一种黄柏的鉴定方法及其应用与流程

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种黄柏的鉴定方法及其应用。

背景技术：

黄柏，中药名，为芸香科植物黄皮树phellodendronchinenseschneid.的干燥树皮。始载于《神农本草经》，习称“川黄柏”，主产于四川、贵州、湖北等地。黄柏中的主要活性成分为盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱等生物碱类化合物。黄柏性味苦寒，有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效，作为传统中药在市场流通和临床治疗应用广泛。目前，市场上的黄柏规格、等级划分不清楚，且没有统一标准，大多仍采用产地以及传统的“肉厚色深”等经验进行区分，缺乏现代科学内涵。常出现以伪品关黄柏冒充黄柏流通的现象，为保障临床用药安全、有效带来隐患。因此有必要建立一套科学、合理、可操作性强、实用性好的黄柏质量控制和等级评价方法，为规范中药市场、实现优质优价、保障临床用药提供有力支撑。

中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它是一种建立在中药化学成分系统研究基础上的综合、可量化的鉴定手段，可以有效地体现中药成分的整体性和综合作用，能提供丰富的鉴别信息，较为全面的反映中药及其制剂中所含化学成分的种类和数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。但是指纹图谱研究也存在着诸如基线漂移、色谱峰重叠、背景噪音高、低信号-信噪比等色谱分析常见问题，均在不同程度上限制了指纹图谱在中药质量控制和评价上的应用。化学模式识别通过统计学或数学方法，对化学体系的测定值与体系的状态之间建立联系，可用于解决中药指纹图谱中的常见问题，并可以提供多种分析识别方法，实现相似药材的快速精准分类，在原料产地、真假鉴别、产品质量控制与分析、品质鉴定等方面发挥重要的作用。然而，如果指纹图谱的数据不全面，可导致化学模式识别不准确。

因此，为了更好的对黄柏质量进行控制，保证临床疗效，需建立全面评价黄柏的质量控制方法。

技术实现要素：

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本发明提供了一种黄柏的鉴定方法，通过该方法可以短时间分析处理大量样本，对黄柏及其炮制品、伪品关黄柏有效判别和区分，为黄柏质量控制及等级质量标准的划分提供方法依据；解决了黄柏检测方法无法从整体上检测和控制其质量的问题。

本发明提供了一种黄柏的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：以黄柏制备得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：以溶解有盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、木兰花碱对照品的溶液为对照品溶液；

(3)采用hplc分别测定步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的对照品溶液，并分别得到所述供试品溶液和所述对照品溶液的液相色谱；

(4)将步骤(3)得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到黄柏指纹图谱；

(5)采用层序聚类分析(hierarchicalclusteranalysis，简称hca)、主成分分析(principalcomponentsanalysis，简称pca)、或偏最小二乘分析(partialleastsquares-discriminationanalysis，简称pls-da)处理步骤(4)得到的黄柏指纹图谱数据，从而对黄柏或其炮制品进行分类鉴别。

在本发明的实施方案中，所述黄柏的样品可收集自不同产地的黄柏及其炮制品。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(1)的供试品溶液的制备包括：将黄柏粉碎后过3号药典筛，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入体积分数为70％-100％甲醇水溶液(含0.1体积％盐酸，这里，当体积分数为100％甲醇水溶液时该甲醇水溶液为甲醇)，定容至刻度，称定重量，超声处理30min-50min，冷却至室温，用体积分数为70％-100％甲醇水溶液(含0.1体积％盐酸，这里，当体积分数为100％甲醇水溶液时该甲醇水溶液为甲醇)补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min-6000r/min离心5min-15min，取上清液，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；作为优选方案，所述步骤(1)供试品溶液的制备包括：将黄柏粉碎后过3号药典筛，取黄柏粉末0.2g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入甲醇(含0.1体积％盐酸)，定容至刻度，称定重量，超声处理40min，冷却至室温，用甲醇(含0.1体积％盐酸)补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(2)的对照品溶液的制备包括：精密称取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、木兰花碱对照品，加溶剂制成每1ml含有400μg～600μg盐酸小檗碱、50μg～100μg盐酸黄柏碱、20μg～50μg木兰花碱的对照品溶液。作为优选方案，所述步骤(2)对照品溶液的制备包括：精密称取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、木兰花碱对照品，加甲醇(含0.1体积％盐酸)制成每1ml含有500μg盐酸小檗碱、80μg盐酸黄柏碱、30μg木兰花碱的对照品溶液。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(3)包括设置hplc色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25℃-35℃，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，检测波长250nm-300nm，并开启dad检测；以乙腈为流动相a，以体积分数为0.06％-0.2％磷酸水溶液为流动相b，在体积比为5～100:95～0的范围内梯度洗脱；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl～20μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。

