同时检测妇科肿瘤标志物HER-2和HE4的试纸条的制作方法

本发明属于免疫测定技术领域，具体涉及一种同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条及用途。

背景技术：

癌症已经成为威胁公众健康的重大问题。近年来，与男性相比，中国女性肿瘤发病率呈现年均2.2％的显著增长。其中，女性特发的乳腺癌、卵巢癌和子宫癌的发病率和死亡率逐年上升，乳腺癌占女性新发癌症的15％，子宫癌占3.6％，卵巢癌占3％，城市发病率较农村明显升高。为应对中国妇女特发性肿瘤乳腺癌、卵巢癌和子宫癌的高发现状，早发现、早诊断和早治疗是提高患者生存率的有效手段之一。基于肿瘤标志物的血清学检测具有快捷有效和简单易行的显著优势，已经成为癌症早期筛查、检测和随访的重要手段。

新发现的肿瘤标志物使得肿瘤的靶向性、准确性提高，有助于增加诊断效率。作为一种新型的肿瘤标志物，人附睾蛋白4(humanepididymisprotein4,he4)在正常卵巢组织上皮中不表达，而在卵巢癌、子宫癌组织中高表达，在癌旁组织、正常组织及良性肿瘤中不同程度的低水平表达，是卵巢、子宫恶性肿瘤诊断及鉴别的重要指标。美国国立卫生研究院将he4的检测作为筛查盆腔肿块良恶性的重要手段。与常规的筛查指标ca125比较，he4蛋白在上皮性卵巢癌中100％表达，良性肿瘤患者中，8％呈阳性，而ca125阳性率29％；在子宫内膜异位症患者中，前者有3％，后者却高达67％，假阳性率显著。因此，he4在子宫内膜癌和卵巢癌筛查中价值明显优于传统的ca125。人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her-2)在人类卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中，呈现过度表达，且her-2阳性者的复发率、转移率均高于阴性乳腺癌患者。2014年中国乳腺癌检测指南告知：正确检测和评定her-2表达，对乳腺癌的临床诊断、治疗和预后判断至关重要。

目前，国内有her-2免疫组织化学诊断试剂盒，如中国专利200410020546.x中公开的乳腺癌的her-2免疫组织化学诊断试剂盒；有he4的酶联免疫试剂盒，如中国专利201410348798.9中公开的一种用于检测he4的酶联免疫试剂盒。上述的试剂盒前者仅针对乳腺癌的检测，后者仅针对卵巢癌、子宫癌开展检测，存在仅能检测单一的妇科肿瘤标志物的缺陷，造成人妇科肿瘤的临床诊断、治疗和预后判断需要花费的时间长，效率低，同时上述试剂盒灵敏度低、特异性低，多次单独检测产生的误差较大，继而导致检测结果可信度低。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于现有检测妇科肿瘤标志物的试剂盒仅能定量或半定量测试，且进行her-2和he4检测必须进行两次实验等，进而提供一种同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条及其用途。

为此，本发明提供了一种同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，包括：底板，以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫；其中，所述硝酸纤维素膜粘覆于所述底板的中间部位，所述吸水纸、所述硝酸纤维素膜、所述结合垫以及所述样品垫之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述硝酸纤维素膜上设置有相间隔的第一her-2抗体的第一检测带、第一he4抗体的第二检测带以及与第一her-2抗体和第一he4抗体均无关的多克隆抗体的质控带，所述结合垫处喷涂有表面分别修饰了第二her-2抗体和第二he4抗体的且含有示踪物的高分子纳米微球。

