一种用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法与流程

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法。

背景技术：

内分泌干扰化学物质(edcs)是指一种外源性化学物质，它会造成生殖系统，免疫系统，动物和人类神经系统的异常，以及导致某些肿瘤的发病率增高。根据edcs的结构特征，可分为多氯联苯(pcbs)，邻苯二甲酸盐，酚类，重金属，有机锡等。其中，酚类内分泌干扰物主要包括4-正壬基酚(np)，4-正辛基酚(op)和双酚类(bp)，它们广泛用作食品包装材料生产和合成中的表面活性剂和增塑剂。

现代色谱技术由于它们检出限低，速度快，灵敏度高，操作方便，在酚类内分泌干扰物测定方面备受欢迎。在实际饮料样品的分析过程中，直接采用仪器进行分析比较困难，因此选择合适，快速，简单的样品前处理方法对于分析饮料中的酚类内分泌干扰物至关重要。

磁性固相萃取(mspe)已被作为一种新的样品前处理技术，用于富集和测定痕量污染物。在磁性固相萃取程序中，目标分析物被直接置于样品溶液中的磁性吸附剂吸附，然后磁性吸附剂可以通过使用外部磁铁从悬浮液中快速分离而无需过滤或离心，最后分析物被洗脱用于分析。磁固相萃取的吸附剂是其核心部分，决定着相应分析方法的选择性、灵敏度以及应用范围。对于磁固相微萃取来说，当前迫切需要发展廉价、高选择性和寿命长的吸附剂用于高效分离富集目标污染物。

共价有机骨架(cofs)是一种具有共价键合结构单元的多孔结晶聚合物，自2005年首次报道以来，许多研究人员对它们给予了极大的关注。cof与mof以及其他新材料相比，由于其具有良好的性能，如可调孔径，较大的孔径和规则的孔隙率，低晶体密度，以及良好的结构稳定性，被广泛应用于催化，储气，光电子，色谱分离，化学传感器等领域。

技术实现要素：

本发明主要目的是提供一种用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法。本发明采用核-壳结构的磁性共价有机骨架微球为固相萃取吸附剂，基于磁固相萃取和液相色谱技术，建立一种灵敏分析饮料中痕量酚类内分泌干扰物的新方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种核-壳结构的磁性共价有机骨架微球，所述核-壳结构的磁性共价有机骨架微球由以下方法制备得到：

s1.将fecl3·6h2o，na3co2·2h2o和乙酸钠溶解在乙二醇中，搅拌均匀后，将溶液转移至高压釜中，加热至200℃持续12小时；反应后，将得到的磁性纳米fe3o4颗粒分别用乙醇和去离子水超声洗涤数次，然后在50℃下真空干燥备用；

s2.将步骤s1制备得到的磁性纳米fe3o4颗粒，1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和对苯二甲醛溶于二甲基亚砜，超声处理5分钟，并缓慢加入乙酸，温育30分钟后，收集产生的棕色沉淀物，然后用无水四氢呋喃和无水甲醇洗涤三次，在室温下真空干燥，即得。

本发明第二个方面，提供以上所述核-壳结构的磁性共价有机骨架微球在检测酚类内分泌干扰物中的应用。

优选的，以上所述核-壳结构的磁性共价有机骨架微球在检测饮料中酚类内分泌干扰物中的应用。

本发明第三个方面，提供一种用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法，采用以上所述核-壳结构的磁性共价有机骨架微球为吸附剂，结合磁固相萃取和液相色谱-荧光分析技术进行检测分析。

优选的，所述用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法，具体的包括以下步骤：

(1)样品预处理；

(2)磁固相萃取，在玻璃瓶中加入步骤(1)处理后的样品，调整样品ph为2-12，加入权利要求1所述核-壳结构的磁性共价有机骨架微球吸附剂，调整溶液离子强度，离子强度为0～20％的nacl，水浴振荡提取，将吸附剂与水相分离，并弃去清液；将洗脱液加入到分离出的吸附剂中，超声处理后重复洗脱，将洗脱的溶液混合、干燥后用洗脱液溶解，即得磁固相萃取样品；

(3)将步骤(2)制备得到的磁固相萃取样品进行液相色谱-荧光检测。

优选的，步骤(1)样品预处理，具体为：将样品在4-10℃下以5000-10000rpm离心10-20分钟以除去沉淀物，然后通过0.22-μm微孔膜过滤，取上清液。将加工过的茶饮料样品储存在的干净棕色玻璃瓶中，保存在4℃条件下，用于随后的磁固相萃取过程。