作为优选方案，所述步骤(3)的hplc色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，c18(4.6mm×150mm，5.0μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，并开启dad检测；以乙腈为流动相a，以体积分数为0.2％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流动相a、b的比例变化为0～20min，a:b为5％:95％→10％:90％；20～50min，a:b为10％:90％→20％:80％；50～60min，a:b为20％:80％→25％:75％；60～75min，a:b为25％:75％→100％:0％；

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)采用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统为2004a版。所述步骤(4)包括：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版，将步骤(3)得到的液相色谱的数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到黄柏指纹图谱。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄柏指纹图谱包括和盐酸黄柏碱对应的5号峰、木兰花碱对应的6号峰、盐酸小檗碱对应的15号峰(s峰)，其相对保留时间分别为0.382、0.396、1.000。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄柏指纹图谱的共有峰还包括相对保留时间为0.140的1号峰、相对保留时间为0.276的2号峰、相对保留时间为0.297的3号峰、相对保留时间为0.356的4号峰、相对保留时间为0.450的7号峰、相对保留时间为0.607的8号峰、相对保留时间为0.638的9号峰、相对保留时间为0.672的10号峰、相对保留时间为0.716的11号峰、相对保留时间为0.817的12号峰、相对保留时间为0.888的13号峰、相对保留时间为0.919的14号峰、相对保留时间为1.168的16号峰。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(4)得到的黄柏指纹图谱如图3所示。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)的所述分类鉴别包括但不限于区别川黄柏和关黄柏、区分不同炮制品、或区分不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的层序聚类分析为无监督的模式识别模型，或者采用的主成分分析为无监督的模式识别模型，或者采用的偏最小二乘分析为有监督的模式识别模型。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的层序聚类分析为无监督的模式识别模型，以系统聚类树显示聚类结果，用于区别川黄柏和关黄柏、区分不同炮制品、或区分不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的主成分分析为无监督的模式识别模型，以得分图显示聚类结果，用于区别川黄柏和关黄柏、区分不同炮制品、或区分不同外观性状。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)采用的偏最小二乘分析为有监督的模式识别模型，绘制模型3d图和vip图(变量投影重要性)，用于区别川黄柏和关黄柏、区分不同炮制品、或区分不同外观性状；还可以权衡每个变量对于识别力的重要性影响，找出化学标记物，为黄柏质量控制及其等级评价划分提供方法依据。

在本发明的鉴定方法实施方案中，其中，所述步骤(5)可以同时包括根据上述三种模式识别的结果，相互验证结果的可靠性，从而提高模型的准确度。

第二方面，本发明提供了上述黄柏的鉴定方法在判别和/或区分川黄柏和关黄柏、判别和/或区分黄柏炮制、或者判别和/或区分黄柏的外观性状中的应用，或者上述黄柏的鉴定方法在黄柏质量控制、或者黄柏等级质量标准的划分中的应用，或者上述黄柏的鉴定方法在黄柏真伪品鉴别中的应用。