优选的，在所述试纸条中，所述与第一her-2抗体和第一he4抗体均无关的多克隆抗体为羊抗鼠多克隆抗体。

在所述的试纸条中，所述示踪物为镧系元素、荧光剂或为量子点。

在所述的试纸条中，所述镧系元素包括但不限于铕、钐、鋱或镝。

在所述的试纸条中，所述镧系元素为铕。

在所述的试纸条中，所述第一her-2抗体或第二her-2抗体由如下任一抗原多肽制备而成，且制备所述第一her-2抗体与所述第二her-2抗体的抗原多肽不同：

(1)所述抗原多肽如seqidno：1所示；或

(2)所述抗原多肽如seqidno：2所示。

在所述的试纸条中，所述第一he4抗体或第二he4抗体由如下任一抗原多肽制备而成，且制备所述第一he4抗体与第二he4抗体的抗原多肽不同：

(1)所述抗原多肽如seqidno：3所示；或

(2)所述抗原多肽如seqidno：4所示。

在所述的试纸条中，所述第一检测带、所述第二检测带和质控带平行设置；所述第一检测带与所述结合垫相邻相隔距离为0.3cm～0.7cm；所述第二检测带位于所述第一检测带和质控带之间，与所述第一检测带相隔距离为0.3cm～0.7cm，与所述质控带相隔距离为0.3cm～0.7cm。

在所述的试纸条中，所述高分子纳米微球的直径为50-500nm。

本发明提供了一种所述的同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条在体外诊断或检测妇科肿瘤中的用途。

在所述的用途中，所述妇科肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供了同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，包括底板，以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫；其中，所述硝酸纤维素膜粘覆于所述底板的中间部位，所述吸水纸、所述硝酸纤维素膜、所述结合垫以及所述样品垫依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述硝酸纤维素膜上设置有相间隔的第一her-2抗体的第一检测带、第一he4抗体的第二检测带以及喷涂有与第一her-2抗体和第一he4抗体均无关的多克隆抗体的质控带，所述结合垫处喷涂有表面分别修饰了第二her-2抗体和第二he4抗体的且含有示踪物的高分子纳米微球；上述结合垫喷涂的修饰了第二her-2抗体和第二he4抗体的且含有示踪物的高分子纳米微球以及检测带喷涂的第一her-2抗体和第一he4抗体可以高度特异性的与妇科肿瘤标志物her-2或he4抗原结合，进而可以利用所述试纸条采用了时间分辨荧光免疫层析方法，能够同时检测人her-2和he4两个肿瘤标志物，有助于乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌的同时检验。通过一次操作可获得两个结果，提高筛查和临床判读的效率，又可以减少单独检验造成的误差，有利于妇科肿瘤的筛查和诊断，提高结果可信度。

2、本发明提供的同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，所述的第一her-2抗体或第二her-2抗体由如下任一抗原多肽制备而成，且制备所述第一her-2抗体与所述第二her-2抗体的抗原多肽不同：(1)所述抗原多肽如seqidno：1所示；或(2)所述抗原多肽如seqidno：2所示；seqidno：1选自her-2的第23-1255位氨基酸序列，seqidno：2选自her-2的第23-640位氨基酸序列，上述两抗原多肽均具有良好的抗原性、高活性和高特异性，通过其制备的第一her-2抗体和第二her-2抗体能够高度特异性的与妇科肿瘤标志物her-2抗原结合，其特异性结合能力显著高于普通的her-2单克隆抗体与her-2抗原的结合能力，将其应用到妇科肿瘤标志物her-2的检测，可以提高检测灵敏度、特异性，最大程度上减少背景噪音，进一步提高结果可信度。

3、本发明提供的同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，所述第一he4抗体或第二he4抗体由如下任一抗原多肽制备而成，且制备所述第一he4抗体与第二he4抗体的抗原多肽不同：(1)所述抗原多肽如seqidno：3所示；或(2)所述抗原多肽如seqidno：4所示；seqidno：3选自he4的第31-124位氨基酸序列，seqidno：4选自he4的第32-123位氨基酸序列，上述两多肽片段具有良好的抗原性、高活性和高特异性，通过其制备的第一he4抗体和第二he4抗体可以高度特异性的与妇科肿瘤标志物he4抗原结合，其特异性结合能力显著高于普通的he4单克隆抗体与he4抗原的结合能力，因此，将其应用到妇科肿瘤标志物he4的检测，可以提高检测灵敏度、特异性，最大程度上减少背景噪音，进一步的提高结果可信度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例3中试纸条沿长度方向的剖面示意图；

