新型三磷酸腺苷生物发光测定方法及其用途与流程

本发明涉及一类新型三磷酸腺苷(atp)生物发光测定方法及其在血小板释放atp测定及血小板活化抑制剂高通量筛选中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

atp是一种广泛存在于各种生物细胞中的有机化合物，能够为很多的酶催化反应提供能量，是生命活动必不可少的物质。atp浓度检测被广泛应用于细胞损伤分析和微生物污染分析。在人体和哺乳动物血小板中，含有阿尔法颗粒和致密颗粒，致密颗粒中包含atp和多种促凝物质。当血小板受到凝血酶、胶原、二磷酸腺苷(adp)和血栓烷a2等激动剂刺激，会释放致密颗粒中的atp和其它促凝物质。通过定量检测血小板atp的释放可以监测血小板的活化。

目前用于atp定量检测的方法包括生物发光法、荧光法和比色法等各种方法，其中基于萤火虫荧光素酶催化的生物发光法由于具有高特异性和灵敏度，最常用于atp的定量检测和血小板活化的监测。在镁离子和合适的缓冲液条件下，荧光素酶催化atp和虫荧光素(luciferin，lh2)发生反应生成虫荧光素单磷酸腺苷(luciferin-amp，lh2-amp)，lh2-amp进一步被氧气氧化为氧化虫荧光素(oxyluciferin)，并产生单磷酸腺苷(amp)、二氧化碳、焦磷酸和释放光子。在荧光素酶和虫荧光素过量的条件下，可以通过荧光素酶催化反应定量检测atp的浓度。然而在荧光素酶催化的反应中，会产生脱氢虫荧光素单磷酸腺苷(dehydroluciferyl-amp，l-amp)副产物，l-amp是一种强烈的荧光素酶催化反应的抑制剂，对荧光素酶半数抑制浓度ic50约为6nm(biochembiophresco，1997，237：445-450；febslett，1998，438：190-194；febsj，2005，272：5206-5216)。因此，在atp生物发光测定中，随着atp浓度增高，产生l-amp的速度和量迅速增加，从而对酶反应发挥抑制作用，导致atp定量测定线性不佳。另外，在atp生物发光测定中，由于atp在反应中的消耗，生物发光衰减速度较快，从而导致加入各种试剂的时间误差会严重影响测定的准确性，特别是血小板活化测定中，这种信号衰减使atp定量测定很难用于96孔板或384孔板为基础的血小板活化抑制剂的高通量筛选。

在1958年，有研究者发现辅酶a(coenzymea，coa)能够增强荧光素酶催化的酶反应，并认为辅酶a可能能够与酶反应生成的抑制性产物反应从而减轻抑制性产物对酶反应的抑制(biochimicaetbiophysicaacta，1958，27：519-532)。经过后续的研究，研究者进一步发现辅酶a可以和l-amp反应生成脱氢虫荧光素辅酶a(l-coa)，l-coa是一种很弱的荧光素酶活性抑制剂，其半数抑制浓度ic50约为5μm(febsj，2005，272：5206-5216)。因此，辅酶a加入荧光素酶反应体系中，可以大大减轻抑制性产物l-amp对反应的抑制。在部分商业荧光素酶报告基因表达检测试剂盒中，由于atp和虫荧光素是过量的，而荧光素酶是不足量的，l-amp对荧光素酶催化活性的抑制导致生物发光信号迅速衰减，辅酶a常被添加到反应体系中减慢发光信号衰减，提高荧光素酶报告基因表达检测的准确度。然而，在atp生物发光检测中，由于atp的消耗是信号衰减的主要原因，还没有研究者或商品试剂盒将辅酶a添加到检测体系中，本发明发现将辅酶a添加到atp生物发光检测体系中，可以减轻高浓度atp的生物发光反应产生的抑制性产物对酶反应的抑制，从而改善atp定量检测的线性。

另外在发明人进行血小板释放atp的生物发光检测过程中，偶然发现改良台式液中添加卵清蛋白(ovalbumin，ova)能够显著减缓生物发光信号的衰减。本发明人通过系统研究，发现经过浓度优化的卵清蛋白可以在atp生物发光检测中同时增强荧光素酶催化的生物发光效率和减慢反应速度，从而在不减弱生物发光信号的条件下，显著减慢atp消耗导致的生物发光信号衰减，进而消除试剂加入时间误差导致的atp检测误差，使atp生物发光分析能够用于血小板抑制剂的高通量筛选。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种atp生物发光检测方法，其利用反应体系中添加辅酶a来改善atp定量线性，提高检测的准确度。