本发明取得的技术效果至少包括下列一种或多种：

(1)以不同产地的黄柏得到的黄柏指纹图谱可以代表黄柏的大部分药效成分，能够有效地表征黄柏的质量。

(2)以黄柏的指纹图谱作为一个整体看待，注重各种化学成分的指纹特征峰及相互关系，注重黄柏的整体面貌特征，避免了只测定一、二个指标性化学成分而判定黄柏质量的片面性，又减少了人为主观判断而造成误差的可能性。

(3)本发明的优点是结合化学模式识别，从化学量测数据推理出物质类的本质属性，进行对物质进行识别和归类。化学模式识别结果显示黄柏及其伪品关黄柏明显聚为两类，临床实用及制剂应用时应注意区分；显示黄柏样本中明显聚为两类，一类黄柏去净粗栓皮或粗栓皮较少，黄柏厚度不超过0.5mm，一类黄柏未去粗栓皮或粗栓皮较多，黄柏厚度超过1.5mm；显示黄柏及其炮制品盐黄柏、黄柏炭可明显区分。提示规格差异和药材净制加工、炮制对于黄柏的等级质量标准的建立有重要意义，提示粗栓皮的薄厚、黄柏中盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱含量可作为黄柏等级标准分类依据。

(4)本发明建立的一种黄柏的鉴定方法，通过指纹图谱全面反映黄柏内在化学成分的种类和数量，进而反应黄柏的质量；通过化学模式识别对化学体系的测量值与体系状态之间建立的联系，找出样品的特征，进而对样品进行识别和归类。两者联合应用对黄柏不同规格、炮制品、真伪品的分析与预测能力，为黄柏药材、饮片及其炮制品的质量评价和真伪鉴别提供了新方法，为黄柏建立全面的质量标准、临床合理用药提供参考。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1为3种对照品的hplc色谱图；

图1中，a：盐酸黄柏碱对照品，b：木兰花碱对照品，c：盐酸小檗碱对照品；

图2为本发明实施例1中测得的黄柏的共有模式图谱；

图2中，5号峰：盐酸黄柏碱，6号峰：木兰花碱，15号峰：盐酸小檗碱；

图3为本发明实施例1中20个批次黄柏指纹图谱叠加图谱；

图4为本发明实施例3中黄柏-关黄柏生品hca树状图；

图5为本发明实施例3中黄柏生品-炮制品盐黄柏、黄柏炭hca树状图；

图6为本发明实施例3中黄柏-关黄柏生品pca得分图；

图7为本发明实施例3中黄柏生品-炮制品盐黄柏、黄柏炭pca得分图；

图8为本发明实施例3中黄柏-关黄柏生品pls-da模型3d图；

图9为本发明实施例3中黄柏生品pls-da模型vip图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例用到的仪器及试剂如下：

1、仪器与试药

1.1仪器

十万分之一天平(sartoriusbt125d，赛多利斯科学仪器有限公司)；台式高速离心机(tg16-ws，长沙湘仪离心机仪器有限公司)；高效液相色谱仪(lc-10a，日本岛津公司，dad检测器)；超声波清洗器(kh3200b，昆山禾创超声仪器有限公司)；中药粉碎机(hc-150，黄城高速多功能粉碎机)。

1.2试药

盐酸黄柏碱对照品(批号：170307，含量>98％)、木兰花碱对照品(批号：170104，含量>98％)、盐酸小檗碱对照品(批号：161223，含量>98％)，以上对照品均购自上海融禾医药科技有限公司。

色谱甲醇、乙腈购自美国sigma公司，色谱磷酸及盐酸购于天津科密欧化学试剂有限公司。所用水为屈臣氏蒸馏水。

共收集20个批次的黄柏样品，经鉴定为芸香科植物黄皮树phellodendronchinenseschneid.的干燥树皮。20个批次的黄柏供试样本基本信息见表1。

