蜂蜜中高氯酸盐的检测方法与流程

本发明涉及一种蜂蜜中高氯酸盐的检测方法。
背景技术：
：我国是蜂蜜生产、消费和出口大国，蜂蜜富含多种营养物质，风味独特，极具保健作用和营养价值，是国内消费和出口贸易的重要农产品之一。据国家统计局统计，2008年蜂蜜产量在35万吨以上，比2007年增加了10％左右，其中2008年的出口量在8.5万吨，而国内市场的需求量也在20万吨左右。蜂蜜价格相对较高，产量难以满足市场需求，且种类繁多，成分复杂，很容易造假掺假；而鉴别耗时费力，技术难度大。因此，蜂蜜中面临的主要质量安全问题就是药物残留超标和掺假造假，其已经影响到蜂蜜产业的健康发展，需要加强对蜂蜜掺假与真伪鉴别技术的研究。高氯酸盐是一种新型持久性无机污染物，它不仅存在于自然界中，而且还可以通过人工合成。高氯酸盐的用途很广，它是化肥合成的主要原材料，同时它还广泛用于润滑剂添加、涂料生产、皮革加工、橡胶制品等方面。由于高氯酸盐在生产、存储、运输、使用的过程中的不当处置及随意排放均可对环境造成污染，高氯酸盐很容易被生物体吸收、积聚、富集，并且可以通过食物链传递，最终危害生态环境和人类的健康。目前，在蜂蜜产品中已经发现了高氯酸盐残留问题。研究表明，高氯酸盐浓度在较低的情况下，它会干扰碘的吸收，影响甲状腺的正常功能，从而导致人类新陈代谢功能紊乱,阻碍人体正常的生长和发育，影响胎儿、儿童脑部的正常发育，甚至造成脑部的损伤。目前，国内外对高氯酸盐的检测应用最为广泛的有原子吸收光谱法、离子色谱法、离子色谱-电感耦合等离子体质谱法、离子色谱-质谱联用法等。以上方法都存在缺点：检出限不理想、干扰离子对目标物检测有干扰以及仪器造价太高，有的还没有商品化使用等，这些问题影响了高氯酸盐检测技术的发展。因此，急需一种快速有效、简单操作、灵敏度高、检出限低的蜂蜜中高氯酸盐的检测方法。技术实现要素：为了解决现在国内外高氯酸盐的检测存在检出限不理想、干扰离子对目标物检测有干扰的问题，本发明的目的是提供一种蜂蜜中高氯酸盐的检测方法，具有快速有效、简单操作、灵敏度高、检出限低的优点。本发明提供了如下的技术方案：蜂蜜中高氯酸盐的检测方法，包括如下步骤：s1、样品提取：准确称取样品1.0g于离心管中，加入10.0ml2-3％的甲酸水溶液提取，充分涡匀，得到处理液；s2、样品净化：将所述s1步骤得到的处理液转移至waxspe固相萃取柱上自然流干，弃去流出液，用5ml2-3％的甲酸水溶液淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，抽干固相萃取柱，用5ml1％nh3·h2o的50％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，充分涡匀，旋蒸至近干，用超纯水定容至取1ml进行上机分析；s3、样品分析：将所述s2步骤取的1ml上机液采用高效液相色谱/串联质谱仪进行测定，色谱仪条件为色谱柱：proteomixwax-np5柱(2.1×50mm，5um)；流动相：a为纯水，b为甲醇，c为0.7％氨水的50％乙腈水，d为0.5‰甲酸水；柱温：35℃；进样量：25ul；流速：0.3ml/min；质谱仪条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描模式：负离子模式；检测方式：多反应监测mrm；喷雾电压：1000-2500v；离子源温度：200-400℃；鞘气：30-50arb；辅助气：8-15arb；碰撞气压力：1.0torr；离子传输管温度：350℃；skimmeroffset：5.0-10.0；tubelens：tunedvalue；梯度洗脱的条件如下：梯度时间/mina％b％c％d％0.000.00.00.0100.01.000.00.00.0100.01.0150.050.00.00.01.0850.050.00.00.01.810.00.0100.00.03.000.00.0100.00.03.010.00.00.0100.04.000.00.00.0100.0质谱仪检测条件为：定量离子对m/z为99/83，碰撞能量为24；定性离子对m/z为101/85，碰撞能量为24；s4、采用外标法定量分析得出高氯酸盐含量。