本发明另一目的是提供一种atp生物发光检测方法，其利用反应体系中添加卵清蛋白来减慢生物发光信号的衰减，降低试剂加入时间差异带来的测定误差，提高检测的准确度。

本发明又一目的是提供一种atp生物发光检测方法，其利用反应体系中添加辅酶a来改善atp定量线性，同时添加卵清蛋白来减慢生物发光信号的衰减，共同提高检测的准确度。

本发明的再一目的在于提供上述准确灵敏的atp生物发光检测方法在血小板活化检测和血小板活化抑制剂高通量筛选中的应用。

本发明通过n-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸缓冲液(25mmn-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸，5mm硫酸镁，0.1mm乙二胺四乙酸，ph7.8)中进行atp生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mm虫荧光素、1mm二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，证明添加辅酶a到atp生物发光检测体系中至终浓度3.9μm到62.5μm，能够最大程度增强生物发光反应，优选该浓度范围辅酶a显著改善atp生物发光检测定量线性。

本发明通过hank’s平衡盐溶液(137mm氯化钠，5.33mm氯化钾，0.34mm磷酸氢二钠，0.44mm磷酸二氢钾，4.17mm碳酸氢钠，5.56mm葡萄糖，0.41mm硫酸镁，0.49mm氯化镁and1.26mm氯化钙，ph7.3)和改良台式液(137mm氯化钠，2.9mm氯化钾，0.34mm磷酸氢二钠，12mm碳酸氢钠，5mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5mm葡萄糖，1mm氯化镁and1mm氯化钙，ph7.3)中进行atp生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mm虫荧光素、1mm二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，进一步证明添加辅酶a到atp生物发光检测体系中，能够显著改善atp生物发光检测线性。

本发明通过n-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸缓冲液、hank’s平衡盐溶液和改良台式液中进行atp生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mm虫荧光素、1mm二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，证明添加卵清蛋白到atp生物发光检测体系中，至终浓度0.0156％到0.25％，能够在增强生物发光强度的基础上，最大程度上减慢生物发光信号的衰减，优选该浓度范围卵清蛋白用于atp生物发光检测，提高检测准确度。

本发明通过辣根过氧化物酶的化学发光分析，发现卵清蛋白不仅不能减慢辣根过氧化物酶化学发光信号衰减，还会降低化学发光强度，证明卵清蛋白增强荧光素酶催化的生物发光强度具有特异性。

本发明优选在hank’s平衡盐溶液和改良台式液中添加辅酶a和卵清蛋白进行血小板活化刺激和释放atp的生物发光检测，证明本发明提供的atp生物发光检测能够检测血小板的活化。

本发明优选hank’s平衡盐溶液和改良台式液中添加辅酶a和卵清蛋白进行血小板抑制剂对血小板释放atp的抑制作用检测，证明本发明提供的atp生物发光检测能够用于血小板抑制剂的高通量筛选。

附图说明

图1为辅酶a(coa)改善hank’s平衡盐溶液和改良台式液中atp生物发光检测定量线性的示意图。

图2为卵清蛋白(ova)减慢hank’s平衡盐溶液和改良台式液中atp生物发光检测信号衰减的示意图。

图3为卵清蛋白(ova)不能减慢辣根过氧化物酶(hrp)化学发光检测信号衰减的示意图。

图4为反应体系含有优选浓度辅酶a(coa)和卵清蛋白(ova)的atp生物发光检测对血小板活化释放atp检测的示意图。

图5为反应体系含有优选浓度辅酶a(coa)和卵清蛋白(ova)的atp生物发光检测用于血小板活化抑制剂高通量筛选的示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。

实施例1：辅酶a对hank’s平衡盐溶液和改良台式液中atp生物发光检测定量线性的影响

(1)实验材料

试剂：虫荧光素(货号：308290)，购自百灵威科技有限公司；萤火虫荧光素酶(货号：l9420)、辅酶a(货号：c3144)、atp(货号：a26209)，购自sigma-aldrich公司；hank’s平衡盐溶液(货号：14025092)，购自thermofisher公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。