表1黄柏供试样本基本信息

共收集了10个批次的黄柏炮制品样品，经鉴定为盐黄柏和黄柏炭。7个批次的盐黄柏和3个批次的黄柏炭供试样本基本信息见表2。

表2黄柏炮制品供试样本基本信息

共收集了5个批次的关黄柏样品，经鉴定为芸香科黄檗phellodendronamurenserupr.的干燥树皮。5个批次的关黄柏供试样本基本信息见表3。

表3关黄柏供试样本基本信息

实施例1黄柏指纹图谱的建立方法及方法学考察

1、黄柏指纹图谱的建立方法

黄柏指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取以上表1的20个批次不同产地黄柏粉碎后过3号药典筛，取黄柏粉末0.2g，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入甲醇(含0.1％盐酸)，定容至刻度，称定重量，超声处理40min，冷却至室温，用甲醇(含0.1％盐酸)补足损失的重量，摇匀，离心机4000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品、木兰花碱对照品，加甲醇(含0.1％盐酸)制成每1ml含有500μg盐酸小檗碱、80μg盐酸黄柏碱、30μg木兰花碱的对照品溶液；

(3)hplc色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，c18(4.6mm×150mm，5.0μm)为色谱柱，柱温30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，并开启dad检测。以乙腈为流动相a，以体积分数为0.2％磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流动相a、b的比例变化为0～20min，a:b为5％:95％→10％:90％；20～50min，a:b为10％:90％→20％:80％；50～60min，a:b为20％:80％→25％:75％；60～75min，a:b为25％:75％→100％:0％；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；

(5)将液相图谱导入指纹图谱相似度评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版)分析，以sc5药材图谱作为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1min,用

平均数法计算，多点校正、数据匹配，生成叠加色谱图(见图3)和对照图谱(见图2)。将

20批黄柏的指纹图谱与生成的对照指纹图谱进行相似度分析，结果显示20批黄柏的指纹

图谱与对照图谱的相似度均大于0.981，见表4。

表420批黄柏的指纹图谱相似度

经与3种对照品比对，确定20.173min峰为盐酸黄柏碱(5号峰)、20.948min峰为木兰花碱(6号峰)、52.846min峰为盐酸小檗碱(15号峰)。其中选取分离度较好，峰面积较大且稳定的盐酸小檗碱为参照峰(s)。以盐酸小檗碱为参照峰的hplc指纹图谱共确定16个共有峰。以参照峰的相对保留时间为1，计算其它各共有峰的相对保留时间，结果见表5。

表520批黄柏的指纹共有峰相对保留时间

2、指纹图谱方法学考察

2.1精密度试验

取黄柏(sc5)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中色谱条件连续进样6针，得到6张色谱图。以盐酸小檗碱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表6和表7。

表6黄柏指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表7黄柏指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表6和表7可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明该方法精密度良好。

2.2重复性试验

取黄柏(sc5)，平行称取6份，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到6张色谱图。以盐酸小檗碱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表8和表9。

表8黄柏指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表9黄柏指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表8和表9可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明该方法重复性良好。

2.3稳定性试验

取黄柏(sc5)，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h条件进样，得到6张色谱图。以盐酸小檗碱峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表10和表11。

表10黄柏指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)

表11黄柏指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)

由表10和表11可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％<5％、相对保留时间rsd％<2％，说明供试品溶液在24h内基本稳定。

实施例2黄柏指纹图谱的多波长定量成分的检测及方法学考察

1、多波长定量成分的检测

盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱3种药效指标成分的保留时间分别为：20.173min、20.948min、52.846min。开启dad检测器进行全波长扫描，比较不同波长条件下各药效指标成分的峰面积，得到各指标成分的最适检测波长，即284nm波长条件下检测盐酸黄柏碱的含量，268nm波长条件下检测木兰花碱的含量，在265nm波长条件下检测盐酸小檗碱的含量。

