固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法与流程

本发明属于水环境污染物的检测技术领域，涉及一种水产养殖水体中同时检测痕量15种常用抗生素的检测方法，尤其涉及一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法。

背景技术：

水产养殖中使用抗生素治疗和预防细菌性病害始于20世纪50年代。随着水产养殖业的迅速发展，养殖过程中病害的发生频率越来越高，抗生素作为兽药的使用范围和用量日益増大。随着养殖者们对水产养殖的经济利益追求和水生生物耐药性的增加，抗生素的使用剂量不断提高，甚至以不合理的高剂量使用。

滥用抗生素的不良影响和对人类的危害显现越来越严重的趋势，并逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点问题。据统计，我国每年大约有750-1000t金霉素、500-700t土霉素、400t诺氟沙星、100t环丙沙星、15t氧氟沙星用于动物的饲料添加剂。已有研究表明，2003年，我国磺胺类抗生素的总产量突破2000t，其中大约有4500t作为兽药在中国境内使用。可以看出，目前我国养殖业中抗生素类药物的使用数量相当惊人。在高密度的水产养殖业内，水产养殖过程中使用的抗生素70-80％最终进入水环境。

随着人类对于水环境安全问题的日益重视，有关环境水体中抗生素残留检测的专利和论文已有公开发表，但这些研究多针对某一类或两三类抗生素的同步分析并且所分析抗生素的总数量最不多。然而抗生素的种类数量繁多，关于多种类多数量抗生素残留的分离富集和同步分析方法的建立显得颇为重要。

高效液相色谱串联质谱法在定量分析时可以根据特征离子和由此特征离子断裂产生的特征碎片作为某一目标化合物的指纹，将它从复杂机制的混合物样品中筛选出来进行定量，保证了检测的准确度和精确度。

随着抗生素在水产养殖过程中大量使用，对于能够快速、灵敏、准确地测定各种水产养殖水体中尽可能多的抗生素残留存在迫切需要。然而，目前针对水产养殖水体中多种抗生素的分离富集和共检测尚无一套完整可靠的检测方法，现有的检测方法普遍存在不稳定、干扰多、检测抗生素的数量和种类有限、回收率有限等问题，因此，急需一种检测结果稳定、干扰小，能够快速、高效、灵敏、准确，同时检测出水产养殖水体中尽可能多的抗生素残留的包括分离富集和共检测的完整可靠的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的旨在：克服现有技术存在的不稳定、干扰多、检测抗生素数量和回收率有限等问题的不足，提供一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时检测水产养殖水体种残留的15种典型抗生素的方法，即一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法。

本发明的技术构思如下：

本发明的方法采用固相萃取(spe)前处理结合高效液相色谱串联质谱技术(spe-hplc-ms/ms)，通过前处理过程的优化、液相色谱条件和质谱条件的优化，最终能够实现准确、稳定，干扰小、快速并高效地对水产养殖水样品中15种典型抗生素的同时富集和定量测定。该方法采用单因素实验，筛选合适的固相萃取柱，并对固相萃取富集过程中活化方法、淋洗方法、洗脱方法进行了优化，可一次性同时检测出15种抗生素的残留情况，具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点。该方法将指示回收率的内标物加在固相萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果真实可靠。该方法可为水产养殖水体中残留的抗生素，包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、甲氧苄啶、喹乙醇、磺胺甲恶唑、阿莫西林、呋喃唑酮、环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星、金霉素、土霉素和盐酸多西环素15种抗生素，提供有效准确的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法，该方法包括：(1)水样的预处理，在目标物富集前加入内标物指示回收率；(2)使用固相萃取柱富集净化目标抗生素；(3)采用内标法，使用液质联用仪定量检测水产养殖水体中15种抗生素的含量。

本发明一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法，具体按如下步骤进行：

(1)水样的预处理

水样经滤膜过滤除去悬浮物后，分别加入磺胺甲噁唑-¹³c6、甲氧苄啶-d3、青霉素g钾盐-d5、诺氟沙星-d5、四环素-d6、喹乙醇-d4、阿莫西林-¹³c6这七种指示回收率的内标物；调节水样ph；

(2)固相萃取富集目标抗生素：

依次用甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱；将步骤(1)中处理过的水样过已活化的固相萃取柱；富集完成后用淋洗液淋洗固相萃取柱并真空干燥；再用一定体积的洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液并在氮气流下吹干，所得残渣重新溶解，定容；过滤后转移至棕色进样瓶中，待测；