所述s1步骤的样品提取过程中使用的2-3％的甲酸水提取液，其ph值为2.5-1.5，该体系下蜂蜜中大量的有机酸、糖类、多肽等污染物在waxspe固相萃取柱上均不能保留，而无机酸可保留在该固相萃取柱上，通过该条件可以使得样品基质更为干净，从而减少基质效应对分析结果的影响，提高色谱柱的使用寿命，以及得到更低的检出限：1μg/kg，所述s3步骤的色谱条件中，采用了简短梯度洗脱程序，该洗脱程序可变换不同流动相比例而带来ph值的变化，可有效将高氯酸盐保留在色谱柱上，通过ph值的变化将其洗脱，达到快速检测的目的；所述s3步骤中使用色谱柱为proteomixwax-np5(弱阴)离子交换柱，该色谱柱固定相基质表面覆盖有亲水层并键合了一层均匀的离子交换功能基团，有以下三个优点，纳米级厚度的亲水层完全消除了载体与样品之间的非特异性相互作用；无孔颗粒结构使样品的横向扩散达到最小，同时抑制了其向填料颗粒内部的扩散；proteomixwax-np5离子交换柱为糖类和多肽等提供最好的分辨率和分离效率，从而可有效的分离高氯酸盐和糖类，使得样品检测无干扰，检出限低(1μg/kg)，该色谱柱原理的应用不同于以往方法中净化柱的使用，其它多数为吸附的原理，不能有效的保留目标化合物，存在干扰，且检出限做的很高。高氯酸盐为负一价无机阴离子，在tsqquantum三重四级杆质谱负离子模式下，高氯酸盐具有很强的信号，将高氯酸盐标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪分析，优化质谱调谐参数，选择离子丰度比较高的碎片离子作为检测离子，最终确认高氯酸的母离子为m/z99、101，检测离子为m/z83、85，这4个离子以m/z85为定量离子，4种离子均出现，且离子丰度比正确，则为检测的组分，本发明采用高容量、强亲水性的阴离子交换色谱柱proteomixwax进行分离，tsqquantum四级杆质谱检测定量，该法操作简单，基质干扰小，灵敏度高，检出限低，具有很大的应用前景。优选的，所述s1步骤中的提取液ph为2.5-1.5。优选的，所述s4步骤中定量分析采用外标法，配制0.001μg/ml-0.02μg/ml的高氯酸盐系列标准工作溶液，浓度梯度5个且均匀分布，利用高效液相色谱/串联质谱仪对不同浓度标准溶液进样分析，以高氯酸盐浓度为横坐标，高氯酸盐响应面积为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程，在相同条件下对蜂蜜样品进行检测，将得到的峰面积响应值代入回归方程，计算得到高氯酸盐的含量。本发明的有益效果是：1、所述s1步骤的样品提取过程中使用的2-3％的甲酸水提取液，其ph值为2.5-1.5，该体系下蜂蜜中大量的有机酸、糖类、多肽等污染物在waxspe固相萃取柱上均不能保留，而无机酸可保留在该固相萃取柱上，通过该条件可以使得样品基质更为干净，从而减少基质效应对分析结果的影响，提高色谱柱的使用寿命，以及更低的检出限：1μg/kg。