2、多波长定量成分检测方法学考察

2.1线性考察

精密量取含盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱对照品溶液适量，逐级稀释，配成一系列浓度的对照品溶液，进样分析，分别于波长284nm、268nm、265nm下测定并记录峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，浓度(x)为横坐标，求得的黄柏碱的回归方程：y＝5e+06x-1468.2，相关系数r＝0.9998；线性范围：0.00205mg·ml-1～0.082mg·ml-1；木兰花碱的回归方程：y＝1e+07x-1880，相关系数r＝0.9998；线性范围：0.0007mg·ml-1～0.028mg·ml-1；盐酸小檗碱的回归方程：y＝2e+07x-40531，相关系数r＝0.9998；线性范围：0.015mg·ml-1～0.6mg·ml-1。

2.2精密度试验

按实施例1的对照品溶液的制备方法制备对照品溶液，按实施例1中色谱条件连续进样6针，得到6张色谱图。计算各特征峰的峰面积及保留时间，并计算rsd值，结果见表12和表13。

表12黄柏多波长定量成分检测精密度试验考察结果(特征峰峰面积)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

表13黄柏多波长定量成分检测精密度试验考察结果(特征峰保留时间)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

由表12和表13可知，各特征峰的峰面积rsd％<5％、保留时间rsd％<2％，说明该方法精密度良好。

2.3重复性试验

按实施例1的对照品溶液的制备方法，平行制备6份对照品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到6张色谱图。计算各特征峰的峰面积及保留时间，并计算rsd值，结果见表14和表15。

表14黄柏多波长定量成分检测重复性试验考察结果(特征峰峰面积)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

表15黄柏多波长定量成分检测重复性试验考察结果(特征峰保留时间)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

由表14和表15可知，各特征峰的峰面积rsd％<5％、保留时间rsd％<2％，说明该方法精密度良好。

2.4稳定性试验

按实施例1的对照品溶液的制备方法，平行制备6份对照品溶液，按实施例1中色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h条件进样，得到6张色谱图。计算各共特征峰的峰面积及保留时间，并计算rsd值，结果见表16和表17。

表16黄柏多波长定量成分检测稳定性试验考察结果(特征峰峰面积)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

表17黄柏多波长定量成分检测稳定性试验考察结果(特征峰保留时间)

*5(盐酸黄柏碱)、6(木兰花碱)、15(盐酸小檗碱)

由表16和表17可知，各特征峰的峰面积rsd％<5％、保留时间rsd％<2％，说明对照品溶液在24h内基本稳定。

2.5加样回收率试验

称取已知含量的黄柏药材粉末(sc5)6份，分别精密加入含盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱对照品溶液适量，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件，分别进样，得到6张色谱图。计算盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱的加样回收率，并计算rsd值，结果见表18。

表18特征峰加样回收率结果

由表18可知，各特征峰的加样回收率在98％-105％，说明该方法加样回收率符合试验要求。

3、指标成分含量的测定

取20个批次不同产地的黄柏，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备20份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，284nm波长条件下检测盐酸黄柏碱的含量，268nm波长条件下检测木兰花碱的含量，在265nm波长条件下检测盐酸小檗碱的含量，

记录各指标成分的峰面积，代入线性回归方程计算含量，每个样品重复测量两次，取平均值。计算不同产地黄柏中盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱含量。结果见表19。

表1920个批次黄柏中指标成分含量测定结果

由表19可知，不同产地的黄柏指标成分含量存在明显差异。

实施例3黄柏化学模式识别方法的建立

1、层序聚类分析(hca)对黄柏的识别

利用watersempower工作站数据管理功能，获取黄柏与关黄柏各成分峰面积、保留时间等相关信息。将获得的数据矩阵导入spss19.0中，采用平均联接pearson相关性(组内)联接对黄柏样品进行层序聚类分析，树状图如图4所示。当距离标尺大约在22时，黄柏与关黄柏能显著区分，关黄柏聚为一类s3，黄柏聚为两类s1和s2。通过对黄柏样品形状、厚薄、色泽、质地进行考察发现：s1样本多为粗栓皮较多者，质地粗糙，最大厚度可达到1.5mm左右；s2样本多为粗栓皮较少者，质地较光滑，厚度不超过0.5mm。