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水体中七类15种抗生素的含量

将步骤(2)中待测样品，采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测棕色进样瓶内从水体富集到的15种抗生素的含量；所述的15种抗生素包括水产养殖常用或被禁用的物质，包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、甲氧苄啶、喹乙醇这七类抗生素；15种抗生素分别为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、甲氧苄啶、喹乙醇、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、呋喃唑酮、环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星、金霉素、土霉素和盐酸多西环素。

进一步地，步骤(1)中，固相萃取前分别加入100ng/l的磺胺甲噁唑-¹³c6、甲氧苄啶-d3、青霉素g钾盐-d5、诺氟沙星-d5、四环素-d6、喹乙醇-d4和阿莫西林-¹³c6这七种内标物指示回收率。

进一步地，步骤(1)中，水样经玻璃纤维滤膜过滤除去颗粒状悬浮物后，先加入指示回收率的内标物，再用稀盐酸调节ph值至3左右，ph值大致范围在3±0.1。

更进一步地，步骤(1)中，样品过滤采用孔径为0.7μmwhatmangf/f系列玻璃纤维滤膜。其目的是过滤去除颗粒悬浮物质，防止影响后续对目标物的富集和检测。

进一步地，上述步骤(2)中，浓缩富集样品所用的固相萃取柱是waters公司oasishlb小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。

更进一步地，上述步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍，活化固相萃取柱的流速控制在1-4ml/min；水样过柱流速(水样上样速度)控制在3-5ml/min；淋洗萃取柱所用的纯水和低浓度甲醇水溶液各为萃取柱体积的1-2倍；淋洗后的抽干，时间为2min；洗脱固相萃取柱所用的洗脱溶剂为甲醇，甲醇洗脱溶剂的量为萃取柱体积的2倍，洗脱液流速控制在4-5ml/min。

更进一步地，上述步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于5％的甲醇-水溶液，目的是去除杂质，减少噪声干扰。

更进一步地，上述步骤(2)中，洗脱固相萃取柱所用的甲醇采用hplc级甲醇洗脱，结束后真空将柱子里残留的甲醇收集。洗脱后，洗脱液在水浴加热40℃条件下氮吹至近干。

更进一步地，上述步骤(2)中，采用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容，超声2min后用针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测，针式滤器选用孔径为0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

进一步地，上述步骤(3)中，选用美国waters公司的waterstq-smicro高效液相色谱串联质谱仪对15种目标抗生素进行检测；液相色谱的色谱柱选用acquitybehc18型号柱2.1×100mm，1.7μm。

进一步地，上述步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温35℃；进样量2μl；进样室温度10℃；流动相流速0.25ml·min^-1；流动相a是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液，其中的水为milli-q超纯水；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0-2.2min，16％b；2.2-2.5min，16％b-95％b；2.5-5.5min，95％b；5.5-6.0min，95％b-16％b；6.0-10.0min，16％b。

进一步地，上述步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式mrm进行检测；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速度为1000l/hr，锥孔电压为30v，毛细管电压为3.5kv，扫描时间为0.1s。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种采用固相萃取前处理结合高效液相色谱串联质谱技术(spe-hplc-ms/ms)同时检测水产养殖水体中残留的15种典型抗生素的方法。该方法通过筛选合适的固相萃取柱，并对固相萃取富集过程中活化方法、淋洗方法、洗脱方法进行了优化，最终能够实现灵敏度高、选择性好、准确度高，该方法适合实际水产养殖水体中残留抗生素的测定。

本发明的方法具有以下优点：

(1)本发明的方法选择waters公司oasishlb固相萃取柱对15种抗生素进行富集净化，去除了干扰杂质，降低了基质效应，提高了选择性和富集倍数；回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标抗生素有效分离富集的目的。

(2)本发明采用内标法定量，测定抗生素的浓度更准确，线性关系好，相对标准偏差小，提高了检测分析的精密度。

(3)本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在固相萃取过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用磺胺甲噁唑-¹³c6作为磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑)的内标物，选用诺氟沙星-d5作为喹诺酮类抗生素(环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星)的内标物，选用四环素-d6作为四环素类抗生素(金霉素、土霉素、盐酸多西环素)的内标物，选用青霉素g钾盐-d5作为硝基呋喃类抗生素(呋喃唑酮)的内标物，选用甲氧苄啶-d3作为甲氧苄啶的内标物，选用喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物，选用阿莫西林-¹³c6作为β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。

而现有的有机污染物质残留微量抗生素检测方法中，四环素类和β-内酰胺类抗生素并没有对应的内标物质，一般是选用诺氟沙星-d5作为内标物质，这样检测出的结果会有一些偏差。现有的微量抗生素检测方法中，喹乙醇的检测，通常以乙酰苯胺作为内标物质，其检测结果不如本发明中以喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物的检测结果准确。

