一种鉴定胸腔积液生物标记物的方法及其检测试剂盒与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其检测应用。
背景技术：
：胸腔积液(pleuraleffusion)是以胸膜腔内病理性液体积聚为特征的一种常见临床症候。这种多余的液体可以通过限制肺的扩张来损害呼吸。各种胸腔积液，取决于液体的性质和导致其进入胸膜腔的原因，是胸腔积液(浆液)，血胸(血液)，尿胸(尿液)，乳糜胸(乳糜)或脓胸(脓)。胸膜毛细血管内静水压增高(如充血性心力衰竭)、胸膜通透性增加(如胸膜炎症、肿瘤)、胸膜毛细血管内胶体渗透压降低(如低蛋白血症、肝硬化)，壁层胸膜淋巴回流障碍(如癌性淋巴管阻塞)以及胸部损伤等，均可引起胸腔积液。胸腔积液的鉴别诊断一直都是临床工作中的难题，早在1997年pet/ct就被报道可用于诊断mpe，但由于敏感度和特异度都差强人意，迄今未获推荐应用于实际的临床工作。胸腔镜对于诊断恶性胸腔积液的价值早已得到呼吸科和肿瘤科大夫的广泛认同，再结合应用荧光技术可探查微小的胸膜病变并准确地辨认病变范围，大大提高诊断的敏感度及阴性预计值。诊断恶性胸腔积液的金标准是在胸水或胸膜活检组织中找到恶性细胞，难题在于并非所有的恶性胸腔积液都能找到恶性细胞。因此，科学家们希望能找到无创的来提高诊断效率。如何精确识别胸腔积液的易感人群以便早期干预，或能否筛选合适的生物标志物以预测疾病治疗的效果或者预测疾病的进展等已成为热点问题。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常体检人群的范围为3.90～6.16mmol/l。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/l。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。d-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中n-糖链的重要组分，n-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(pmp)衍生的高效液相色谱法同时检测胸腔积液患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。因此，建立高效准确的血清中游离甘露糖的检测方法，对于研究血清游离单糖与疾病之间的关系、寻找疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。单糖的pmp衍生法是目前较为常用的单糖检测方法。该方法包括以下几个步骤：(1)为pmp创建碱性条件，(2)加入pmp，在70℃进行衍生，(3)调节衍生后的溶液ph，将残余pmp萃取出来。发明专利cn103969371b公开了“一种血液降解得到并检测单糖的方法在癌症检测中的应用”。该发明专利首先将血清样品通过酸降解，将其中的多糖和糖蛋白降解为单糖组分；然后经过pmp衍生和高效液相对降解后得到的8种单糖进行检测。相比降解前的血清，样品组分与性质已经发生巨大变化。虽然单糖的pmp衍方法在各个领域应用比较广泛，但目前尚无报道将该方法应用于胸腔积液患者的血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。技术实现要素：本发明的目的是提供了用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其应用，本发明采用柱前pmp衍生的高效液相色谱法(hplc)检测胸腔积液患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测胸腔积液患者或正常体检人群血清游离葡萄糖和甘露糖浓度并对二者峰面积计算比值，可以用于鉴定胸腔积液患者。为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：用于鉴定胸腔积液的生物标记物，所述生物标记物为患者血清经过柱前pmp衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。用于鉴定胸腔积液的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前pmp衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：(1)调节ph为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于ep管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；(2)pmp衍生：每个样品加入pmp，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；(5)将样品离心，取上清液于装有内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析；(6)制备甘露糖和葡萄糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定甘露糖、葡萄糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖浓度的比值。所述高效液相色谱为agilent1260高效液相系统，agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)，所述步骤(5)中的色谱条件为：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：a相为乙腈，b相为ph为5.5的0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液。所述步骤(5)中流动相的梯度变化为：0min，a相15％，b相85％；10min，a相22％，b相78％；15min，a相24％，b相76％；15.1min，a相15％，b相85％；20min，a相15％，b相85％。所述步骤(3)中盐酸的浓度为0.3mol/l。所述步骤(4)中有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。生物标记物在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途。生物标记物在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂盒中包括浓度为82.42μmol/l甘露糖和浓度为4474μmol/l葡萄糖的标准液。