一种分离(R)-苄氟噻嗪和(S)-苄氟噻嗪的HPLC方法与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及利尿药苄氟噻嗪和甲氯噻嗪药物对映体的手性分离。

背景技术：

手性是自然界最普遍的属性之一，由于手性药物的不同对映体往往显示不同的药理活性，因此对手性药物拆分研究一直是药学领域中的热点。

苄氟噻嗪和甲氯噻嗪为利尿药，分子中均含有一个手性中心(化学结构如下所示)。有文献报道使用β-环糊精手性固定相hplc法分离这2种药物对映体。

但是，手性固定相hplc法需要使用到昂贵的手性色谱柱，成分较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供利尿药苄氟噻嗪和甲氯噻嗪药物对映体的手性分离方法。

实现本发明上述目的技术方案如下：

1、(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的分离

一种分离(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的hplc方法，色谱参数如下：

色谱柱：c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～30min，0％～80％b；30～40min，80％～0％b；

流速：1.2ml/min；

柱温：35℃。

优选地，色谱柱为watersxbridgec18色谱柱。

优选地，检测波长为274nm。

优选地，进样量为10μl。

2、(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的分离

一种分离(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的高效液相色谱方法，色谱参数为：

色谱柱：c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～25min，0％～80％b；25～30min，80％～0％b；

流速：1.2ml/min；

柱温：35℃。

优选地，色谱柱为watersxbridgec18色谱柱。

优选地，检测波长为274nm。

优选地，进样量为10μl。

3、(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的分离

一种分离(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的hplc方法，色谱参数如下：

色谱柱：c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～30min，0％～70％b；30～40min，70％～0％b；

流速：1.2ml/min；

柱温：35℃。

优选地，色谱柱为watersxbridgec18色谱柱。

优选地，检测波长为274nm。

优选地，进样量为10μl。

4、(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的分离

一种分离(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的高效液相色谱方法，色谱参数为：

色谱柱：c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～25min，0％～70％b；25～30min，70％～0％b；

流速：1.2ml/min；

检测波长：274nm；

柱温：35℃。

优选地，色谱柱为watersxbridgec18色谱柱。

优选地，检测波长为274nm。

优选地，进样量为10μl。

本发明的突出优点：

本发明通过添加手性试剂使用常规的c18色谱柱即可有效分离利尿药苄氟噻嗪和甲氯噻嗪药物对映体，分离效果优异，检测成本低廉。

附图说明

图1为实施例1含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图2为实施例1不含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图3为实施例2含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图4为实施例2不含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图5为实施例3含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图6为实施例3不含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图7为实施例4含有手性试剂的hplc分离色谱图；

图8为实施例4不含有手性试剂的hplc分离色谱图。

具体实施方式

下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。

实施例1分离(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的hplc方法

一、实验仪器和材料

shimadzulc-20at高效液相色谱仪(配备lc-20at泵、sil-20a自动进样器和spd-m20a二极管阵列检测器，日本shimadzu公司)。

watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)为waters公司产品。

(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪标准品购买或自制，纯度不低于95％。

手性试剂(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯购买，纯度不低于95％。

乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

流动相a相配制：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯，具体配制方法为将水、乙腈、四氢呋喃按照体积比70:25:5混合，再添加手性试剂(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯至20mm，溶解，抽滤、超声备用。

流动相b相配制：乙腈抽滤、超声备用。

(r)-苄氟噻嗪对照溶液：将(r)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

(s)-苄氟噻嗪对照溶液：将(s)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

混合对照品溶液：将(r)-苄氟噻嗪、(s)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度分别为0.5mg/ml的混合溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

2、色谱条件

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～30min，0％～80％b；30～40min，80％～0％b；

流速：1.2ml/min；

检测波长：274nm；

柱温：35℃；

进样量：10μl。

3、进样检测及分离效果

分别精密量取(r)-苄氟噻嗪对照溶液、(s)-苄氟噻嗪对照溶液、混合对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图1所示，可见混合对照品溶液中(r)-苄氟噻嗪、(s)-苄氟噻嗪可以达到基线分离，分离效果优异。如果a相中不添加(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯，其他色谱条件不变，分离色谱图如图2所示，(r)-苄氟噻嗪、(s)-苄氟噻嗪无法分离。

实施例2分离(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪的hplc方法

一、实验仪器和材料

shimadzulc-20at高效液相色谱仪(配备lc-20at泵、sil-20a自动进样器和spd-m20a二极管阵列检测器，日本shimadzu公司)。

watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)为waters公司产品。

(r)-苄氟噻嗪和(s)-苄氟噻嗪标准品购买或自制，纯度不低于95％。

手性试剂(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯购买，纯度不低于95％。

乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

流动相a相配制：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯，具体配制方法为将水、乙腈、四氢呋喃按照体积比70:25:5混合，再添加(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯至20mm，溶解，抽滤、超声备用。

