一种对L-四氢叶酸对甲苯磺酸盐（6S）光学纯度的分析检测方法与流程

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(即6s)的光学纯度的分析检测方法。

背景技术：

l-5-甲基四氢叶酸(l-5-mthf)是组织和血液叶酸的主要形式，参与人体内多种重要的生化反应(比如嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成等)。

天然存在的5-mthf仅为l型，合成的光学异构体d型无生物活性，通过肾脏排出体外，对应的l-5-mthf在人体中不需要经过繁琐的酶促步骤，可以直接被人体吸收利用。

因而，在l-5-甲基四氢叶酸及其盐在合成过程中，对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)光学纯度的检测非常重要。在传统方法中，可以通过测定比旋度来定性检测，但结果不够精确，且稀释剂n,n-二甲基甲酰胺吸入及皮肤接触有害。

技术实现要素：

针对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)光学纯度的研究需求，本技术人提供了一种对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐的光学纯度的分析检测方法，本方法具有较高系统适应性，且灵敏度高，检测过程迅速的特点，对l-5-甲基四氢叶酸及其盐在合成过程有重要意义。

本发明的技术方案为：

一种对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)光学纯度的分析检测方法，所述方法是利用结合紫外检测器的高效液相色谱进行的；其中，采用蛋白质键合手性柱；流动相由流动相a和流动相b组成；所述流动相a为有机相与缓冲盐溶液的混合溶液；所述流动相b为水；洗脱方式为将流动相a与流动相b混合后进行等度洗脱。

所述紫外检测器的检测波长为280±2nm。

所述高效液相色谱法的柱温为40～45℃，流速为1.0～1.5ml/min。

所述缓冲盐溶液为磷酸二氢钠盐溶液，其溶液浓度为4.54g/l。所述有机相为乙腈。所述有机相与缓冲盐溶液的体积比为3:97。

有机相与缓冲盐溶液混合后，用浓度为32％的氢氧化钠溶液调节有机相与缓冲盐溶液的混合溶液的ph为6.5～7.0，优选ph为6.8，从而得到流动相a。

所述流动相a与流动相b的体积比为70％～45％。

所述l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐的光学纯度的分析检测方法包括以下步骤：

(1)取l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐，加入稀释剂水及浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液助溶，配制成浓度为0.5mg/ml的供试品溶液；

(2)色谱条件：将有机相与缓冲盐溶液的混合溶液混合，然后用浓度为32％的氢氧化钠溶液调节有机相与缓冲盐溶液的混合溶液的ph为6.5～7.0，得到流动相a；以水为流动相b；流动相a和流动相b的体积比为70％～45％；采用蛋白质键合手性柱，流速为1.0～1.5ml/min，柱温为40～45℃，等度洗脱；

(3)取所述供试品溶液10μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，检测波长为280±2nm，记录色谱图；

(4)计算公式：de＝al-5-甲基四氢叶酸/(al-5-甲基四氢叶酸+ad-5-甲基四氢叶酸)*100％。

所述de为光学纯度，单位为％。

本发明有益的技术效果在于：

在l-5-甲基四氢叶酸钙合成过程中，l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)光学纯度的拆分尤为重要。在检测过程中，传统的方法为通过旋光仪测定比旋度来定性考察，判断是否合格。而本发明利用高效液相色谱法，能对l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)光学纯度进行准确定量，且检测时间较短，利于反应过程的中控检测，具有明显优势。

附图说明

图1为实施例1测试所得高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图，对本发明进行具体描述。

实施例1

(1)取l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)，加入稀释剂水，及适量1mol/l的氢氧化钠助溶，配制成0.5mg/ml的供试品溶液；

(2)色谱条件：将乙腈与磷酸缓冲液按照3:97(v/v)的比例混合，然后用32％氢氧化钠调节ph至6.8，得到所述流动相a，以水为所述流动相b，两者比例为50％(v/v)，采用蛋白质键合手性柱，流速为1.2ml/min，柱温为42℃，等度洗脱；

(3)取所述供试品溶液10μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，检测波长为280nm，记录色谱图，如图1所示。

(4)计算公式：de(光学纯度)(％)＝al-5-甲基四氢叶酸/(al-5-甲基四氢叶酸+ad-5-甲基四氢叶酸)*100％＝318.38/(318.38+430.77)*100％＝42.5％。

实施例2

(1)取l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)，加入稀释剂水，及适量1mol/l的氢氧化钠助溶，配制成0.5mg/ml的供试品溶液；

(2)色谱条件：将乙腈与磷酸缓冲液按照3:97(v/v)的比例混合，然后用32％氢氧化钠调节ph至6.5，得到所述流动相a，以水为所述流动相b，两者比例为45％(v/v)，采用蛋白质键合手性柱，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，等度洗脱；

(3)取所述供试品溶液10μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，检测波长为278nm，记录色谱图。

(4)计算公式：de(％)＝al-5-甲基四氢叶酸/(al-5-甲基四氢叶酸+ad-5-甲基四氢叶酸)*100％计算所得的de值(光学纯度)为40.9％。

实施例3

(1)取l-四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6s)，加入稀释剂水，及适量1mol/l的氢氧化钠助溶，配制成0.5mg/ml的供试品溶液；

(2)色谱条件：将乙腈与磷酸缓冲液按照3:97(v/v)的比例混合，然后用32％氢氧化钠调节ph至7.0，得到所述流动相a，以水为所述流动相b，两者比例为70％(v/v)，采用蛋白质键合手性柱，流速为1.5ml/min，柱温为45℃，等度洗脱；

(3)取所述供试品溶液10μl，按照上述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，检测波长为282nm，记录色谱图。

(4)计算公式：de(％)＝al-5-甲基四氢叶酸/(al-5-甲基四氢叶酸+ad-5-甲基四氢叶酸)*100％计算所得的de值(光学纯度)为41.5％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的变化、修改、替换和变型都应该在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种对L‑四氢叶酸对甲苯磺酸盐(6S)光学纯度的分析检测方法，所述方法是利用结合紫外检测器的高效液相色谱进行的，其中，采用蛋白质键合手性柱；流动相由流动相A和流动相B组成；采用有机相与缓冲盐溶液混合溶液作为所述流动相A；采用水作为所述流动相B；洗脱方式为等度洗脱。利用本发明的该方法可以很好的对L‑四氢叶酸对甲苯磺酸盐光学纯度进行检测，具有较高系统适应性，且灵敏度高，检测过程迅速的特点。

技术研发人员：高友新;黄春;王旭阳;王莉佳;陈宏宇;于庆洋;汤伟彬
受保护的技术使用者：江苏红豆杉药业有限公司
技术研发日：2018.09.19
技术公布日：2019.01.08