一种鉴定胸腔积液的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有生物标记物，即血清经过柱前pmp衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。所述试剂盒中包括浓度浓度为82.42μmol/l甘露糖和浓度为4474μmol/l葡萄糖的标准液。鉴定胸腔积液的试剂盒在制备用于检测胸腔积液的试剂盒中的用途。与现有技术相比，本发明将柱前pmp衍生的高效液相色谱法用于胸腔积液患者血清游离单糖的检测，其有益技术效果是：1、前处理简单。2、分析时间短。3、所需要的血清用量少，每次只需小于1ml的血量。4、仪器价格合理，符合常规使用。5、操作步骤简单易学。6、检测准确。本发明采用柱前pmp衍生的高效液相色谱法同时测定血清游离甘露糖和葡萄糖，简化操作，并且血清用量少，而且也已证实此方法甘露糖浓度的测定不会受高浓度葡萄糖的影响。通过对血清游离葡萄糖、甘露糖浓度，及葡萄糖和甘露糖峰面积的比值(g/m比值)的统计学数据分析，建立了与胸腔积液的关系。使用本发明的技术方案，通过检测血清中游离的甘露糖和葡萄糖，计算甘露糖和葡萄糖浓度，以及葡萄糖与甘露糖峰面积的比值，可以快速区分正常人群和胸腔积液患者。附图说明图1为两种类型色谱柱色谱图图2为不同流动相梯度的色谱图图3为胸腔积液患者与正常体检人群血清游离葡萄糖浓度、甘露糖浓度及葡萄糖与甘露糖峰面积比值的散点图图4为胸腔积液患者与正常体检人群葡萄糖与甘露糖峰面积比值，作为血清糖生物标志物的roc曲线图。图5为胸腔积液患者与正常体检人群血清游离葡萄糖浓度、甘露糖浓度及葡萄糖与甘露糖峰面积比值构建的三维立体图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中涉及的所有血样均由青岛市青岛大学附属医院提供。实施例1本发明的技术方案包括以下步骤：(1)精密称取甘露糖(man)、葡萄糖胺(glcn)、半乳糖胺(galn)、葡萄糖醛酸(glcua)、葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)、岩藻糖(fuc)适量，加去离子水配制两份含以上单糖0.1mg/ml混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μl混合单糖标准品于1.5mlep管，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；(3)pmp衍生：每个样品加入60μlpmp(1-苯基-5-甲基吡唑啉酮)，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μl0.3mol/l盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μl三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μl上清液于装有150μl内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，两份样品分别使用不同的色谱柱a和b进行高效液相分析，高效液相色谱为agilent1260高效液相系统，所得色谱图，见图1。色谱柱a：agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％色谱柱b：agilentzorbaxxdb-c18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；agilentzorbaxxdb-c18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：从图1可以看出，agilentzorbaxxdb-c18色谱柱分析时间长，色谱峰分离度差，agilentporoshellec-c18色谱柱分析时间是zorbaxxdb-c18色谱柱的1/3，色谱峰良好。横坐标为时间(min)，纵坐标为dad信号强度。1，2，3，4，5，6，7，8依次man，glcn，galn，glcua，glc，gal，xyl，fuc的色谱峰。实施例2(1)精密称取甘露糖(man)、鼠李糖(rha)和葡萄糖(glc)适量，加去离子水配制相同的5份含以上单糖0.1mg/ml混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μl混合单糖标准品于1.5mlep管，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；(3)pmp衍生：每个样品加入60μl0.5mol/lpmp，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μl0.3mol/l盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μl三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μl上清液于装有150μl内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，5份样品分别在不同流动相变化梯度下用于高效液相分析，所得色谱图，见图2。高效液相色谱为agilent1260高效液相系统，agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；流动相变化梯度a：流动相变化梯度b：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min20％80％20min20％80％流动相变化梯度c：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min22％78％20min22％78％流动相变化梯度d：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min15％85％10min22％78％15min15％85％20min15％85％流动相变化梯度e：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％从图2可以看出，在梯度a条件下，只有man被洗脱出来；在梯度b条件下，尽管三者能够被分离开来，但是溶剂pmp的峰与man离的较近；而在梯度c条件下，溶剂峰与man峰重合；在梯度d条件下，glc峰洗脱出来的时间过长，导致不能形成尖而高的峰。只有在梯度e条件下，出峰对称，且分离度好。横坐标为时间(min)，纵坐标为dad信号强度。1，2和3依次是man，rha和glc的色谱峰。