一种塞来昔布有关杂质的检测方法及其应用与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，具体涉及一种塞来昔布异构体杂质及工艺或降解杂质检测方法及其应用。
背景技术：
：样品名称：塞来昔布英文名：celecoxib化学名：4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1h-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺分子式：c17h14n3f3o2s分子量：381.38cas登录号:169590-42-5结构式：外观：白色结晶性粉末间位异构体杂质(杂质a)：分子式：c17h14n3f3o2s分子量：381.38结构式：环合异构体杂质(杂质b)：分子式：c17h14n3f3o2s分子量：381.38结构式：邻位异构体杂质(杂质c)：分子式：c17h14n3f3o2s分子量：381.38结构式：杂质d：分子式：c15h17n3o2s分子量：303.38结构式：杂质f：分子式：c15h17n3o2s分子量：303.38结构式：杂质g：分子式：c11h9f3o2分子量：230.19结构式：塞来昔布(celecoxib)又名西乐葆，是1,5-二芳基取代吡唑类化合物，化学名为4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1h-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺。塞来昔布是一种非甾体抗炎药，能特异性抑制环氧化酶-2(cox-2)的产生，具有解热、镇痛、抗炎等作用，临床上多用于骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎及肿瘤的治疗。目前，塞来昔布尚未被我国药典收载。美国药典和欧洲药典方法一致，采用封尾的苯基填料色谱柱hplc方法检测，该方法采用柱温60℃、流速1.5ml/min，对色谱柱的损耗较大；另外，在该方法中，杂质g的峰形很差，导致检出灵敏度大幅下降，不能很好地检出杂质g，所以在一定程度上限制了该方法的应用。塞来昔布与其同分异构体杂质区别仅是甲基在苯环上位置不同，差异较小，一般的反相液相色谱法无法分离。本发明提供了一种新的高灵敏度的方法，不仅可以分离检测塞来昔布的3个同分异构体，而且同时能够分离检测杂质d、杂质f和杂质g，对他们进行质量进行监控，方法准确度高，灵敏度高，而且分离度好。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够针对性的、准确性的检测塞来昔布异构体及其杂质，即分离塞来昔布与杂质a、b、c、d、f和g的检测方法。本发明的再一个目的是提供一种塞来昔布有关杂质检测方法的应用。该检测方法采用反相高效液相色谱法，其色谱条件如下：色谱柱：c30硅烷键合全多孔硅胶色谱柱；粒径3～15μm；柱长50～250mm；流动相组成：a:(水相)：b(乙腈)；c(甲醇)；梯度洗脱流动相流速：0.5-1.5ml/min；检测波长：210-280nm；柱温：20-40℃；检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器；所述流动相组成选自乙腈-甲醇-水；乙腈-甲醇-水-三乙胺；乙腈-甲醇-水-磷酸盐；甲醇-水；乙腈-水。进一步优选：色谱柱选自centurysilc30柱；glsciencesinertsilc30柱、welchxb-c30柱和thermoacclaimtmc30柱等。梯度洗脱程序例为：时间/min025303140a/％35-8015-6010-5035-8035-80b/％65-085-090-065-065-0c/％65-085-090-065-065-0所述流动相流速：优选1.0ml/min。所述流动相优选ph值为2.0-8.0；优选4.0-8.0。所述流动相ph值调节剂为磷酸或氨水；优选为磷酸。所述色谱条件中检测波长优选为215nm。所述色谱条件中柱温优选为20-25℃。溶解供试品的溶剂为甲醇、乙腈、流动相，优选为流动相。供试品溶液的浓度为0.2-1.0mg/ml，优选为0.4mg/ml。单针进样量为1-40μl，优选为20μl。通过实验检测，sepaxgp-phenyl柱、welchxtimatetmc18柱、welchpfp柱、shieldrp18柱、kromasilnh2柱等色谱柱都不能实现塞来昔布与间位、邻位异构体及环合异构体很好的分离效果。进一步优选流动相梯度程序初始比例在a＝55-70％(v/v)、b＝0-45％(v/v)、c＝0-45％(v/v)。流动相梯度程序最终比例在a＝25-45％(v/v)、b＝0-75％(v/v)、c＝0-75％(v/v)。本发明提供的一种塞来昔布的异构体杂质及其它杂质的检测方法，实现了塞来昔布与异构体杂质及其它杂质的分离，具有较高的灵敏度和专属性，操作简便，分离度符合药典规定(即分离度大于1.50。分离度为相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。r值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说但r＜1时，两峰有部分重叠；r＝1时，分离度可达98％；当r＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用r＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当r＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。r＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。r≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定r应大于1.5.分离度计算公式：2(tr2-tr1)/(w1+w2))，可用于塞来昔布的质量控制，具有现实意义。附图说明图1为实施例1的色谱图；图2为实施例2的色谱图；图3为实施例3的色谱图；图4为实施例4的色谱图；图5为实施例5的色谱图；图6为实施例6的色谱图；图7为实施例7的色谱图；图8为实施例8的色谱图；图9为实施例9的色谱图；图10为实施例10的色谱图。具体实施方式下面结合具体的实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；sepaxgp-phenyl柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：20mm磷酸二氢钾(ph3.0)，有机相：甲醇，等度洗脱(水相:有机相＝50:50)；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.5ml/min；柱温为60℃。