(4)本发明的检测方法，一次上机进样可以同时检测出水产养殖水体中的多种抗生素(15种抗生素)，检测过程耗时少(耗时10min)，检测的精确度和灵敏度高，检出限低，可以检测出环境水体中痕量抗生素的残留情况；同时，本发明方法还具有较高回收率，相对标准偏差较小，这说明本申请的前处理方法及检测方法可靠且重复效果好。

(5)本发明的检测方法操作简便，有机试剂使用量少，环境毒性低。

(6)本发明的检测方法，在现有的固相萃取-液相色谱串联质谱法同时检测水体中多种类抗生素的检测方法的基础上，针对水产养殖水体中常用或禁用的15种抗生素作为目标(这15种抗生素中包含了新增的磺胺甲基嘧啶、甲氧苄啶、喹乙醇、呋喃唑酮、诺氟沙星、金霉素、土霉素和盐酸多西环素这八种抗生素)，该检测方法通过优选内标物，以及优化检测条件，能够一次性同时检测出水产养殖水体中包含了新增的八种抗生素在内的15种抗生素，并且，该检测方法内标物回收率更高，数据结果更真实可靠。

附图说明

图1是使用三种不同洗脱溶剂测得水体中15种抗生素的加标回收率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：固相萃取洗脱溶剂选择

采用内标法，确定本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术的检测方法中的洗脱溶剂，测得三种不同洗脱溶剂对水产养殖水体中15种抗生素的加标回收率。加标回收率实验以自来水为样品：分别向样品中添加10μl的抗生素混合标准溶液(该抗生素混合标准溶液为15种抗生素的混合标准溶液，其中，15种抗生素的浓度分别为10mg/l)。

本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法，具体按以下步骤实施：

步骤一、水样预处理

设立三组实验。每组样品设空白样和加标样，样品设三个平行。分别准确量取1l水样于洁净烧杯中。加标样品按上述添加量分别加入抗生素混合标准液，即分别向水样中添加10μl的浓度为10mg/l的抗生素混合标准液，使添加到水体中的抗生素的最终浓度为100ng/l。另设空白组(空白组不添加任何抗生素)。

固相萃取前，分别向样品中加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³c6、甲氧苄啶-d3、青霉素g钾盐-d5、诺氟沙星-d5、四环素-d6、喹乙醇-d4和阿莫西林-¹³c6这七种指示回收率的内标物，与水样充分混合均匀。即：分别选用磺胺甲噁唑-¹³c6作为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、喹乙醇、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶的内标物，选用甲氧苄啶-d3作为甲氧苄啶的内标物，选用青霉素g钾盐-d5作为呋喃唑酮的内标物，选用诺氟沙星-d5作为环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星和恩诺沙星的内标物，选用四环素-d6作为金霉素、土霉素和盐酸多西环素的内标物，选用喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物，选用阿莫西林-¹³c6作为β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)的内标物。

加标后样品充分混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤除去颗粒状悬浮物，然后用稀盐酸调节ph至3左右。

步骤二、固相萃取富集目标抗生素

以下固相萃取过程利用全自动固相萃取仪完成，所用的固相萃取柱是waters公司oasishlb小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。固相萃取过程如下：

依次用5ml甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取小柱，流速为4ml/min。预处理后的1000ml水样以5ml/min的速度过柱，上样结束后，依次用6ml超纯水和等体积的体积浓度为5％的甲醇-水溶液以4ml/min的速度淋洗萃取柱，真空干燥。最后用10ml的洗脱溶剂洗脱，洗脱溶剂分别为乙腈、甲醇和乙酸乙酯(均为hplc级)，流速控制在4ml/min，洗脱液收集至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所获残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1ml，超声2min，经0.22μmptfe针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。

步骤三、高效液相色谱串联质谱法测定水体中15种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的水样品中15种抗生素的浓度。

选用美国waters公司的waterstq-smicro高效液相色谱串联质谱仪对15种目标抗生素进行检测；液相色谱的色谱柱选用acquitybehc18型号柱2.1×100mm，1.7μm。

液相色谱分离参数为：色谱柱柱温35℃；进样量2μl；进样室温度10℃；流动相流速0.25ml·min-1；流动相a是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液，其中的水为milli-q超纯水；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0-2.2min，16％b；2.2-2.5min，16％b-95％b；2.5-5.5min，95％b；5.5-6.0min，95％b-16％b；6.0-10.0min，16％b。

