一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒。

背景技术：

乳腺癌是全世界女性发病率最高的恶性肿瘤。在我国的广东省等沿海发达地区，由于生活方式的改变以及社会压力的增加，女性乳腺癌的发病率远高于世界平均增长速度。手术治疗后约50％的患者可以治愈，但其余患者可能发生转移或疾病复发。因此，预测高危患者，并尽快进行恰当的辅助治疗有助于改善患者的生存率。目前，预后指标包括肿瘤大小、淋巴结是否发生转移、病理学分级、雌孕激素受体状态等。研究表明，雌孕激素受体阳性患者复发率低，生存率高，预后较好；ki-67是一种与增殖相关的核蛋白，ki-67过表达是肿瘤局部复发的重要危险因素。随着对乳腺癌疾病发展过程及机制的了解，从中寻找预后指标和寻求乳腺癌治疗的新思路。

中性粒细胞是外周血最常见的细胞之一。作为炎性免疫反应的主要参与细胞，在乳腺癌的发病发展中也起着重要作用。在乳腺癌据报道，乳腺癌患者中中性粒细胞与淋巴细胞的比值升高与较差的预后相关。但在肿瘤实质中，中性粒细胞与预后相关尚不清楚。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于乳腺癌预后诊断的试剂盒，该试剂盒肿瘤实质中中性粒细胞浸润情况为新指标，辅助现有的预后诊断，以提高患者的生存率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于乳腺癌预后诊断的试剂盒，其包括用于检测肿瘤实质中中性粒细胞的试剂。

作为上述技术方案的改进，所述试剂盒包括用于检测中性粒细胞cd66b表达量的试剂。

作为上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒所述试剂包括cd66b一抗(结合抗体)和生物标记的cd66b二抗(结合抗体)、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶和dab显色液。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述试剂包括cd66b一抗和荧光标记的cd66b二抗。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述试剂还包括抗原修复液和过氧化氢。

本发明还提供试剂盒的一种检测方法，其包括以下步骤：

1)收集患者乳腺癌组织样本，经过脱水、包埋、切片等步骤制成组织切片；

2)将1)中组织切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭非特异位点等步骤，对cd66b一抗与组织切片进行孵育；

3)对2)中的组织切片与cd66b二抗进行孵育；

4)对3)中组织切片进行显色，对肿瘤实质中cd66b呈阳性的中性粒细胞的数量进行记录；通过spss软件分析相关数据。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于乳腺癌预后诊断的试剂盒，本发明试剂盒主要用于检测肿瘤实质中中性粒细胞的浸润情况，中性粒细胞的浸润情况与乳腺癌患者预后有着强烈相关性，中性粒细胞的浸润情况可以作为乳腺癌患者预后的指标；本发明试剂盒具有以下优点：1)适用于所有乳腺癌患者；2)检测方便，检测指标与预后有着明显相关，检测指标单一，操作简单；3)所有试剂大多较为常见，成本控制在可行范围内。

附图说明

图1显示肿瘤实质中中性粒细胞的浸润情况；其中，黑色椭圆仅圈出部分中性粒细胞；

图2显示中性粒细胞的浸润情况与患者生存率的关系，其中纵坐标disease-freesurvival表示无病生存率，纵坐标overallsurvival表示总体生存率；每个小图中上方的曲线的样本均来源于肿瘤实质浸润了较少中性粒细胞的患者，每个小图中下方的曲线的样本均来源于肿瘤实质浸润了较多中性粒细胞的患者；曲线括号后面数字表示样本的数量；

图3显示肿瘤细胞迁移和侵袭的情况；其中，空白对照是指肿瘤细胞中不与其他细胞共培养；

图4统计共培养后，发生迁移和侵袭的肿瘤细胞数量；其中，mcf-7、mb-231和bt-474为3种乳腺癌细胞，-表示肿瘤细胞没有与其共培养，neu表示肿瘤细胞中加入中性粒细胞，tins表示肿瘤细胞中加入肿瘤实质浸润的中性粒细胞(以下类同)；***表示差异非常显著；

图5统计中性粒细胞的timp-1的表达量；其中，**表示差异显著；***表示差异非常显著；

图6显示重组timp-1(rtimp-1)对mcf-7细胞中e-cadherin(钙黏附蛋白e)和vimentin(波形蛋白)表达量的影响；-表示mcf-7细胞中为未加入rtimp-1；

图7显示timp-1中和抗体对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响；其中，ctrl表示肿瘤细胞单独培养，tins共培养表示肿瘤细胞中加入肿瘤实质浸润的中性粒细胞，-表示没加入其他组分，igg表示肿瘤细胞培养时还加入igg，timp-1中和抗体表示肿瘤细胞培养时还加入timp-1中和抗体；

图8显示timp-1中和抗体显著抑制小鼠乳腺癌细的转移；其中，图片模糊不清楚之处表示乳腺癌细胞的转移；

图9统计肺、肝中乳腺癌细胞的光通量；其中，**表示差异显著；

图10显示病患乳腺癌组织中核染、timp-1染色和cd66b染色的结果；其中，high表示timp-1的表达量较多，low表示timp-1的表达量较少；

图11显示timp-1的表达量与患者生存率的关系；其中，每个小图中上方的曲线的样本均来源于肿瘤实质浸润的中性粒细胞表达较少timp-1的患者，每个小图中下方的曲线的样本均来源于肿瘤实质浸润的中性粒细胞表达较多timp-1的患者；曲线括号后面数字表示样本的数量；

图12显示病患乳腺癌组织中e-cadherin染色、cd90染色和ck染色的结果；

图13显示肿瘤细胞的cd90表达量与患者生存率的关系，其中纵坐标disease-freesurvival表示无病生存率，纵坐标overallsurvival表示总体生存率；每个小图中上方的曲线的样本均来源于肿瘤实细胞表达较少cd90的患者，每个小图中下方的曲线的样本均来源于肿瘤实细胞表达较多cd90的患者；曲线括号后面数字表示样本的数量；

