一种远缘杂交甜菜染色体制片方法与流程

本发明属于植物制片技术领域，尤其涉及一种远缘杂交甜菜染色体制片方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：染色体制片观察是植物细胞生物学的主要研究方法之一。染色体制片观察通常采用压片法。由于甜菜染色体很短。而对远缘杂交甜菜染色体制片难度更大。主要是难识别附加染色体。远缘杂交甜菜染色体较短，对附加的染色体难以进行辨认，这个问题一直在困扰着研究人员。用常规的压片法无法解决这个难题。因此，这对远缘杂交甜菜的深入研究也受到很大的限制。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)植物细胞的细胞壁和细胞质对染色体的严重覆盖，难以识别和辨认附加染色体，另外有丝分裂指数低不易获得大量的中期分裂相，这给远缘杂交甜菜的染色体微分离及原位杂交和附加白花甜菜染色体信号分析都带来很大难度。(2)常规方法给染色体微分离及微克隆带来很大的难度，如：第一，附加染色体难识别，第二，无法对难识别的染色体进行微分离和微切割，第三，最大问题是细胞质对染色体的覆盖影响探针的渗透。更不利于对远缘杂交材料的深入研究。

解决上述技术问题的难度和意义：

远缘杂交甜菜m14附加1条野生白花甜菜染色体，附加白花甜菜染色体识别和确认是微分离染色体制片的关键。一种远缘杂交甜菜染色体制片方法的研究，解决了有丝分裂指数偏低和附加染色体识别的问题，为远缘杂交甜菜附加染色体的微分离和微克隆提供了必要的研究基础。对白花甜菜染色体所携带的相关基因的鉴定和进行深入研究都具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种远缘杂交甜菜染色体制片方法，

本发明是这样实现的，一种远缘杂交甜菜染色体制片方法，包括以下步骤：

步骤一：取样：选取远缘杂交甜菜的新叶分生区部位，取样部位正确可以有效提高有丝分裂指数获得大量的中期分裂相；

步骤二：预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理2-4小时；该预处理液对细胞的毒害小，可有效提高甜菜有丝分裂指数。甜菜分裂指数高达50％以上。值得注意的是8-羟基喹啉预处理超过12小时，细胞分裂指数下降，染色体浓缩不易分散。预处理时间加倍的结果使得单体附加系甜菜中普通栽培甜菜染色体浓缩的更短而附加的染色体略长些；

步骤三：水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；水洗步骤一定要彻底可有效去除8-羟基喹啉的阻断；

步骤四：解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；酸解离可快速渗透细胞，分解细胞壁和果胶质；效果显著；

步骤五：染色、制片：用改良的品红染色液的技术效果非常显著，即可缩短染色时间，又使得染色体容易着色，制片干净、清晰、整洁，染色2-3分钟即可，改良品红在同一时间内对螺旋化程度有差异的染色体之间的染色效果也不同，附加的野生白花甜菜染色体长且染色效果浅，显微镜下很容易识别，更有利于对其进行后续定向研究；

步骤六：镜检观察：利用加拿大树胶或指甲油封片，查找中期染色体分裂相，观察、计数。该方法将附加野生甜菜染色体分辨率提高到准确识别和高效进行染色体微分离的水平；对野生白花甜菜染色体进行微切割微克隆等研究奠定了重要地位。

进一步，步骤一中，远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14或异源三倍体甜菜。

进一步，步骤二中，8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

进一步，步骤四中，解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

进一步，步骤五中，改良的品红染色液，具体制备方法为：

(1)取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存；

(2)取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

(4)取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

(5)取原液c10-20ml加入90-80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液；放置2周后使用，染色效果显著；使用2-3年不变质；山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明有利远缘杂甜菜染色体的识别与观察。本发明采取延长预处理时间的方法，使预处理时间由原来的1-2小时改为2-4小时；改进后的制片方法很容易识别附加染色体情况，可清晰观察到远缘杂交甜菜附加的染色体情况，实验效率显著提高。本发明简便易行，成本低。本发明方法的效果好，易于操作和掌握，提高了工作效率，省时省力。普光学显微镜即可观察，一般实验室都可以做到。