质谱检测条件为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式mrm进行检测；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速度为1000l/hr，锥孔电压为30v，毛细管电压为3.5kv，扫描时间为0.1s。

实验测得采用三种不同洗脱溶剂(乙腈、甲醇和乙酸乙酯)的回收率见图1，从图1可看出用甲醇作为固相萃取步骤中洗脱溶剂的回收率最佳。因此，在水产养殖水体抗生素实际检测中，可选用甲醇作为固相萃取步骤中的洗脱溶剂。

实施例2：加标回收率实验

采用内标法，检验按本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术的检测方法测得的水产养殖水体中15种抗生素的加标回收率。加标回收率实验以自来水为样品：分别向样品中添加10μl、20μl的抗生素混合标准溶液(该抗生素混合标准溶液为15种抗生素的混合标准溶液，其中，15种抗生素的浓度分别为10mg/l)。

本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测水产养殖水体中15种抗生素的方法，具体按以下步骤实施：

步骤一、水样预处理

设立三种加标浓度(三组样品)。每组样品设两个平行，分别准确量取1l水样于洁净烧杯中。其中两组样品，按上述添加量分别加入抗生素混合标准液，即分别向水样中添加10μl、20μl的浓度为10mg/l的抗生素混合标准液，使添加到水体中的抗生素的最终浓度分别为100ng/l和200ng/l。第三组样品设为空白组(空白组不添加任何抗生素)。

固相萃取前，分别向样品中加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³c6、甲氧苄啶-d3、青霉素g钾盐-d5、诺氟沙星-d5、四环素-d6、喹乙醇-d4和阿莫西林-¹³c6这七种指示回收率的内标物，与水样充分混合均匀。即：分别选用磺胺甲噁唑-¹³c6作为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、喹乙醇、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶的内标物，选用甲氧苄啶-d3作为甲氧苄啶的内标物，选用青霉素g钾盐-d5作为呋喃唑酮的内标物，选用诺氟沙星-d5作为环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星和恩诺沙星的内标物，选用四环素-d6作为金霉素、土霉素和盐酸多西环素的内标物，选用喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物，选用阿莫西林-¹³c6作为β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)的内标物。

加标后样品充分混合均匀，经玻璃纤维滤纸过滤除去颗粒状悬浮物，然后用稀盐酸调节ph至3左右。

步骤二、固相萃取富集目标抗生素

以下固相萃取过程利用全自动固相萃取仪完成，所用的固相萃取柱是waters公司oasishlb小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。固相萃取过程如下：

依次用5ml甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取小柱，流速为4ml/min。预处理后的1000ml水样以5ml/min的速度过柱，上样结束后，依次用6ml超纯水和等体积体积浓度为5％的甲醇-水溶液以4ml/min的速度淋洗萃取柱，真空干燥。最后用10ml的甲醇(hplc级甲醇)洗脱，流速控制在4ml/min，洗脱液收集至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所获残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1ml，超声2min，经0.22μmptfe针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。

步骤三、高效液相色谱串联质谱法测定水体中15种抗生素的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的水样品中15种抗生素的浓度。

选用美国waters公司的waterstq-smicro高效液相色谱串联质谱仪对15种目标抗生素进行检测；液相色谱的色谱柱选用acquitybehc18型号柱2.1×100mm，1.7μm。

液相色谱分离参数为：色谱柱柱温35℃；进样量2μl；进样室温度10℃；流动相流速0.25ml·min^-1；流动相a是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液，其中的水为milli-q超纯水；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0-2.2min，16％b；2.2-2.5min，16％b-95％b；2.5-5.5min，95％b；5.5-6.0min，95％b-16％b；6.0-10.0min，16％b。

质谱检测条件为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式mrm进行检测；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速度为1000l/hr，锥孔电压为30v，毛细管电压为3.5kv，扫描时间为0.1s。

考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同的程度的损失，所以，分别选用磺胺甲噁唑-¹³c6作为磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑)的内标物，选用诺氟沙星-d5作为喹诺酮类抗生素(环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星)的内标物，选用四环素-d6作为四环素类抗生素(金霉素、土霉素、盐酸多西环素)的内标物，选用青霉素g钾盐-d5作为硝基呋喃类抗生素(呋喃唑酮)的内标物，选用甲氧苄啶-d3作为甲氧苄啶的内标物，选用喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物，选用阿莫西林-¹³c6作为β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。考虑内标物质本身性质比较稳定，在正电喷雾电离源(esi+)模式下响应良好且无明显基质干扰。

