一种能够与类风湿因子高效结合的变性IgG的制备方法与流程

本发明涉及医学诊断领域，具体涉及一种能够与类风湿因子高效结合的变性igg的制备方法。

背景技术：

类风湿性关节炎(ra)是一种常见的风湿性疾病，该病常在起病后1～3年出现关节畸形，严重影响日常工作和生活，提高其早期诊断率是医务工作者所关注的问题。类风湿因子(rheumatoidfactor，简称rf)是诊断类风湿性关节炎的重要标准之一，快速高效准确地检测rf对ra的诊断及预后具有非常重要的意义。

rf是由人体内的异常igg刺激机体产生的自身抗体，主要属于igm型。在rf的体外诊断中，变性igg是不可或缺的，其与rf的结合能力是rf检测准确度、诊断精密度的重要保证。

在现有技术中，常规变性igg制备是先提取正常的igg，然后经63℃、30min热变性，或是6m尿素+0.1mβ-巯基乙醇在37度处理等手段。

以这些手段制备的变性igg与rf的结合能力有限，在临床应用上性能较差。且热处理工艺难以精确控制，热变性后样品的批间差波动比较大。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种变性igg的制备方法，该方法制备得到的变性igg与类风湿因子(rheumatoidfactor，rf)的反应活性高，检测范围更广、准确度更好，具有更好的临床应用价值。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的第一方面涉及一种能够与类风湿因子高效结合的变性igg的制备方法，包括：

a)对igg进行变性处理，以及

b)使用蛋白交联剂聚合变性后的igg。

根据本发明的第二方面，本发明还涉及一种类风湿因子的检测试剂盒，其包括包被有如上所述方法制备得到的变性igg的固相载体。

与现有技术相比，本发明在背景技术的基础上，改变了正常igg的变性手段，制备出了与rf高效结合的变性igg，可以在临床应用上有效改善rf检测试剂的性能。本发明所提供方法制备得到的变性igg与rf结合能力强、反应活性高，在临床生化检测上检测范围宽、准确度高，表现优异。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例和比较例在进行rf检测时的反应曲线。

具体实施方式

本发明涉及一种能够与类风湿因子高效结合的变性igg的制备方法，包括：

a)对igg进行变性处理，以及

b)使用蛋白交联剂聚合变性后的igg。

在一些实施方式中，所述蛋白交联剂选自戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯(smcc)、disuccinimidylsuberate(dss)、dst、3-[(2-aminoethyl)dithio]propionicacid(aedp)、mbs、n,n'-dicyclohexylcarbodiimide(dcc)、spdp、egs、转谷氨酰胺酶(tg)、过氧化酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)。

在一些实施方式中，蛋白交联剂优选其指向基团为氨基和羧基的交联剂，例如edc、aedp以及dcc。

在一些实施方式中，所述蛋白交联剂为edc，且在进行聚合处理时，所述edc与所述变性后的igg的质量比为(2～3)：1。

在一些实施方式中，所述蛋白交联剂为edc，且在进行聚合处理时，所述edc与所述变性后的igg的质量比为2.5：1。

在一些实施方式中，所述待检测样品选自细胞培养上清、全血、血浆、血清、组织或组织裂解液。

本文使用的"组织裂解物"、"细胞裂解物"、"裂解物"、"裂解的样品"、"组织提取物"或"细胞提取物"表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语"裂解"包括。

在一些实施方式中，所述igg的种属选自牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法选自热处理、酸处理、碱处理、化学修饰、破坏蛋白质的氢键、破坏蛋白质的疏水结构、氧化处理、酶切处理。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为使用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶酶切处理。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为60℃～66℃处理20min～40min。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为使用sds、尿素或β巯基乙醇中的一种或多种进行变性处理。

使用sds、尿素或β巯基乙醇进行变性处理可避免热处理工艺批间差异波动较大的缺点，且操作简便。该变性方法可很好地与后续的蛋白交联剂聚合反应配合以提高igg与rf反应的能力。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为0.08w/v％～0.12w/v％sds，35℃～39℃处理1.5h～2.5h。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为0.015w/v％～0.025w/v％sds，35℃～39℃处理2h～3h。

在一些实施方式中，所述igg进行变性处理的方法为5m～7m尿素、0.08m～0.12mβ巯基乙醇，35℃～39℃处理1.5h～2.5h。

在一些实施方式中，在步骤a)之前，或者步骤a)之后、b)之前，还包括：富集igg。

在一些实施方式中，所述富集igg的方法选自proteina亲和纯化、离子交换层析(deae柱层析)、饱和硫酸铵沉淀法、有机溶剂沉淀法(乙醇、辛酸法)、peg置换法、聚酰胺复合膜亲和膜法。

在一些实施方式中，所述离子交换层析为deae柱层析。

在一些实施方式中，所述有机溶剂沉淀法选自乙醇沉淀或辛酸沉淀法。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种类风湿因子的检测试剂盒，其包括包被有如上所述方法制备得到的变性igg的固相载体。

在一些实施方式中，所述固相载体为微孔板、聚苯乙烯胶乳颗粒上、试纸条或磁性纳米颗粒。

将变性igg包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，此致敏乳胶与待检测样品中的rf相遇时，可发生肉眼可见的凝集。

在一些实施方式中，所述微孔板为聚苯乙烯板；如待检测样品中含有rf，可与其结合，并与随后加入的酶标记热凝集igg反应，最后加入底物呈色，根据呈色程度可以判定rf水平。