优选的，步骤(2)中，洗脱液为正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲醇和乙醇中任意一种；所述洗脱液用量为2-12ml。

优选的，步骤(2)中提取时间为10～60min，吸附剂用量为10-80mg。

优选的，步骤(3)所用色谱柱c8柱：150mm×2.1mm，5μm；柱温箱：35℃；流速：1ml/min；进样体积为20μl。

优选的，步骤(3)流动相为：hplc级水a和乙腈b；采用梯度洗脱：0分钟，40％b；24分钟，80％b；28分钟，80％b；28.2分钟，45％b和30分钟，45％b；荧光检测器的设置如下：激发波长220nm，发射波长315nm。

本发明制备得到的磁性共价有机骨架微球有较大的比表面积和较大的孔体积，同时在不同ph值的水溶液和有机溶剂中化学性质极为稳定性。本发明首次将制备得到的核-壳结构的磁性共价有机骨架微球作为固相萃取吸附剂用于对饮料样品中酚类内分泌干扰物的测定。在固相萃取过程中，本发明对萃取液种类、用量，样品溶液离子强度，样品ph值，吸附时间以及吸附剂用量等重要影响因素条件进行了优化，大大提高了对饮料样品中酚类内分泌干扰物检测的灵敏度。

本发明取得的有益效果：

(1)本发明建立了一种灵敏分析饮料中痕量酚类内分泌干扰物的新方法，本方法对饮料中酚类内分泌干扰物最低检测限可达0.08ngml^-1，线性范围为0.5-1000ngml^-1，并且本发明方法重复性好。

(2)本发明采用核-壳结构的磁性共价有机骨架微球作为磁性固相萃取的吸附剂，本发明吸附剂制备方法简单，选择性灵敏，可以重复使用20次以上且依旧保持极高的萃取效率。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1(a)fe3o4微球在25000倍放大倍数下的tem图像；(b)磁性共价有机骨架微球的放大倍数为25000倍的tem图像；(c)tapb，tpa，fe3o4和磁性共价有机骨架微球的ft-ir光谱；(d)空气中fe3o4和磁性共价有机骨架微球的xrd图谱；(e)磁性共价有机骨架微球微球在空气中，在甲醇中，在1mol·l^-1hcl中24小时，在1mol·l^-1naoh中24小时和在水中24小时的ft-ir光谱；(f)fe3o4和磁性共价有机骨架微球的磁化曲线；(g)fe3o4和磁性共价有机骨架微球的n2吸附-解吸等温线；(h)fe3o4和磁性共价有机骨架微球的孔径分布。

图2不同实验条件对实验效果的影响：(a)萃取液种类，(b)萃取液体积，(c)样品体积，(d)ph值，(e)萃取时间，(f)离子强度。

图3绿茶饮料样品的色谱-质谱图：加标100ng·ml^-1(a)，50ng·ml-1(b)，5ng·ml^-1(c)和空白绿茶饮料样品(d)；(1)bpa，(2)bpaf，(3)op，(4)np。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

药品和试剂

双酚a(bpa)和双酚af(bpaf)购自阿拉丁试剂化学有限公司(中国上海)。4-正辛基酚(op)和4-正壬基苯酚(np)购自supelco公司(美国，宾夕法尼亚州，贝尔丰特)。六水合三氯化铁(fecl3·6h2o)，脱水柠檬酸钠(na3cit·2h2o)，二甲基亚砜(dmso)，四氢呋喃(thf)，乙二醇，乙酸，hplc级水，乙醇，4a型分子筛从国药试剂化学有限公司(中国上海市)购买。1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(tapb)和对苯二甲醛(tpa)购自上海麦克林生物化学技术有限公司(中国上海)。甲醇，丙酮和乙腈由从tedia公司(美国，俄亥俄州)购买。二氯甲烷和正己烷从康科德技术有限公司(中国天津)购买。在该实验中使用的所有其他试剂和化学品至少是分析纯级别的。通过将4种酚类溶解在10ml容量瓶中制备分别含有1mg·ml^-1的bpa，bpaf，op和np的储备溶液。一系列标准溶液通过用甲醇逐级稀释储备溶液获得。所有的溶液在使用之前需要在4℃条件下避光保存。

实施例1磁性纳米fe3o4和磁性共价有机骨架微球的制备

(1)磁性纳米fe3o4的制备

将fecl3·6h2o(8.1g)，na3co2·2h2o(1.5g)和乙酸钠(12.0g)溶解在乙二醇(200ml)中，然后剧烈搅拌。然后，将获得的均匀黄色溶液转移至高压釜中，然后加热至200℃持续12小时。反应后，将得到的fe3o4微球分别用乙醇和去离子水超声洗涤数次，然后在50℃下真空干燥备用。