回收率计算：

采用步骤一至步骤二的前处理方法进行前处理，采用步骤三的方法进行定量检测，对水产养殖水样进行加标回收率计算，计算结果见表1。

加标回收率(re％)的计算公式为：

其中，re：加标回收率，％；

c0：混合标准液的浓度，ng/l；

c1：未加入混合标准液的水样的检测浓度，ng/l；

c2：加入混合标准溶液的水样的检测浓度，ng/l；

v0：混合标准液的体积，l；

v1：未加入混合标准液的水样上机前定容体积，l；

v2：加入混合标准溶液的水样上机前定容体积，l。

由此可见，按本发明的方法测得的水样中15种抗生素的加标回收率在60％-120％，加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。

表1.水样中抗生素的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率

实施例3：实际水产养殖水样抗生素含量测定

15种抗生素在两个水产养殖场中的浓度的测定

采集上海市某养蟹场、养虾场的水样，先采用本发明步骤一的方法进行样品预处理，再采用本发明步骤二的固相萃取方法进行富集净化前处理，之后采用本发明步骤三的高效液相色谱串联质谱仪对样品的实际浓度进行检测分析，以此考察本发明的方法对不同水产养殖场的适用性。

具体检测过程如下：

(1)水样预处理

每个样品设三个平行，分别准确量取1000ml水样于洁净烧杯中，经玻璃纤维滤膜过滤除去颗粒状悬浮物，然后用稀盐酸调节ph至3左右。

固相萃取前分别向样品中加入100ng的磺胺甲噁唑-¹³c6、甲氧苄啶-d3、青霉素g钾盐-d5、诺氟沙星-d5、四环素-d6、喹乙醇-d4和阿莫西林-¹³c6这七种指示回收率的内标物，与水样充分混合均匀。即：分别选用磺胺甲噁唑-¹³c6作为磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑)的内标物，选用诺氟沙星-d5作为喹诺酮类抗生素(环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星)的内标物，选用四环素-d6作为四环素类抗生素(金霉素、土霉素、盐酸多西环素)的内标物，选用青霉素g钾盐-d5作为硝基呋喃类抗生素(呋喃唑酮)的内标物，选用甲氧苄啶-d3作为甲氧苄啶的内标物，选用喹乙醇-d4作为喹乙醇的内标物，选用阿莫西林-¹³c6作为β-内酰胺类抗生素(阿莫西林)的内标物。

(2)固相萃取富集目标抗生素

依次用5ml甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱，流速控制在4ml/min。预处理后的1000ml水样以5ml/min的速度过柱，上样完成后依次用6ml超纯水和等体积浓度为5％的甲醇-水溶液以4ml/min的速度淋洗固相萃取柱，真空干燥。最后用10ml的甲醇(hplc级甲醇)洗脱，流速控制在4ml/min，洗脱液收集至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所得残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1ml，超声2min后，经0.22μmptfe针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。

其中，浓缩富集样品采用的固相萃取柱是waters公司oasishlb小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。

(3)高效液相色谱串联质谱法测定水体中15种抗生素的含量

采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测棕色进样瓶内从水体富集到的15种抗生素。所述的15种抗生素是指水产养殖常用或被禁用的物质，包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类、硝基呋喃类、甲氧苄啶、喹乙醇这七类抗生素；15种抗生素分别为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、甲氧苄啶、喹乙醇、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、呋喃唑酮、环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星、恩诺沙星、金霉素、土霉素和盐酸多西环素。

选用美国waters公司的waterstq-smicro高效液相色谱串联质谱仪对15种目标抗生素进行检测；液相色谱的色谱柱选用acquitybehc18柱(2.1×100mm，1.7μm)。

液相色谱分离参数为：色谱柱柱温35℃；进样量2μl；进样室温度10℃；流动相流速0.25ml·min^-1；流动相a是体积浓度为0.5％的甲酸-水溶液，其中的水为milli-q超纯水；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0-2.2min，16％b；2.2-2.5min，16％b-95％b；2.5-5.5min，95％b；5.5-6.0min，95％b-16％b；6.0-10.0min，16％b。

质谱检测条件为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式mrm进行检测；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速度为1000l/hr，锥孔电压为30v，毛细管电压为3.5kv，扫描时间为0.1s。

实际检测所得两种水产养殖场中15种抗生素含量如表2所示。实验结果表明，本发明的方法可以应用到养蟹场和养虾场的抗生素含量的测定，具有灵敏度高、稳定性高且重现性好的优点。

表2两种水产养殖水样中15种抗生素的检测含量

注：“nd”表示未检出。