本发明利用改进后的制片方法分别对单体附加系甜菜m14、异源三倍体甜菜、白花甜菜普通栽培甜菜进行制片观察，效果很好，有可重复性。此方法也同样适用于滴片法和涂片法。本发明使远缘杂交甜菜染色体被成功识别，进而对附加的白花甜菜染色体进行了微分离和微克隆，进而建立了附加染色体的人工染色体bac库。为远缘杂交甜菜的分子生物学及蛋白质组学等研究工作提供基础保障。

附图说明

图1是本发明实施例提供的远缘杂交甜菜染色体制片方法流程图。

图2是本发明实施例提供的实验组1的染色体制片结果示意图。

图3是本发明实施例提供的利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果示意图。

图4是本发明实施例提供的利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果示意图。

图5是本发明实施例提供的利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果示意图。

图6是本发明实施例提供的实验组2的染色体制片结果示意图。

图7是本发明实施例提供的实验组3的染色体制片结果示意图。

图8是本发明实施例提供的实验组4的染色体制片结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的远缘杂交甜菜染色体制片方法包括以下步骤：

s101：取样：选取远缘杂交甜菜的新叶；

s102：预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理2-4小时；

s103：水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

s104：解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

s105：染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

s106：镜检观察：利用加拿大树胶或指甲油封片，查找中期染色体分裂相，观察、计数。

在本发明的优选实施例中，步骤s101中，本发明实施例提供的远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14或异源三倍体甜菜。

在本发明的优选实施例中，步骤s102中，本发明实施例提供的8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

在本发明的优选实施例中，步骤s104中，本发明实施例提供的解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

在本发明的优选实施例中，步骤s105中，本发明实施例提供的改良的品红染色液，具体制备方法为：

(1)取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存；

(2)取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

(4)取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

(5)取原液c10-20ml加入90-80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液；放置2周后使用，染色效果显著；使用2-3年不变质；山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

下面结合具体实施例对本发明应用原理作进一步的描述。

实施例1；

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为2-4小时；

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

实施例2；

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14或异源三倍体甜菜；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为2-4小时；

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

实施例3；

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为2-4小时；8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

实施例4；

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为2-4小时；

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；解离液由100％乙醇和浓按体积比1:1组成。

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

实施例5；

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为2-4小时；

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a；

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚水溶液中，得原液b；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c；

4、取原液c10-20ml加入90-80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液，放置2周后使用；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

下面结合具体实验对本发明的应用效果作详细的描述。

实验组1：

本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；所述远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡，不用移动盖玻片，避免细胞变形使染色体扭曲，使染色体分散不重叠，在一个平面为宜。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

对照组为利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片，利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片，利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。

如图2所示，染色体制片结果，vv+1c,2n＝2x+1＝19。

如图3所示，利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果；

如图4所示，利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果；

如图5所示，利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果。

实验组2：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的新叶；所述远缘杂交甜菜为异源三倍体；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和滴片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料采用滴片法制片。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。

如图6所示，染色体制片结果。

实验组3：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取白花甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和涂片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料采用涂片法制片。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。

如图7所示，为白花甜菜36条染色体的染色体制片结果。

实验组4：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取普通栽培甜菜的新叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶或根尖进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡，不用移动盖玻片，避免细胞变形使染色体扭曲，使染色体分散不重叠，在一个平面为宜。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。

如图8所示，染色体制片结果，为栽培甜菜18条染色体。

由实验结果可知，经过本发明的制片方法，单体附加系m14、异源三倍体甜菜和白花甜菜染色体都比其它染色体略长，很容易识别。说明本发明方法的实验效果显著。而且不近适用于压片发，还同样适用于滴片法和涂片法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。