(2)磁性共价有机骨架微球的制备

核-壳结构的磁性共价有机骨架微球的合成过程如下：用250ml三颈圆底烧瓶，将fe3o4(0.3g)，1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(0.212g)和对苯二甲醛(0.12g)溶于二甲基亚砜(dmso，120ml)中。并超声处理5分钟。随后，在超声处理的帮助下缓慢加入乙酸(35m，4ml)，在此过程中形成棕色沉淀物(fe3o4@cof)(约10分钟)。温育30分钟后，在磁铁的帮助下收集产生的棕色沉淀物，然后用无水四氢呋喃和无水甲醇洗涤三次。最后，在使用前将棕色沉淀物在室温下真空干燥。

通过tem观察制备的fe3o4和磁性共价有机骨架微球的高放大倍数形态(图1a和1b)。两幅图像均显示裸的fe3o4核的形状接近球形，平均直径为150-250nm。典型的核-壳结构已经形成，由fe3o4核和cofs壳组成，cofs壳的厚度约为25nm。

ft-ir红外光谱证实了磁性共价有机骨架微球的成功合成(图1c)。585cm^-1处的典型吸收带归因于fe-o-fe振动，3421，1640和1388cm^-1处的吸收带表明存在羧基。磁性共价有机骨架微球与赤裸的fe3o4核以及tapb和tpa单体相比，所制备的磁性共价有机骨架微球在1450-1600cm^-1和1610cm^-1处出现了新的特征峰，分别对应cof材料中的苯骨架和c＝n键的振动。此外，x射线衍射分析(xrd)(图1d)用于测定具有和不具有cof壳的fe3o4的晶体结构和相纯度。合成的磁性共价有机骨架微球的xrd与先前的报道一致，表明该材料已经成功合成。将fe3o4的xrd与磁性共价有机骨架微球进行比较，磁性共价有机骨架微球的xrd表明在约2.7°和19.5°处有宽的衍射峰，这可能是由于cof壳的低结晶度造成的。

磁性共价有机骨架微球在不同ph值的水溶液和有机溶剂中的化学稳定性对吸附和洗脱过程有很大影响，并决定新材料是否适合做mspe吸附剂，因此具有至关重要的意义。如图1e所示，在1mol·l^-1hcl和1mol·l^-1naoh的水溶液和有机溶剂中观察到的ft-ir红外光谱没有明显变化。这表明磁性共价有机骨架微球在不同的实验条件下是稳定的，这显然是由于聚亚胺连接骨架中的强的c＝n共价键。因此，磁性共价有机骨架微球可以作为一种合适的磁固相萃取吸附剂。

fe3o4和磁性共价有机骨架微球的磁滞回曲线显示在图1f中。两种样品表现出超顺磁性，磁性共价有机骨架微球的饱和磁化强度值为62.5emu·g^-1，尽管与裸fe3o4(81.5emu·g^-1)相比略有下降。磁性共价有机骨架微球具有很高的饱和磁化强度以及外部磁场敏感性。正如图1f的插图所示，它能够很好地分散在水中，形成棕色悬浮液。悬浮液非常均匀，过夜没有沉淀。然而，磁性共价有机骨架微球能够借助于外部磁铁从它们的均匀分散体中实现非常快速的聚集(约1分钟)，由此浑浊的溶液变得澄清。

由n2吸附等温线计算的磁性共价有机骨架微球的brunauer-emmett-teller比表面积为166.5m²·g^-1，孔体积为0.26cm³·g^-1。它们远远高于裸的fe3o4微球，其值分别为10.7m²·g^-1和0.11m³·g^-1(图1g和图1h)。磁性共价有机骨架微球的较大的比表面积(166.5m²·g^-1)和较大的孔体积(0.26m³·g^-1)使其比单独的fe3o4微球更适合作为磁固相萃取吸附剂。

实施例2一种用于分析饮料中酚类内分泌干扰物的方法

所述方法包括以下步骤：

(1)样品预处理

将样品在4℃下以10000rpm离心10分钟以除去沉淀物，然后通过0.22-μm微孔膜过滤，取上清液。将加工过的茶饮料样品储存在的干净棕色玻璃瓶中，保存在4℃条件下，用于随后的磁固相萃取过程。