实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。图1表明塞来昔布峰形较差且与杂质a(rt＝31.377min)分离度小于1.5。实施例2仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；welchxtimatetmc18柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：5mg/mlβ-环糊精(ph3.0)，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图2。图2表明杂质a与杂质c(rt＝17.622min)、杂质d与杂质f(rt＝12.701min)分离度小于1.5，塞来昔布与杂质间分离度符合药典规定。实施例3仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；welchpfp柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：10mg/ml羟丙基环糊精，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图3。图3表明杂质a与杂质c(rt＝22.019min)、杂质d与杂质f(rt＝14.625-15.104min)分离度小于1.5，塞来昔布与杂质间分离度符合药典规定。实施例4仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；shieldrp18柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：10mg/ml羟丙基环糊精，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图4。图4表明杂质a与杂质c(rt＝11.765min)、杂质d与杂质f(rt＝8.228min)分离度小于1.5，塞来昔布与杂质间分离度符合药典规定。实施例5仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；centurysilc30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：10mg/mlγ-环糊精，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图5。图5表明杂质a与杂质c(rt＝25.045-25.720min)、杂质d与杂质f(rt＝22.849-23.774min)分离度小于1.5，塞来昔布与杂质间分离度符合药典规定。实施例6仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；centurysilc30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：水，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图6。图6表明塞来昔布与杂质以及杂质与杂质之间分离度均大于1.8，符合药典规定。杂质d(rt＝17.128min)、杂质f(rt＝18.010min)、杂质c(rt＝21.535min)、杂质a(rt＝22.376min)、塞来昔布(rt＝23.227min)、杂质b(rt＝27.244min)。实施例7仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；centurysilc30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：水，有机相：甲醇和乙腈，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图7。图7表明塞来昔布与杂质以及杂质与杂质之间分离度均大于1.9，符合药典规定。色谱峰顺序与实施例6一致。实施例8仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；welchxb-c30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：水，有机相：甲醇，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图8。图8表明塞来昔布与杂质以及杂质与杂质之间分离度均大于1.6，符合药典规定。色谱峰顺序与实施例6一致。实施例9仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；thermoacclaimtmc30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：水，有机相：甲醇和乙腈，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为26℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图9。图9表明塞来昔布与杂质a(rt＝22.623min)、杂质d与杂质f(rt＝15.513-15.799min)分离度均小于1.5。实施例10仪器与检测条件waterse2695高效液相色谱仪；自动进样器；glsciencesinertsilc30柱(5μm，4.6×250mm)；流动相：水相：水，有机相：甲醇和乙腈，梯度洗脱；进样量为20μl；检测波长为215nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。梯度洗脱条件实验步骤取塞来昔布及其杂质适量，用80％甲醇-水溶解并稀释制成每1ml含有塞来昔布0.4mg、杂质4μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液按上述条件进样测定，记录色谱图，结果见图10。图10表明塞来昔布与杂质以及杂质与杂质之间分离度均大于2，符合药典规定。杂质g(rt＝12.131min)，其其它峰顺序与实施例6一致。实施例11根据实施例7条件进行系统适用性试验:分别精密称取塞来昔布供试品、各杂质及中间体各约4mg于10ml容量瓶中,各杂质及中间体加80％甲醇-水溶解并稀释至刻度，备用。塞来昔布供试品先用适量80％甲醇-水溶解，然后加入上述杂质及中间体溶液0.1ml至塞来昔布供试品溶液中，用80％甲醇-水稀释至刻度，所得溶液作为系统适用性溶液。实验方法：将系统适用性溶液连续进样6针，记录色谱图，结果见下表1。表1系统适用性试验结果当前第1页1 2 3