2、所述s3步骤的色谱条件中，采用了简短梯度洗脱程序，该洗脱程序可变换不同流动相比例而带来ph值的变化，可有效将高氯酸盐保留在色谱柱上，通过ph值的变化将其洗脱，达到快速检测的目的；所述s3步骤中使用色谱柱为proteomixwax-np5(弱阴)离子交换柱，该色谱柱固定相基质表面覆盖有亲水层并键合了一层均匀的离子交换功能基团，有以下三个优点，纳米级厚度的亲水层完全消除了载体与样品之间的非特异性相互作用；无孔颗粒结构使样品的横向扩散达到最小，同时抑制了其向填料颗粒内部的扩散；proteomixwax-np5离子交换柱为糖类和多肽等提供最好的分辨率和分离效率，从而可有效的分离高氯酸盐和糖类，使得样品检测无干扰，检出限低，为1μg/kg，该色谱柱原理的应用不同于以往方法中净化柱的使用，其它多数为吸附的原理，不能有效的保留目标化合物，存在干扰，且检出限做的很高。3、高氯酸盐为负一价无机阴离子，在tsqquantum三重四级杆质谱负离子模式下，高氯酸盐具有很强的信号，将高氯酸盐标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪分析，优化质谱调谐参数，选择离子丰度比较高的碎片离子作为检测离子，最终确认高氯酸的母离子为m/z99、101，检测离子为m/z83、85，这4个离子以m/z85为定量离子，4种离子均出现，且离子丰度比正确，则为检测的组分，本发明采用高容量、强亲水性的阴离子交换色谱柱proteomixwax进行分离，tsqquantum四级杆质谱检测定量，该法操作简单，基质干扰小，灵敏度高，检出限低，具有很大的应用前景。附图说明附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是本发明高氯酸盐标准溶液色谱图；图2是本发明高氯酸盐标准曲线图；图3是本发明检测样品的色谱图；图4是本发明检测样品的质谱图；图5是本发明检出限的色谱和质谱图；具体实施方式本发明的仪器和试剂、材料仪器：proteomixwax-np5柱(2.1×50mm，5um)；surveyor型液相色谱(美国thermofisherscientific)；tsqquantum三重四级杆质谱联用仪(美国thermofisherscientific)，配有电喷雾离子化源(esi)。试剂：乙腈(色谱纯)，美国fisher公司；超纯水，艾科浦纯水系统制；waxspe固相萃取柱(上海安普)。试剂及溶液配制高氯酸盐标准储备液：准确称取高氯酸钠0.123g，用超纯水溶解定容至100ml，即得约1mg/ml的高氯酸根储备液；一级标准溶液的配制：用移液管精密量取0.1ml高氯酸盐储备液于10ml容量瓶中，水定容至刻度，摇匀即得10μg/ml高氯酸盐一级标准溶液；二级标准溶液的配制：用移液管精密量取0.1ml高氯酸盐一级标准溶液于10ml容量瓶中，水定容至刻度，摇匀即得0.1μg/ml高氯酸盐二级标准溶液；系列标准工作溶液的配制：用移液管精密量取二级标准溶液0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml的二级标准溶液分别于10ml量瓶中，水定容至刻度，摇匀即得5个不同浓度的标准溶液，采用高效液相色谱/串联质谱依次将标准工作溶液进行测定，标准溶液的色谱图如图1所示，并制定标准曲线，标准曲线如图2所示。实施例1蜂蜜中高氯酸盐的检测方法，包括如下步骤：s1、样品提取：准确称取样品1.0g于50ml离心管中，加入10.0ml2-3％的甲酸水溶液提取，提取液ph为2.5-1.5，充分涡匀，得到处理液；该体系下蜂蜜中大量的有机酸、糖类、多肽等污染物在waxspe固相萃取柱上均不能保留，而无机酸可保留在该固相萃取柱上，可使得样品基质更为干净，从而减少基质效应对分析结果的影响；s2、样品净化：将所述s1步骤得到的处理液转移至waxspe固相萃取柱上自然流干，弃去流出液，用5ml2-3％的甲酸水溶液淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，抽干固相萃取柱，用5ml1％nh3·h2o的50％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