(2)磁固相萃取

在玻璃瓶中加入25ml样品溶液，样品ph值为6，然后在溶液中加入40mg磁性共价有机骨架微球。将混合物在水浴振荡器中以300转/分钟在室温下摇动30分钟。随后，借助于位于玻璃瓶外部的磁铁将吸附剂与水相分离，并将上清液完全弃去。接下来，将3ml甲醇加入到分离的磁固相萃取吸附剂中，并通过超声处理3分钟并涡旋3分钟洗脱分析物。再次重复该解析作用。将洗脱的溶液混合并在30℃下氮吹干燥。最后，使用250μl甲醇溶解残余物。用过的磁性共价有机骨架微球在下次使用前用甲醇超声洗涤三次。

(3)液相色谱-荧光检测

使用配备有rf-20a荧光检测器(fld)(日本，岛津)的岛津lc-20a高效液相色谱(日本，岛津)进行分析。色谱柱c8柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温箱：35℃；流速：1ml/min；进样体积为20μl；流动相：(a)hplc级水和(b)乙腈。梯度洗脱为：(1)0分钟，40％b；(2)24分钟，80％b；(3)28分钟，80％b；(4)28.2分钟，45％b和(5)30分钟，45％b。荧光检测器的设置如下：激发波长220nm，发射波长315nm。

试验例

(一)磁固相萃取条件优化

为了评价磁性共价有机骨架微球作为磁固相萃取涂层的萃取能力，选择四种酚类内分泌干扰物bpa，bpaf，op，np作为目标污染物进行了考察,采用液相色谱-荧光检测器进行检测。在实验过程中，通过回收率来评价试验效果。

采用单因素优化法对影响实验过程的六种因素进行了优化，包括洗脱液种类、萃取时间、吸附剂用量、ph，离子强度和洗脱液体积(图2)。试验中，洗脱液种类包括：甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和正己烷，洗脱液体积范围为2-12ml，离子强度是采用nacl进行调节的，离子强度范围为0～20％的nacl，萃取时间范围为10～60min，ph范围为2～12，吸附剂用量为10-80mg。最终选择的最佳试验条件选为：洗脱液，6ml甲醇(3ml×2)；样品ph值，6；磁性共价有机骨架微球用量，40毫克；提取时间，30分钟；nacl，0％。

优化后的mspe方法在0.05-1000ng·ml^-1的浓度范围内显示出良好的线性关系(r≥0.995)。基于信噪比(s/n)为3的检测限(lod)范围为0.08至0.21ng·ml^-1。通过s/n＝10计算的定量限(loq)范围为0.39至0.85ng·ml^-1。对于四种酚类内分泌干扰物，日内偏差(n＝5)和日间偏差(n＝5)分别为0.39-4.99％和1.57-5.21％。此外，磁性共价有机骨架微球可以重复使用20次以上而没有显着的萃取效率损失。具体如下表1所示。

表1方法学分析性能

(二)实际样品分析

为验证所建立方法的适用性，在最优条件下分析了四种不同的塑料包装茶饮料。在本试验中，来自四个不同制造商的四种不同的塑料包装茶饮料被用作实际样品。这四种茶饮料如下：统一中国控股有限公司(中国台湾)生产的冰红茶，康师傅控股有限公司(中国天津)生产的茉莉花茶，达利食品集团(中国福建泉州)生产的青梅绿茶，农夫山泉有限公司(中国浙江杭州)生产的蜜桃乌龙茶。这四种茶饮料买自当地超市(中国济南)。

通过加入浓度分别为5，50和100ng·ml^-1的酚类内分泌干扰物的标准溶液来研究回收率。如表2所示，在四种塑料包装茶饮料中均未检测到酚类内分泌干扰物，回收率在81.3％和118.0％之间(rsd为0.1-8.3％)。这些结果表明，不同的饮料基质对这种新型mspe方法几乎没有影响。塑料包装绿茶饮料样品的典型色谱图如图3所示。这些结果表明，这种新型mspe方法可用于测定实际饮料样品中痕量水平的四种酚类内分泌干扰物。

表2实际样品的分析结果

^a未检出

^b回收率平均值±标准偏差

本发明在室温下合成出了核-壳结构的磁共价有机骨架，并结合液相色谱-荧光检测器，建立了分析饮料中极性酚类内分泌干扰物的磁固相微萃取-液相色谱-荧光分析新方法。新方法检出限低(最低可达0.08ngml^-1)，线性范围宽(0.5-1000ngml^-1)，重复性好(日内，0.39％-4.99％，日间，1.57％-5.21％)，并能够成功应用于实际饮料样品中酚类内分泌干扰物的分析。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。