一种区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞的方法与流程

本发明总体上涉及生命科学领域，具体涉及一种区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞的方法，其中使用了标志物cd105。
背景技术：
：rpe是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，例如吞噬消化脱落的光感受器细胞的外节(os)、促进视循环中重要的介质11-顺式视黄醛的再生、调节眼内的免疫反应、参与形成视网膜-血管屏障等。rpe细胞的这一生理功能的异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，例如rpe细胞屏障功能异常则易导致best卵黄样黄斑营养不良(bestvitelliformmaculardystrophy，bvmd)和成人卵黄样黄斑营养不良(adult-onsetvitelliformmaculardystrophy，avmd)。rpe基底膜与bruch’smembrane之间的连接或功能异常被认为与年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)和sorsby’s眼底营养不良的发生相关。原代培养出的成纤维细胞呈短梭形、多角形或不规则形；体外培养连续多次传代后获得形态较均一的成纤维细胞，以梭形为主，细胞呈放射状排列。流式细胞仪检测该细胞高表达cd105、cd73、cd90、cd44等间充质干细胞表面标志，不表达cd34、cd45、cd19、cd11b、hla-dr等造血干细胞表面标志。目前，在一种人源视网膜色素上皮细胞的分离培养方法中，通过显微操作得到rpe细胞，易造成眼睛来源的成纤维细胞污染，目前尚无一种快速区分的检测方法，限制了该方法在临床上的广泛应用。本发明的目的在于克服上述不足之处，提供了一种快速、简便地鉴定rpe和眼睛来源的成纤维细胞污染的方法，为体外培养的rpe纯度与均一性鉴定提供了新方法。技术实现要素：本发明的一个方面，提供了cd105在制备用于区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞的组合物或试剂盒中的应用。在本发明的一个实施例中，在所述cd105在制备用于区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞的组合物或试剂盒中的应用中，通过生物检测方法分析待测样品细胞膜上cd105的表达率，以区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞。在本发明的一个实施例中，所述的待测样品为混有或可能混有眼睛来源的成纤维细胞的rpe细胞。在本发明中，视网膜色素上皮细胞优选为人源视网膜色素上皮细胞。在本发明的一个实施例中，混有眼睛来源的成纤维细胞占总细胞量的比例为0-100％，优选2％-10％，更优选为2％-5％。其中，混有眼睛来源的成纤维细胞占总细胞量的比例最优选为0-2％。在本发明的一个具体实施例中，所述生物检测方法为流式细胞术、或免疫印迹、或免疫组化、或其他能够用于检测细胞膜表面蛋白的检测方法。在本发明的一个具体实施例中，在所述流式细胞术检测中使用cd105抗体分析待测样品细胞膜上cd105的表达率。在本发明的一个具体实施例中，所述cd105抗体上可直接或间接结合有藻红蛋白(pe)、异硫氰酸荧光素(fitc)等荧光素。在本发明的一个具体实施例中，所述cd105抗体为结合藻红蛋白(pe)或结合异硫氰酸荧光素(fitc)的抗cd105抗体。在本发明的一个具体实施例中，所述cd105抗体为结合藻红蛋白(pe)或结合异硫氰酸荧光素(fitc)的小鼠抗人cd105单克隆抗体。本发明还提供了cd105在制备用于区分成纤维细胞和其他细胞的组合物或试剂盒中的应用。其中，所述的其他细胞包括在体外培养过程中易混入成纤维细胞污染的细胞。本发明的另一个方面，提供了一种区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞的方法，其中，使用cd105抗体标记待测样品，通过生物检测方法分析待测样品细胞膜上cd105的表达率，以区分视网膜色素上皮细胞和眼睛来源的成纤维细胞。在本发明的一个实施例中，所述的待测样品为混有或可能混有眼睛来源的成纤维细胞的rpe细胞。在本发明中，视网膜色素上皮细胞优选为人类视网膜色素上皮细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述生物检测方法为流式细胞术。在本发明的一个具体实施例中，所述cd105抗体为结合藻红蛋白(pe)或结合异硫氰酸荧光素(fitc)的抗cd105抗体。在本发明的一个具体实施例中，所述cd105抗体为结合藻红蛋白(pe)或结合异硫氰酸荧光素(fitc)的小鼠抗人cd105单克隆抗体。附图说明图1示出检测混有0.5％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图2示出检测混有1％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图3示出检测混有2％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图4示出检测混有5％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图5示出检测混有10％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图6示出不含成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达流式图。图7示出成纤维细胞的cd105表达流式图。图8示出使用不同cd105抗体检测成纤维细胞的cd105表达流式图。图9示出成纤维细胞的cd73及cd90表达流式图。图10示出一批培养了10天的rpe细胞的cd73及cd90表达流式图。