在一些实施方式中，所述变性igg标记有用于显示信号强度的指示剂。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pacificblue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、lajolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninb、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰in、¹¹¹in、¹⁷⁷lu、¹⁸f、⁵²fe、⁶²cu、⁶⁴cu、⁶⁷cu、⁶⁷ga、⁶⁸ga、⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹zr、⁹⁴mtc、⁹⁴tc、⁹⁹mtc、¹²⁰i、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、^154-158gd、³²p、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、⁵¹mn、⁵²mmn、⁵⁵co、⁷²as、⁷⁵br、⁷⁶br、⁸²mrb和⁸³sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测类风湿因子(或称诊断类风湿性关节炎诊断)的方法，所述方法包括：

使用包被有如上所述方法制备得到的变性igg的聚苯乙烯胶乳颗粒与待检测样品接触，若发生肉眼可见的凝集则指示类风湿因子的存在；

或；

如上所述方法制备得到的变性igg标记有用于显示信号强度的指示剂，使用该变性igg与检测类风湿因子接触生产免疫复合物，通过检测所述指示剂的强度来评估检测类风湿因子的存在；可选的，在上述检测过程中，所述免疫复合物的形成还可包括未标记指示剂的变性igg的参与(例如双抗夹心法)，或抗人igg抗体的参与(列如间接elisa法)；

在一个优选的实施方式中，所述抗人igg抗体选自f(ab')2片段。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时。如熟练的技术人员将明白的，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用检测类风湿因子搭配其它临床上常有的临床指征来以某种可能性或预测值评估类风湿性关节炎的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一、小鼠igg的提取

收集阴性小鼠血清20ml，按50％饱和度边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵。继续搅拌5min后，4度静置1h，沉淀免疫球蛋白；

12000rpm、10min离心，沉淀用500ml的1xpbs(10mmpb+150mmnacl，ph7.4)溶解，透析至10l的pbs，隔夜后换液一次；

12000rpm、10min离心，收集上清。上清过proteing，100mmglyph2.7洗脱，收集洗脱液，为纯度较好的人igg，继续透析入pbs。

样品离心，上清为待变性处理的人igg样品。

二、igg的变性处理

将样品用pbs稀释至10mg/ml，63℃处理30min；

样品放至室温，加入戊二醛进行交联；

样品透析，置换入1×pbs体系，补加0.09％nan3，为变性igg成品。

实施例2

一、人igg的提取

用聚酰胺复合膜亲和膜法进行纯化。

用三氯三嗪键合法制备20张直径为47mm带苯丙氨酸配位基的亲和膜，装配在碟式亲和膜分离器中，用0.05mol/lnah2po4溶液稀释4ml人血浆，将血浆稀释液以1ml/min的流速泵人亲和膜分离器，先用1mol/lnacl溶液50mi.在2ml/min流速下洗脱膜上残留的杂蛋白，再改用1mol/l氯化钠/乙二醇(等体积)，在同样流量下洗脱膜上亲和吸附的igg，收集洗脱液，透析后收集样品。

二、igg的变性处理

将样品用pbs稀释至10mg/ml，6m尿素、0.1mβ巯基乙醇，37℃处理2h；

样品放至室温，加入aedp进行交联；

样品透析，置换入1×pbs体系，补加0.09％nan3，为变性igg成品。

实施例3

一、人igg的提取

收集阴性人血清1l，按50％饱和度边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵。继续搅拌5min后，4度静置1h，沉淀免疫球蛋白；

12000rpm、10min离心，沉淀用500ml的1xpbs(10mmpb+150mmnacl，ph7.4)溶解，透析至10l的pbs，隔夜后换液一次；

12000rpm、10min离心，收集上清。上清过proteing，100mmglyph2.7洗脱，收集洗脱液，为纯度较好的人igg，继续透析入pbs。

样品离心，上清为待变性处理的人igg样品。

二、igg的变性处理

将样品用pbs稀释至10mg/ml，按照0.02％加入sds(w/v)，37度水浴处理2.5h；

样品放至室温，加入2.5倍蛋白质量的dcc固体(edc：蛋白量＝2.5:1)，混匀后室温静置1h；

样品透析，置换入1×pbs体系，补加0.09％nan3，为变性igg成品。

实施例4

一、人igg的提取

用聚酰胺复合膜亲和膜法进行纯化。

在10ml人血清中加人等量0.025mph7.8的磷酸盐缓冲液(pbs)后，再加人分子量为1000的peg溶液，终浓度为16％，将试样分别置旋涡混合器上混匀，置冰箱(4c)过夜，次日离心5～10min(2500rpm)，弃上清，沉淀用0.025mph7.8的pbs溶解，直接上deae纤维素柱层析，以0.0175mph6.3的pbs洗脱。

二、igg的变性处理

将样品用pbs稀释至10mg/ml，0.1w/v％sds，37℃处理2h。；

样品放至室温，加入dcc进行交联；

样品透析，置换入1×pbs体系，补加0.09％nan3，为变性igg成品。

比较例1

一、人igg的提取

同实施例3。

二、igg的变性处理

将样品用pbs稀释至10mg/ml，按照0.02％加入sds(w/v)，37度水浴处理2.5h；

样品透析，置换入1×pbs体系，补加0.09％nan3，为变性igg成品。

将实施例3和比较例1所制备得到的变性igg用于rf检测，检测方法为生化平台胶乳增强免疫比浊法：

1.将变性igg偶联到活化好的羧基微球，为r2；

2.将经校准的rf标本梯度稀释，配制校准点，为s；

3.生化测试，将r1sr2在生化平台进行检测，得到一系列反应度；

4.绘制校准点浓度与反应度的相关曲线。

检测结果如图1所示(横坐标为rf活性浓度，单位为iu/ml，纵坐标为反应度)，从图中可以看出：实施例3所制备的变性igg在反应度、线性范围等方面均优于比较例。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。