采用euclidean距离组间联接对黄柏生品-炮制品(盐黄柏和黄柏炭)进行层序聚类分析，树状图如图5所示。当距离标尺大约在19时，黄柏生品和盐黄柏、黄柏炭能显著区分。其中s1为黄柏生品；s2和s3分别盐黄柏和黄柏炭。

2、主成分分析(pca)对黄柏的识别

采用simca-p11.5首先建立不同产地黄柏和关黄柏生品pca模型。得分图如图6所示，从图中可以看出样本聚为三类，其中s3为关黄柏，s1、s2为黄柏。黄柏被识别为两类，经过与其外观性状对比分析，发现s1类黄柏表面粗栓皮较多，质地较厚；而s2类包含的样本黄柏表面粗栓皮较少，且质地相对较薄。提示栓皮的薄厚可作为划分黄柏等级质量标准的重要依据。在pca模型中，交叉有效性q2(cum)＝0.418。根据交叉有效性等特征值选择最佳成分个数，获取主成分，其累计贡献率r²x(cum)＝0.727，精度较好。根据所建立的pca模型，可以明显区分关黄柏和黄柏。对药材的区分和鉴别也有重要的意义。

其次建立川黄柏生品和炮制品pca模型。得分图如图7所示。从图中可以看出，所建立的pca模型能够明显的将黄柏生品及盐黄柏和黄柏炭区分为三类，为炮制品的区分和鉴别提供了一个新的方法。

3、偏最小二乘分析(pls-da)对黄柏的识别

为了更好的找到化学标记物，对关黄柏、黄柏建立有监督的pls-da模型。图8为pls-da模型3d图。其中s3部分为关黄柏，其他样本为黄柏；黄柏被明显分为两类，与pca模型的结果一致，验证了结果的可靠性。

为了权衡每个变量对于识别力的重要性影响，绘制了vip图(变量投影重要性)(图2-5)，对变量与x和y相关重要性做了解释。图中显示，变量的vip值大于1，这意

味着这些变量在区别中起到重要作用。其中化学成分10、11有最大的vip值，通过标准品指认10号峰为盐酸小檗碱，为黄柏的特征性成分，化学成分11尚无法用标准品有效指认。证明pls-da模型拟合数据并良好地预测新数据。在pls-da模型中，交叉有效性q2(cum)＝0.962。根据交叉有效性等特征值选择最佳成分个数，获取主成分，其累计贡献率r²x(cum)＝0.999，r²y(cum)＝0.406，表明精度较良好。结果提示黄柏中盐酸小檗碱为对黄柏区别起重要作用的变量，可作为黄柏等级标准分类的依据。

以上试验结果表明，本发明提供的一种黄柏指纹图谱-化学模式识别的评价方法，从指纹图谱这一整体角度出发，系统研究了三种化学模式识别技术对黄柏的正品、伪品、炮制品的分析与预测能力，为黄柏及其炮制品的质量评价和真伪鉴别提供了新方法，为黄柏不同规格的药材、饮片质量控制及等级质量标准的划分提供方法依据，为临床应用和医药工业中黄柏的区分使用提供借鉴。研究发现：不同产地黄柏指标成分含量存在一定差异，为黄柏质量与产地联系起来提供一定依据；黄柏样本中黄柏被识别为两类，一类粗栓皮较多，质地粗糙，最大厚度可达到1.5mm左右，一类粗栓皮较少者，质地较光滑，厚度不超过0.5mm；通过pls-da模型获取了重要化学标记物盐酸小檗碱。提示关黄柏与黄柏差异较大，不提倡混用。提示粗栓皮的薄厚、黄柏中盐酸小檗碱含量可作为黄柏等级标准分类依据。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。