，充分涡匀，旋蒸至近干，用超纯水定容至取1ml进行上机分析；s3、样品分析：将所述s2步骤取的1ml上机液采用高效液相色谱/串联质谱仪进行测定，色谱仪条件为色谱柱：proteomixwax-np5柱(2.1×50mm，5um)；流动相：a为纯水，b为甲醇(色谱纯)，c为0.7％氨水的50％乙腈水，d为0.5‰甲酸水；柱温：35℃；进样量：25ul；流速：0.3ml/min；梯度洗脱的条件如表1所示：表1梯度洗脱程序梯度时间/mina％b％c％d％0.000.00.00.0100.01.000.00.00.0100.01.0150.050.00.00.01.0850.050.00.00.01.810.00.0100.00.03.000.00.0100.00.03.010.00.00.0100.04.000.00.00.0100.0质谱仪条件为离子源：电喷雾离子源esi；扫描模式：负离子模式；检测方式：多反应监测mrm；喷雾电压：1000-2500v；离子源温度：200-400℃；鞘气：30-50arb；辅助气：8-15arb；碰撞气压力：1.0torr；离子传输管温度：350℃；skimmeroffset：5.0-10.0；tubelens：tunedvalue；质谱仪检测条件为：定量离子对m/z为99/83，碰撞能量为24；定性离子对m/z为101/85，碰撞能量为24；色谱柱死时间为0.5min，高氯酸盐出峰时间为2.75min；该洗脱程序可变换不同流动相比例而带来ph值的变化，可有效将高氯酸盐保留在色谱柱上，通过ph值的变化将其洗脱，达到快速检测的目的；高氯酸盐为负一价无机阴离子，在tsqquantum三重四级杆质谱负离子模式下，高氯酸盐具有很强的信号，将1ug/ml高氯酸盐标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪分析，优化质谱调谐参数，选择离子丰度比较高的碎片离子作为检测离子，最终确认高氯酸的母离子为m/z99、101，检测离子为m/z83、85，这4个离子以m/z85为定量离子，经检测，4种离子均出现，且离子丰度比正确，则为检测的组分；s4、采用外标法定量分析得出高氯酸盐含量，将得到的高氯酸盐浓度为横坐标，高氯酸盐响应面积为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程，并在相同条件下对蜂蜜样品进行检测，将得到的峰面积响应值代入回归方程，计算得到高氯酸盐的含量。m＝c×v/m式中：m——高氯酸盐的含量，单位为：微克每千克(μg/kg)；c——检测出浓度，单位为：纳克每毫升(ng/ml)；v——样品定容体积，单位：毫升(ml)；m——样品称样质量，单位为：克(g)。采用上述检测方法测定蜂蜜样品的色谱图如图3所示，质谱图如图4所示，计算得到高氯酸盐的含量为29.208μg/kg。实施例2本发明检测方法的精密度和检出限本发明在实施例1的色谱、质谱条件下进行验证实验，选取10ng/ml标准溶液连续进样10针，结果如表2所示。表2高氯酸盐精密度实验数据由表2可知，相对标准偏差小于5.0，表明本发明的测定方法可靠，可精确测定蜂蜜中高氯酸盐的含量。当信噪比大于3时的浓度定为检出限，蜂蜜中高氯酸盐的浓度为1μg/kg时，色谱和质谱图的图谱如图5所示，信噪比大于3，故本发明检测方法的检出限为1μg/kg。实施例3本发明检测方法的回收率：分别做三个水平的六个平行加标实验，分别进样分析，回收率和rsd(％)的结果如表3所示。表3高氯酸盐准确度实验数据由表3可知，本发明检测方法的回收率在90-99％之间，rsd(％)均小于5.0，表明本发明检测方法具有较高的回收率。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12