实施例3(1)精密称取甘露糖和葡萄糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，0.0025mg/ml，0.001mg/ml，0.0005mg/ml的混合标准品溶液，现用现配；(2)创造碱性环境：取40μl混合单糖标准品于1.5mlep管，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；(3)pmp衍生：每个样品加入60μl0.5mol/lpmp，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(4)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μl0.3mol/l盐酸，涡旋混匀；(5)萃取：每管加入500μl三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(6)将样品13000r/min离心10min，取80μl上清液于装有150μl内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。高效液相色谱为agilent1260高效液相系统，agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；色谱条件：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；流动相变化梯度：时间乙腈0.1mol/l乙酸铵ph5.50min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％(7)绘制甘露糖和葡萄糖的标准曲线。实施例4(1)创造碱性环境：分别取95例已确诊的胸腔积液患者及95名年龄性别匹配的正常体检人群血清样品10μl加30μl超纯水于1.5mlep管中，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；(2)其余步骤同实施例3，分析计算葡萄糖、甘露糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖峰面积的比值。统计检测结果，见图3。将图3结果总结至表1和表2。表1.胸腔积液患者血清游离单糖和g/m峰面积比值与正常体检人群的相对趋势葡萄糖甘露糖g/m比值胸腔积液↓***↑ns↓***注释：“ns”代表与正常体检人群相比无显著性差异，“***p＜0.001”、“**p＜0.01”和“*p＜0.05”分别代表与正常体检人群相比有显著性差异，“↑”和“↓”分别代表与正常体检人群相比上升或下降，“-”表示与正常体检人群无明显变化。表2.胸腔积液患者及正常体检人群血清中2种游离单糖浓度(μmol/l)及其峰面积比值结果葡萄糖甘露糖g/m比值正常体检人群6332±266982.42±40.1279.16±16.68胸腔积液4474±186691.18±56.2441.29±15.55另外，对表1中与正常人有显著性差异的甘露糖和葡萄糖峰面积比值进行了roc曲线分析，以期望找到曲线下面积(auc)、灵敏度和特异性均较高的指标，以确定最佳筛查阳性临界值(cutoff值)，auc越接近于1，说明诊断效果越好。检测结果见图4，将图4结果总结至表3。表3auccutoff值灵敏度特异性g/m比值0.955460.5491.89％91.89％从图3，表1，表2可以看出，年龄性别匹配的正常体检人群相比，胸腔积液患者血清游离葡萄糖显著下降，甘露糖轻微上升，葡萄糖与甘露糖峰面积比值显著下降。另外，表3显示，甘露糖和葡萄糖峰面积比值的特异性和灵敏度均较高，说明血清游离葡萄糖与甘露糖峰面积比值与胸腔积液疾病有关系，g/m比值可以区分正常人与胸腔积液患者。因此，可以以血清游离葡萄糖与甘露糖峰面积比值为生物标志物来检测胸腔积液患者。实施例5利用本发明所述的生物标记物用于检测胸腔积液的应用，具体包括以下步骤：(1)创造碱性环境：取待检测的血清样品10μl加30μl超纯水于1.5mlep管中，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；(2)pmp衍生：每个样品加入60μlpmp，涡旋混匀，离心后70℃烘箱反应1h；(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入40μl0.3mol/l盐酸，涡旋混匀；(4)萃取：每管加入500μl三氯甲烷，涡旋，离心，移除下层三氯甲烷，保留上清，重复3次；(5)将样品13000r/min离心10min，取80μl上清液于装有150μl内插管的棕色上样瓶中，盖紧盖子，离心，待用于高效液相分析。高效液相色谱为agilent1260高效液相系统，agilentporoshellec-c18色谱柱(4.6mm×100mm，2.7μm)；色谱条件为：检测波长：254nm，带宽4nm；参比波长：350nm，带宽100nm；柱温：37℃；流速：1ml/min；进样体积：20μl；流动相：0.1mol/l乙酸铵-乙酸缓冲溶液，乙腈；梯度变化：时间a(乙腈)b(0.1mol/l乙酸铵ph5.5)0min15％85％10min22％78％15min24％76％15.1min15％85％20min15％85％(6)绘制葡萄糖和甘露糖的标准曲线：精密称取葡萄糖和甘露糖适量，加去离子水配制成含以上单糖各0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，0.0025mg/ml，0.001mg/ml，0.0005mg/ml的混合标准品溶液，现用现配；取40μl混合单糖标准品于1.5mlep管，加入40μl0.3mol/l氢氧化钠，涡旋混匀；其余步骤同(2)、(3)、(4)、(5)。(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中的标准曲线比对并分析计算，确定葡萄糖、甘露糖的浓度以及葡萄糖与甘露糖峰面积的比值。并通过origin9软件作出三者之间的三维立体图，以便更直观的观察三者联合能否将正常人与胸腔积液患者区分开，见图5。通过prism软件作出roc曲线，以便确定g/m比值作为标志物的可能性，结果发现敏感性为91.89％，特异性为91.89％，具有较高的敏感性和特异性。如果待测血清样品中的游离葡萄糖与甘露糖峰面积比值小于41.29，则判定待测血清样品为胸腔积液患者。以上结果均表明：该方法前处理简单；分析时间短；所需要的血清用量少，每次只需小于1ml的血量；仪器价格合理，符合常规使用；操作步骤简单易学；检测准确。本发明所述的方法对于研究血清游离单糖与胸腔积液之间的关系、寻找疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义，将适合临床上用于胸腔积液患者的诊断。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12