仪器：enspiremultimodeplatereader，购自德国铂金爱尔默公司。

(2)实验方法

配制改良台式液(137mm氯化钠，2.9mm氯化钾，0.34mm磷酸氢二钠，12mm碳酸氢钠，5mm4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5mm葡萄糖，1mm氯化镁and1mm氯化钙，ph7.3)。利用商品化hank’s平衡盐溶液和配制的改良台式液配制0.031μm到1μm浓度atp，取100μl加入到白色96孔板中。然后利用hank’s平衡盐溶液和改良台式液配制辅酶a至浓度60μm，取50μl辅酶a溶液或缓冲液加入到96孔板中。最后加入100μlhank’s平衡盐溶液和改良台式液配制含荧光素酶、虫荧光素和二硫苏糖醇的atp生物发光检测工作液，至荧光素酶、虫荧光素和二硫苏糖醇终浓度分别为1.25μg/ml、0.5mm和1mm。加入atp生物发光检测工作液后第5分钟检测生物发光强度(相对光单位，relativelightunit，rlu)。

(3)实验结果

通过绘制标曲和线性回归分析，发现加入辅酶a能够显著改善atp生物发光检测定量线性(附图1)。

实施例2：卵清蛋白对hank’s平衡盐溶液和改良台式液中atp生物发光检测信号衰减的影响

(1)实验材料

试剂：虫荧光素(货号：308290)，购自百灵威科技有限公司；萤火虫荧光素酶(货号：l9420)、辅酶a(货号：c3144)、atp(货号：a26209)，卵清蛋白(货号：a5503)购自sigma-aldrich公司；hank’s平衡盐溶液(货号：14025092)，购自thermofisher公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。

仪器：enspiremultimodeplatereader，购自德国铂金爱尔默公司。

(2)实验方法

利用商品化hank’s平衡盐溶液和配制的改良台式液配制1μm浓度atp，取100μl加入到白色96孔板中。然后利用hank’s平衡盐溶液和改良台式液配制卵清蛋白至浓度0.2％，取50μl卵清蛋白溶液或缓冲液加入到96孔板中。最后加入100μlhank’s平衡盐溶液和改良台式液配制含荧光素酶、虫荧光素、二硫苏糖醇和辅酶a的atp生物发光检测工作液，至荧光素酶、虫荧光素、二硫苏糖醇和辅酶a终浓度分别为1.25μg/ml、0.5mm、1mm和15μm。加入atp生物发光检测工作液后第0、5、10、20、40、80分钟检测生物发光强度(相对光单位，relativelightunit，rlu)。

(3)实验结果

通过绘制生物发光强度rlu值的时间曲线，发现加入卵清蛋白能够显著减慢atp生物发光检测信号衰减(附图2)。

实施例3：卵清蛋白对辣根过氧化物酶化学发光检测信号衰减的影响

(1)实验材料

试剂：鲁米诺(货号：v900354)、过氧化氢(货号：88597)、4-(咪唑-1-基)苯酚(货号：183725)、辣根过氧化物酶(货号：v900503)、卵清蛋白(货号：a5503)购自sigma-aldrich公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。

仪器：enspiremultimodeplatereader，购自德国铂金爱尔默公司。

(2)实验方法

配制辣根过氧化物酶化学发光检测底物溶液(0.1m三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，1.25mm鲁米诺，3mm过氧化氢，0.5mm4-(咪唑-1-基)苯酚，ph8.6)，取100μl底物溶液到白色96孔板各孔中，然后加入10μl纯水配制的卵清蛋白至卵清蛋白终浓度0.05％，最后再加入10μl磷酸盐甘油溶液配制的辣根过氧化物酶至终浓度0.001u/ml，第0、5、10、20、40、80分钟检测生物发光强度(相对光单位，relativelightunit，rlu)。

(3)实验结果

通过绘制生物发光强度rlu值的时间曲线，发现加入卵清蛋白不能减慢辣根过氧化物酶化学发光检测信号衰减，并且会降低发光信号强度(附图3)。

实施例4：新的atp生物发光检测方法对活化血小板释放atp的测定

(1)实验材料

动物：spraguedawley大鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

试剂：虫荧光素(货号：308290)，购自百灵威科技有限公司；萤火虫荧光素酶(货号：l9420)、辅酶a(货号：c3144)、atp(货号：a26209)，卵清蛋白(货号：a5503)、凝血酶(货号：t6634)，购自sigma-aldrich公司；hank’s平衡盐溶液(货号：14025092)，购自thermofisher公司；i型胶原(货号：ag005k)，购自法国hyphenbiomed公司；前列腺素e1(货号：p129960)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。