流动相b相配制：乙腈抽滤、超声备用。

(r)-苄氟噻嗪对照溶液：将(r)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

(s)-苄氟噻嗪对照溶液：将(s)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

混合对照品溶液：将(r)-苄氟噻嗪、(s)-苄氟噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度分别为0.5mg/ml的混合溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

2、色谱条件

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～25min，0％～80％b；25～30min，80％～0％b；

流速：1.2ml/min；

检测波长：274nm；

柱温：35℃；

进样量：10μl。

3、进样检测及分离效果

分别精密量取(r)-苄氟噻嗪对照溶液、(s)-苄氟噻嗪对照溶液、混合对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图3所示，可见混合对照品溶液中(r)-苄氟噻嗪、(s)-苄氟噻嗪可以达到基线分离，分离效果优异。如果a相中不添加(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯，其他色谱条件不变，分离色谱图如图4所示，二者无法分离。

实施例3分离(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的hplc方法

一、实验仪器和材料

shimadzulc-20at高效液相色谱仪(配备lc-20at泵、sil-20a自动进样器和spd-m20a二极管阵列检测器，日本shimadzu公司)。

watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)为waters公司产品。

(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪标准品购买或自制，纯度不低于95％。

手性试剂(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯购买，纯度不低于95％。

乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

流动相a相配制：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯，具体配制方法为将水、乙腈、四氢呋喃按照体积比70:25:5混合，再添加手性试剂(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯至20mm，溶解，抽滤、超声备用。

流动相b相配制：乙腈抽滤、超声备用。

(r)-甲氯噻嗪对照溶液：将(r)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

(s)-甲氯噻嗪对照溶液：将(s)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

混合对照品溶液：将(r)-甲氯噻嗪、(s)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度分别为0.5mg/ml的混合溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

2、色谱条件

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～30min，0％～70％b；30～40min，70％～0％b；

流速：1.2ml/min；

检测波长：274nm；

柱温：35℃；

进样量：10μl。

3、进样检测及分离效果

分别精密量取(r)-甲氯噻嗪对照溶液、(s)-甲氯噻嗪对照溶液、混合对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图5所示，可见混合对照品溶液中(r)-甲氯噻嗪、(s)-甲氯噻嗪可以达到基线分离，分离效果优异。如果a相中不添加(1r,2r)-2-氨基环戊烷甲酸乙酯，其他色谱条件不变，分离色谱图如图6所示，(r)-甲氯噻嗪、(s)-甲氯噻嗪无法分离。

实施例4分离(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪的hplc方法

一、实验仪器和材料

shimadzulc-20at高效液相色谱仪(配备lc-20at泵、sil-20a自动进样器和spd-m20a二极管阵列检测器，日本shimadzu公司)。

watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)为waters公司产品。

(r)-甲氯噻嗪和(s)-甲氯噻嗪标准品购买或自制，纯度不低于95％。

手性试剂(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯购买，纯度不低于95％。

乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水。

二、实验方法和结果

1、溶液配制

流动相a相配制：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯，具体配制方法为将水、乙腈、四氢呋喃按照体积比70:25:5混合，再添加(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯至20mm，溶解，抽滤、超声备用。

流动相b相配制：乙腈抽滤、超声备用。

(r)-甲氯噻嗪对照溶液：将(r)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

(s)-甲氯噻嗪对照溶液：将(s)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

混合对照品溶液：将(r)-甲氯噻嗪、(s)-甲氯噻嗪用流动相a相溶解，配制成浓度分别为0.5mg/ml的混合溶液，过0.45μm滤膜，4℃保存备用。

2、色谱条件

色谱柱：watersxbridgec18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a相：体积比为70:25:5的水-乙腈-四氢呋喃溶液，其中含有20mm(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯；

流动相b相：乙腈；

梯度洗脱程序：0～5min，0％b；5～25min，0％～70％b；25～30min，70％～0％b；

流速：1.2ml/min；

检测波长：274nm；

柱温：35℃；

进样量：10μl。

3、进样检测及分离效果

分别精密量取(r)-甲氯噻嗪对照溶液、(s)-甲氯噻嗪对照溶液、混合对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图7所示，可见混合对照品溶液中(r)-甲氯噻嗪、(s)-甲氯噻嗪可以达到基线分离，分离效果优异。如果a相中不添加(1s,2r)-2-(boc-氨基)环戊烷甲酸乙酯，其他色谱条件不变，分离色谱图如图8所示，二者无法分离。

综上，本发明通过添加手性试剂使用常规的c18色谱柱即可有效分离利尿药苄氟噻嗪和甲氯噻嗪药物对映体，分离效果优异，检测成本低廉。

上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。