图11示出另一批培养了29天的rpe细胞的cd73及cd90表达流式图。具体实施方式实施例通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。实施例1：检测含有不同含量的成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达本发明所用的主要试剂及仪器如表1所示。表1实验中的主要试剂及仪器仪器/试剂产地流式细胞仪facscaliber美国bd公司cd105抗体美国bd公司pe-小鼠igg1美国r&d公司磷酸缓冲盐溶液(pbs)美国gibco公司70μm细胞滤筛美国bd公司按照以下步骤检测不同含量的成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达：(1)将含有0.5％的成纤维细胞的rpe细胞计数后分别取3×105细胞至3个15ml离心管中，分别标记为blank、isotype、cd105，放入离心机内室温400g离心5分钟，弃上清；(2)blank管中加入400μl磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬待测；(3)isotype、cd105管中分别加入50μlpbs重悬细胞，再分别加入3μlpe-小鼠igg1抗体和2μlcd105抗体，2-8℃避光孵育1小时；(4)抗体孵育结束后加入1mlpbs重悬，室温400g离心5分钟，弃上清；(5)加入1mlpbs重悬，室温400g离心5分钟，弃上清；(6)加入400μlpbs重悬细胞待测，若细胞有结团现象，将细胞经过70μm细胞滤筛过滤；(7)使用流式细胞仪检测样品中表达cd105分子的细胞比例。同理，按照以上步骤检测含有1％、2％、5％及10％成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达。如图1至图5所示，cd105表达与成纤维细胞比例存在良好的正相关性，准确度较高，即在含有0.5％成纤维细胞的rpe细胞中检测到0.54％的表达量(图1)；在含有1％成纤维细胞的rpe细胞中检测到0.962％的表达量(图2)；在含有2％成纤维细胞的rpe细胞中检测到2.15％的表达量(图3)；在含有5％成纤维细胞的rpe细胞中检测到5.45％的表达量(图4)；在含有10％成纤维细胞的rpe细胞中检测到10.6％的表达量(图5)。说明该方法在少量混有成纤维细胞的rpe细胞中检测或鉴定成纤维细胞含量中，具有更好的准确性。实施例2：检测不含成纤维细胞的rpe细胞的cd105表达本发明所用的主要试剂及仪器如表1所示。取不含成纤维细胞的rpe，检测其cd105表达。实验步骤与实施例1中的实验步骤相同。检测结果显示cd105表达较低，具体如图6所示。在不含成纤维细胞的rpe的检测中，仅有0.115％的表达量。可见，rpe细胞表面cd105表达量非常低甚至不表达，这正是能够准确区分人类视网膜色素上皮细胞(rpe)和眼睛来源的成纤维细胞污染的根本原因，该现象是本发明中首次发现。实施例3：检测成纤维细胞的cd105表达本发明所用的主要试剂及仪器如表1所示。取成纤维细胞，检测其cd105表达。实验步骤与实施例1中的实验步骤相同。检测结果显示cd105表达较高，具体如图7所示。在成纤维细胞的检测中，有99.7％的表达量。可见，cd105是成纤维细胞特异性较好的标记物。实施例4：cd105-fitc抗体及cd105-pe抗体检测其cd105表达取成纤维细胞，分别使用cd105-fitc抗体及cd105-pe抗体检测其cd105表达。检测结果显示使用cd105-pe抗体检测的表达量(99.7％)更高，cd105-pe抗体检测的表达量为91.7％，说明cd105-pe抗体效果更优，具体如图8所示。实施例5：检测成纤维细胞及rpe细胞的cd73和cd90表达本发明所用的主要试剂及仪器如表2所示。表2实验中的主要试剂及仪器仪器/试剂产地流式细胞仪facscaliber美国bd公司cd73抗体美国bd公司cd90抗体美国bd公司pe-小鼠igg1美国r&d公司磷酸缓冲盐溶液(pbs)美国gibco公司70μm细胞滤筛美国bd公司按照以下步骤检测成纤维细胞的cd73、cd90表达：(1)将成纤维细胞计数后分别取3×105细胞至4个15ml离心管中，分别标记为blank、isotype、cd73、cd90，放入离心机内室温400g离心5分钟，弃上清；(2)blank管中加入400μl磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬待测；(3)isotype、cd73、cd90管中分别加入50μlpbs重悬细胞，再分别加入3μlpe-小鼠igg1抗体，20μlcd73抗体和5μlcd90抗体，2-8℃避光孵育1小时；(4)抗体孵育结束后加入1mlpbs重悬，室温400g离心5分钟，弃上清；(5)加入1mlpbs重悬，室温400g离心5分钟，弃上清；(6)加入400μlpbs重悬细胞待测，若细胞有结团现象，将细胞经过70μm细胞滤筛过滤；(7)使用流式细胞仪检测样品中表达cd73及cd90分子的细胞比例。同理，按照以上步骤检测培养了10天、29天的rpe细胞的cd73及cd90表达。如图7至图9所示，在成纤维细胞的检测中，cd73有98.9％的表达量，cd90有95.8％的表达量(图9)；在培养了10天的rpe细胞的检测中，cd73有98.0％的表达量，cd90有87.0％的表达量(图10)；在培养了29天的rpe细胞的检测中，cd73有54.0％的表达量，cd90有34.9％的表达量(图11)。说明cd73和cd90这两个公认的成纤维细胞的标志物，并不能区分成纤维细胞和rpe细胞，而cd105却可以准确地区分纤维细胞和rpe细胞。通过引用并入本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。等效本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。当前第1页12