仪器：台式离心机，购自eppendorf公司，enspiremultimodeplatereader，购自德国铂金爱尔默公司。

(2)实验方法

利用枸橼酸钠真空采血管从大鼠腹主动脉采集抗凝血，室温200g离心10分钟，收集上层富血小板血浆，然后室温1000g离心5分钟，弃去血浆，加入含枸橼酸钠、葡萄糖、氯化钠和前列腺素e1的血小板清洗液重悬血小板，1000g离心5分钟，弃去上清。利用hank’s平衡盐溶液或改良台式液重悬血小板，调整浓度至2×10⁷个/ml，取100μl血小板悬液加入白色96孔板中；利用hank’s平衡盐溶液或改良台式液配制的凝血酶或胶原，50μl加入96孔板中，至凝血酶和胶原浓度分别为0.1u/ml和20μg/ml，37℃孵育20分钟；最后加入50μlhank’s平衡盐溶液或改良台式液配制的atp生物发光检测工作液，至荧光素酶、虫荧光素、二硫苏糖醇、辅酶a和卵清蛋白终浓度分别为1.25μg/ml、0.5mm、1mm、15μm和0.05％；室温孵育5分钟检测生物发光强度(相对光单位，relativelightunit，rlu)。

(3)实验结果

通过atp生物发光检测标曲分析，发现新型优选的atp生物发光检测方法能够用于检测凝血酶和胶原刺激血小板释放的atp，并且在hank’s平衡盐溶液或改良台式液中具有类似的结果，另外高通量筛选的评价指标z因子(z’)均大于0.5，表明可以该方法可以用于高通量筛选测定(附图4)。

实施例5：ly294002和staurosporine对血小板活化的抑制作用测定

(1)实验材料

动物：spraguedawley大鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

试剂：虫荧光素(货号：308290)，购自百灵威科技有限公司；萤火虫荧光素酶(货号：l9420)、辅酶a(货号：c3144)、atp(货号：a26209)，卵清蛋白(货号：a5503)、凝血酶(货号：t6634)，购自sigma-aldrich公司；hank’s平衡盐溶液(货号：14025092)，购自thermofisher公司；前列腺素e1(货号：p129960)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；化合物ly294002(货号：m1925)和staurosporine(货号：m2066)，购自美国abmole公司；其它化学试剂，购自北京化工厂。

仪器：台式离心机，购自eppendorf公司，enspiremultimodeplatereader，购自德国铂金爱尔默公司。

(2)实验方法

利用枸橼酸钠真空采血管从大鼠腹主动脉采集抗凝血，室温200g离心10分钟，收集上层富血小板血浆，然后室温1000g离心5分钟，弃去血浆，加入含枸橼酸钠、葡萄糖、氯化钠和前列腺素e1的血小板清洗液重悬血小板，1000g离心5分钟，弃去上清。利用hank’s平衡盐溶液或改良台式液重悬血小板，调整浓度至2×10⁷个/ml，取100μl血小板悬液加入白色96孔板中；利用hank’s平衡盐溶液或改良台式液稀释二甲基亚砜配制的ly294002和staurosporine母液至系列浓度，取25μl加入96孔板中，37℃孵育10分钟；利用hank’s平衡盐溶液或改良台式液配制的凝血酶，取25μl加入96孔板中，至凝血酶终浓度为0.1u/ml，37℃孵育20分钟；最后加入50μlhank’s平衡盐溶液或改良台式液配制的atp生物发光检测工作液，至荧光素酶、虫荧光素、二硫苏糖醇、辅酶a和卵清蛋白终浓度分别为1.25μg/ml、0.5mm、1mm、15μm和0.05％；室温孵育5分钟检测生物发光强度(相对光单位，relativelightunit，rlu)，并计算化合物对血小板活化的半数抑制浓度ic50。

(3)实验结果

通过新型atp生物发光测定，发现磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂ly294002和蛋白激酶c抑制剂staurosporine对凝血酶诱导的血小板活化具有显著的抑制作用，并且通过非线性回归分析能够绘制良好的化合物对血小板的抑制曲线，通过化合物在hank’s平衡盐溶液或改良台式液中具有类似的ic50表明新型atp生物发光测定对于血小板释放atp的测定具有极高的准确性，进一步表明该方法可以用于血小板抑制剂的高通量筛选(附图5)。