透镜对106、108与聚光镜109的后焦面共轭，保证系统的照明方式为科勒照明。

进一步的，孔径光阑105上配有随机阵列针孔，针孔的位置随机，针孔的大小一定。

进一步的，孔径光阑105上配有的随机阵列针孔与纯位相液晶光阀122上显示纯位相光栅共轭。

进一步的，所述第一望远透镜对106、108之间还设置有视野光阑107。

由上述描述可知，通过调整所述视野光阑可调整整个仪器的视野大小。

进一步的，所述载物台110设置于六维调整台上。

由上述描述可知，在拍摄成像前，将样本放置于载物台上，六维调整台可调整样本检测区域对焦、与光轴垂直或不倾斜。

进一步的，所述载物台110的共轭位置视野光阑107位置上可设置分划板，该分划板与分划板120共轭。

由上述描述可知，所述分划板尤其可用于透明薄样本观察的初步对焦。

进一步的，所述物镜111为10x、20x、40x的低放大倍数数值孔径在0.3-0.85之间的无限远平场复消色差物镜，保证较好的干涉成像效果。

进一步的，所述成像光路设置于所述分光棱镜112的左侧。

进一步的，所述分光棱镜112为直角宽带分光棱镜，不影响直射光和散射光之间的位相差。

进一步的，再通过第二望远透镜对115、116左侧的检偏片118，使得进入液晶光阀的光完全能被液晶光阀调制即仍是p偏光，以消除成像中的杂光。

进一步的，再通过检偏片118左侧的共轭光栅117，消除液晶光阀122离轴使用带来的色差。

进一步的，所述液晶光阀122为纯位相电寻址pal型液晶光阀，所述液晶光阀122连接于电脑123，由电脑123控制其显示内容。

进一步的，成像透镜113与ccd114构成明场观察辅助光路，显微镜可配置荧光光源光路，则该成像光路也可做为染色细胞的荧光成像光路。

请参照图1，本发明的实施例一为：一种白光实时细胞体积精密测量仪，包括分光棱镜112、显微镜光路和成像光路，所述显微镜光路设置于竖直方向，所述成像光路居于显微镜的左侧，所述显微镜光路的光轴与成像光路的光轴垂直，所述显微镜光路的光轴与成像光路的光轴垂直相交于分光棱镜112上。

所述显微镜光路由上至下依次包括具有三色led灯101的科勒照明系统光源、集光镜104、孔径光阑105、望远透镜106、视野光阑107、望远透镜108、聚光镜109和载物台110、物镜111、分光棱镜112、成像透镜113与ccd114。所述三色led灯灯丝101其亮度由电压可调控制，所述磨砂片102使光场空间相干性减弱且光强分布均匀且输出白光。所述磨砂片前叠放起偏片103，使入射样本的光为p偏光。所述集光镜104可为三片式集光镜。

如图2所示，所述孔径光阑105上设有随机分布的阵列针孔，孔径光阑105位于所述集光镜104的后焦面上，所述孔径光阑105与聚光镜109的后焦面共轭，保证系统的照明方式为科勒照明，所述孔径光阑105设为可选择片状插入式，片上的针孔位置随机设置，每个孔的大小相同，孔的数目即光阑的面积依物镜的不同而不同，物镜的数值孔径越大，孔的数目越少。所述望远透镜115和望远透镜116构成4f系；所述望远透镜119和望远透镜121也构成4f系，镜片可为双胶合消色差镜片。所述共轭光栅117由望远透镜119与121构成的4f系共轭成像后重合，以消除slm122离轴使用产生的色差。所述共轭光栅117上显示的闪耀光栅slm122上显示的闪耀光栅的周期相同，高度相同，但光栅倾斜角互为相反数。所述视野光阑120设置于所述望远透镜121的前焦面上，用于调整系统的视野大小，同时控制进入ccd125的光的范围，以消除1级衍射光外的其它级次的光。所述分光棱镜112选用直角宽带分光棱镜，能够把光分为相垂直的两束且不影响反射光中的直射光和散射光的相位差。所述物镜111可选择10x，20x,40x的低放大倍数，数值孔径在0.3-0.85之间的无限远平场复消色差物镜。所述液晶光阀122为纯位相液晶光阀。所述液晶光阀122连接于电脑123，由电脑123控制其显示内容。

如图3所示，孔径光阑105的阵列针孔会在液晶光阀122面即傅里叶面上成相应的共轭像，其中阵列针孔的共轭像即直射光的位置使用数字二元位相光栅衍射分光，数字二元位相光栅上的灰度可变以适应性调节一次光方向上的直射光光强；阵列针孔的共轭像的周围即散射光的位置使用闪耀光栅衍射分光，闪耀光栅相比数字二元位相光栅具有更高的衍射效率，可以提高ccd面上相对直射光较弱的散射光光强。阵列针孔在液晶光阀122上的像的大小可取40个左右像素为宜，由系统的放大倍数可确定针孔的具体大小。通过这样的光栅使用方式不仅可以获得相位差不同的直射光和散射光，更重要的是可以适应性调整参与成像的直射光与散射光的比例，使自干涉取得最好的对比度。

如图4所示为数字二元位相光栅的水平方向的剖面图，该光栅位于阵列针孔的共轭像位置上，它可以衍射一定量的直射光到一次光的位置上，与散射光相干涉成像。通过改变光栅的高低位相差可以调节直射光的衍射效率，变化范围由0到40%。

如图5所示为闪耀光栅的水平方向的剖面图，阵列针孔周围区域即散射光区域使用闪耀光栅，利用闪耀光栅的高衍射效率可提高通常较弱的参与成像的散射光光强。在不改变光栅周期的前提下，通过改变闪耀角度可以灵活调节衍射效率，变化范围为0到80%。通过灵活调节ccd125面上直射光和散射光的强度，提高了干涉成像的对比度。具体成像时可先将图4的a值设为π/2，这样直射光与散射光之间就有π/2的相位差，通过调节闪耀光栅的闪耀角度和数字二元位相光栅的高低位相差，调整好图像的对比度，拍摄一张图像；然后将附图4的a值改为-π/2，0，π，3π/2并保持图4的高低相位差获得另外四张图像。此外，可使用光谱仪测量到达ccd前的三色led灯的光谱，乘以彩色ccd的rgb三个滤光片的光谱透过率曲线，获得参与干涉成像的白光即三色混合光的光谱与rgb三色的各自的光谱。将获得的五张图像结合光谱的自相关函数利用stoilov算法即可进行静态样本如贴壁细胞的体积计算；利用rgb三色的光谱结合彩色ccd一次成像获得的rgb三张干涉图也可以进行动态细胞的实时体积计算。

综上所述，本发明提供的白光自干涉表面检测仪具有更好的抗震抗干扰性能，阵列针孔还可以改善表面轮廓梯度较大的局部区域的成像的边晕效应；只需五次成像即可计算出细胞的体积。纯位相液晶光阀122及纯位相光栅的灵活使用使得最后的成像结果上直射光和散射光的强度可以依据实际情况做适应性调制，从而提高了成像效果和垂直方向分辨率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。