图2是实施例3中试纸条平面示意图；

图3是实验例1中her-2的标准曲线；

图4是实验例1中he4的标准曲线；

图5是实验例2中her-2的标准曲线；

图6是实验例2中he4的标准曲线；

图中附图标记表示为：1-底板，2-硝酸纤维素膜，3-吸水纸，4-样品垫，5-结合垫，6-质控带，7-第二检测带，8-第一检测带。

具体实施方式

下述实施例中涉及试剂或仪器的均为市售产品，不同厂家的产品在技术效果上并不会带来明显差别；

待测血清由江苏省江原医院提供；

如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3和seqidno：4所示氨基酸序列委托上海生工公司合成；her-2抗原、he4抗原、tween-20、tritonx-100和bsa，购自sigma公司；

时间分辨荧光免疫层析分析仪，上海互帼公司。

实施例1her-2-t抗体和he4-t抗体的制备

分别将seqidno：1和seqidno：2所示氨基酸序列作为her-2-t-1抗原和her-2-t-2抗原免疫动物，从而利用上述抗原制备特异性的her-2-t-1和her-2-t-2单克隆抗体或多克隆抗体。同理，分别将seqidno：3和seqidno：4所示氨基酸序列作为he4-t-1抗原和he4-t-2抗原免疫动物，从而利用上述抗原制备特异性的he4-t-1和he4-t-2单克隆抗体或多克隆抗体。her-2-t-1和her-2-t-2简称为her-2-t-1/2，he4-t-1和he4-t-2简称为he4-t-1/2。

1免疫动物制备单克隆抗体：

1.1.取上述的her-2-t-1抗原、her-2-t-2抗原、he4-t-1抗原和he4-t-2抗原(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)充分混合后，免疫balb/c小鼠，50μg抗原/只，皮下多点注射。4周后测血清效价，选择免疫反应性好的小鼠再加强免疫：取抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合后，抗原剂量25μg/只，皮下多点注射，加强免疫的次数为3次；再连续冲击免疫两次，之后取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％peg(mw4000)(购自中原化工公司)介导进行融合，并用hat条件培养基(购自sigma公司)选择培养。融合后放入co2培养箱中37℃培养9～11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接elisa进行筛选。对初筛阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养(即使筛选后的细胞大量分裂繁殖)，之后扩增细胞、冻存。

1.2.制备腹水：将balb/c小鼠用降植烷(购自sigma公司)0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2×10⁶个/只，10天后收集腹水。

1.3.测定抗体效价：用间接elisa方法测定利用her-2-t-1抗原制备的her-2-t-1单克隆抗体的效价，结果显示单抗的效价达到1:33000以上。

同理，用间接elisa方法测定得利用her-2-t-2抗原制备的her-2-t-2单克隆抗体的效价，结果显示单抗的效价达到1:33000以上；

利用he4-t-1抗原制备的he4-t-1单克隆抗体的效价也用相同的方法进行测定，其效价也达到1:33000以上。；

利用he4-t-2抗原制备的he4-t-2单克隆抗体的效价也用相同的方法进行测定，其效价也达到1:33000以上。2.免疫动物制备多克隆抗体：

2.1.选用三个月龄、体重约为2kg左右的新西兰白兔作为免疫动物。基础免疫中，将1-2mg上述制备的her-2-t抗原和he4-t抗原(免疫原)分别与等体积的弗氏完全佐剂混合-充分乳化后在兔子背部进行多点皮下注射。每隔4周加强免疫一次，抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后，以100μg/只于背部多点皮下注射。末次加强免疫后第10天颈动脉放血，分离血清。