图14显示cd90中和抗体显著抑制小鼠乳腺癌细的转移；其中，乳腺癌细胞的转移已圈出；

图15显示统计肺、肝中乳腺癌细胞的转移灶数量；其中，***表示差异非常显著。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附表和附图对本发明作进一步说明。

需要说明书的是，本发明未提及到实验方法均为常规实验方法；另外，本发明用于抗体分为结合抗体和中和抗体，用于检测抗原分布情况的抗体是结合抗体，用作为药物的抗体是中和抗体。

肿瘤实质中中性粒细胞的浸润情况与预后相关

收集医院乳腺癌患者癌组织标本，标本经病理诊断确诊为乳腺癌。经过脱水、包埋、切片等步骤制成组织切片；病理切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭非特异位点等步骤，组织切片依次与cd66b一抗和cd66b二抗进行孵育处理；然后，对切片进行显色，记录肿瘤实质中cd66b阳性的中性粒细胞的数量。

如图1所示，肿瘤实质中浸润有中性粒细胞。如图2所示，来自中山大学孙逸仙纪念医院和汕头大学附属第一医院341例患者中cd66b阳性的中性粒细胞，分别在试验组(170例患者)、内部验证组(171例患者)和外部验证组(105例患者)中分析了肿瘤实质中性粒细胞的数量与临床结局的关系，试验组为：95％cihr＝2.88-8.68，p<0.001；内部验证组为95％cihr＝2.07-6.14，p<0.001；外部验证组为：95％cihr＝2.27-11.33，p<0.001；由此可见，肿瘤实质浸润的中性粒细胞数量与预后明显相关：肿瘤实质中浸润的中性粒细胞越少，患者生存率越高。

中性粒细胞促进乳腺癌细胞迁移与侵袭

如图3和图4所示，通过transwell梯度血清浓度的迁移实验，发现在相同的时间内，与肿瘤实质浸润的中性粒细胞共培养后的肿瘤细胞更快更多地穿过transwell，获得了更强的迁移能力，这提示肿瘤实质浸润的中性粒细胞促进了乳腺癌细胞的迁移；另外侵袭实验得到了同样的结果：肿瘤实质浸润的中性粒细胞促进了乳腺癌细胞的侵袭。

肿瘤实质浸润的中性粒细胞timp-1(中性粒细胞基质金属蛋白酶抑制物)的表达显著升高

收集医院乳腺癌患者癌组织标本，将肿瘤实质浸润的中性粒细胞分离培养，取培养的上清检测timp-1。如图5所示，与未处理的正常人外周血中性粒细胞以及未发生emt(上皮间质转化)的乳腺癌细胞mcf-7共培养的中性粒细胞的相比，肿瘤实质浸润的中性粒细胞上清的timp-1含量显著高。

肿瘤实质浸润的中性粒细胞释放的timp-1能够促进肿瘤细胞发生emt

如图6所示，用timp-1重组蛋白处理乳腺癌细胞mcf-7，mcf-7细胞发生显著的上皮化改变：e-cadherin表达降低、vimentin表达上升；如图7所示，与未经处理/igg处理的发生emt的肿瘤细胞相比，timp-1中和抗体处理后，肿瘤细胞迁移、侵袭能力明显降低。

timp-1中和抗体抑制小鼠乳腺癌细胞转移至肺、肝中

如图8和图9所示，在乳腺癌balb/c荷瘤小鼠中，与未处理及igg处理小鼠相比，采用timp-1中和抗体处理后，小鼠肺、肝转移中乳腺癌细胞显著减少，timp-1中和抗体明显抑制了乳腺癌转移至肺、肝中。

肿瘤实质浸润的中性粒细胞timp-1的表达情况与乳腺癌预后相关

收集医院乳腺癌患者癌组织标本，标本经病理诊断确诊为乳腺癌。经过脱水、包埋、切片等步骤制成组织切片；病理切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭非特异位点等步骤，通过cd66b一抗、timp-1一抗与组织切片孵育；切片相继与相应种属的免疫组化二抗、dapi孵育，记录肿瘤细胞cd66b和timp-1的表达变化情况。如图10和图11所示，通过分析timp-1高表达患者及生存情况，发现timp-1与预后明显相关：肿瘤实质浸润的中性粒细胞表达越少的timp-1，患者生存率越高。

肿瘤细胞cd90(细胞黏附分子免疫球蛋白超家族的成员)的表达情况与肿瘤细胞emt程度相关，同时与预后相关

收集医院乳腺癌患者癌组织标本，标本经病理诊断确诊为乳腺癌。经过脱水、包埋、切片等步骤制成组织切片；病理切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭非特异位点等步骤，通过cd90一抗(结合抗体)、e-cadherin一抗(结合抗体)、ck(细胞角蛋白)一抗(结合抗体)与组织切片孵育；切片相继与相应种属的免疫组化二抗、dapi孵育，记录肿瘤细胞e-cadherin、cd90的表达变化情况。如图12和图13所示，通过分析cd90高表达患者及生存情况，发现cd90与预后明显相关：低表达cd90患者的生存率更高。

乳腺癌荷瘤小鼠中使用cd90中和抗体，可明显抑制乳腺癌细胞转移至肺、肝中

如图14和图15所示，在乳腺癌balb/c荷瘤小鼠中，与未处理及igg处理小鼠相比，采用cd90中和抗体处理后，小鼠肺、肝转中乳腺癌细胞转移量显著减少，cd90中和抗体明显抑制了乳腺癌转移至肺、肝转中。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。