2.2.测定抗体效价：用间接elisa法测定利用her-2-t-1抗原制备的her-2-t-1多克隆抗体的效价，结果显示抗体效价达到1:30000以上。

同理，用间接elisa法测定得利用her-2-t-2抗原制备的her-2-t-2多克隆抗体的效价，结果显示抗体效价达到1:30000以上；

利用he4-t-1抗原制备的he4-t-1多克隆抗体的效价达到1:30000以上；

利用he4-t-2抗原制备的he4-t-2多克隆抗体的效价达到1:30000以上。

3.分离纯化抗体：腹水/血清经硫酸铵沉淀后，再经proteing(购自sigma公司)亲和纯化。

4.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例2：人her-2-t-1/2抗体和he4-t-1/2抗体的特异性鉴定

以elisa进行检测。分别以人her-2、人he4、癌胚抗原(cea)、神经元特异性烯醇化酶(nse)(均购自sigma公司)为检测抗原包被elisa板，再分别检测所制备的her-2-t-1/2单克隆抗体和he4-t-1/2单克隆抗体与抗原板的特异性反应，以正常balb/c小鼠血清作阴性对照，pbs液作空白对照。

结果：her-2-t-1/2单克隆抗体仅与her-2反应为阳性(p/n>2.1)，he4-t-1/2单克隆抗体只与he4反应为阳性(p/n>2.1)，而与cea、nse反应为阴性，说明本发明的her-2-t-1/2单克隆抗体和he4-t-1/2单克隆抗体具有特异性。

利用上述方法鉴定her-2-t-1/2多克隆抗体和he4-t-1/2多克隆抗体的特异性，结果为her-2-t-1/2多克隆抗体只与her-2反应为阳性(p/n>2.1)，he4-t-1/2多克隆抗体只与he4反应为阳性(p/n>2.1)，而与cea、nse反应为阴性，说明本发明的her-2-t-1/2多克隆抗体和he4-t-1/2多克隆抗体具有特异性。

实施例3同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4试纸条的制备

本实施例提供了一种检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，如图1和图2所示，包括：

底板1，以及沿所述底板1长度方向顺次粘覆于所述底板1上的吸水纸3、硝酸纤维素膜2、结合垫5以及样品垫4；其中，所述硝酸纤维素膜2粘覆于所述底板1的中间部位，所述吸水纸3、所述硝酸纤维素膜2、所述结合垫5以及所述样品垫4之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；

所述硝酸纤维素膜2上设置有相间隔的喷涂有her-2-t-1抗体的第一检测带8、he4-t-1抗体的第二检测带7以及喷涂有羊抗鼠多克隆抗体的质控带6，所述结合垫5处喷涂有表面分别修饰了her-2-t-2抗体和he4-t-2抗体的且含有镧系元素的高分子纳米微球涂层。

具体地，优选所述高分子纳米微球含有铕离子，含有所述铕离子的所述高分子纳米微球的设置减少了稀土离子在样品溶液的猝灭，提高了稀土离子发出的荧光强度，因此不仅提高了检测的精确度，而且便于检测结果的显示和操作者的观察。

本实施例中，所述高分子纳米微球的直径为200nm，在使用过程中一般也可以根据实际需要将所述高分子纳米微球的直径设为50-500nm，即所述高分子纳米微球的直径可设为50nm，也可以设为500nm，当然也可以设为这两个数值之间的其他任意值。

进一步，所述第一检测带8、所述第二检测带7和所述质控带6平行设置；其中，所述第一检测带8与所述结合垫5相邻相隔距离为0.3cm～0.7cm；所述第二检测带7位于所述第一检测带8和质控带6之间，与所述第一检测带8相隔距离为0.3cm～0.7cm，与所述质控带6相隔距离为0.3cm～0.7cm。在本实施例中，上述三者都相互平行设置，所述第一检测带8与所述结合垫5相邻相隔距离为0.3cm；所述第二检测带7位于所述第一检测带8和质控带6之间，与所述第一检测带8相隔距离为0.3cm，与所述质控带6相隔距离为0.3cm。

在上述实施例的基础上，所述吸水纸3设于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述吸水纸3与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分在所述底板1长度方向的长度为2mm。所述结合垫5位于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述结合垫5与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分在所述底板1长度方向的长度为2mm；所述样品垫4设于所述结合垫5的上方，且所述样品垫4与所述结合垫5相重叠的部分沿所述底板1长度方向的长度为2mm；其中，为了保证该试纸条的顺利使用，所述结合垫5沿所述底板1长度方向的长度大于4mm，也即，结合垫5的长度要大于样品垫4与结合垫5重叠部分沿所述底板11长度方向的长度和结合垫5与硝酸纤维素膜2重叠部分沿所述底板11长度方向的长度之和。

在上述的基础上，本实施例提供了上述同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条的制备方法：

抗体的预处理：将her-2-t-2单克隆抗体、he4-t-2单克隆抗体和羊抗鼠igg，分别用ph7.20.05mol/l的磷酸盐缓冲液在4℃下透析过夜。

标记微球的制备：向高分子纳米微球溶液中加入碳二亚胺(edc)(终浓度为20mmol/l)和预处理过的her-2-t-2单克隆抗体(微球质量：抗体质量＝50:1)，室温反应2小时。离心，去除上清液。用含有表面活性剂的缓冲液反复洗涤微球两次，弃上清后，加入样品稀释液(含有1％bsa的ph7.20.05mol/l的磷酸盐缓冲液)至微球(所述微球为标记有her-2-t-2单克隆抗体的微球)浓度为1.0g/l，待用。高分子纳米微球偶联he4-t-2单克隆抗体的方法同上。

结合垫的制备：将制备好的he4-t-2单克隆抗体微球和her-2-t-2单克隆抗体微球混合，用喷金划膜仪将混合液以3μl/cm-5μl/cm的量喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，置于35-38℃避光烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

硝酸纤维素膜的制备：使用含1％蔗糖的0.02mol/l，ph7.4的磷酸盐缓冲液，分别将透析过的her-2-t-1单克隆抗体、he4-t-1单克隆抗体和1g/l的羊抗鼠igg抗体，使用定量喷膜仪以1μl/cm的量将三者以一定的间隔喷于硝酸纤维素膜上，这三条喷涂线分别被命名为第一检测线带8、第二检测带7和质控带6。将已喷涂好的硝酸纤维素膜于28-38℃烘干2h备用。

试纸条的组装：在底板1中间先铺设硝酸纤维素膜2，然后在与质控带6相临近的一端铺吸水纸3，使吸水纸与硝酸纤维素膜2部分重叠；在与第一检测带8相临近的一端铺结合垫5，使硝酸纤维素膜2与结合垫5部分重叠；最后贴样品垫4。将贴有硝酸纤维素膜2、样品垫4、结合垫5、吸水纸3的底板用切条机切斩切成细条。

实施例4同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条

本实施例提供了一种检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条，包括：

底板1，以及沿所述底板1长度方向顺次粘覆于所述底板1上的吸水纸3、硝酸纤维素膜2、结合垫5以及样品垫4；其中，所述硝酸纤维素膜2粘覆于所述底板1的中间部位，所述吸水纸3、所述硝酸纤维素膜2、所述结合垫5以及所述样品垫4之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；

所述硝酸纤维素膜2上设置有相间隔的喷涂有her-2-t-2抗体的第一检测带8、he4-t-2抗体的第二检测带7以及喷涂有羊抗鼠多克隆抗体的质控带6，所述结合垫5处喷涂有表面分别修饰了her-2-t-1抗体和he4-t-1抗体的且含有镧系元素的高分子纳米微球。

具体地，优选所述高分子纳米微球涂层含有铕离子，含有所述铕离子的所述高分子纳米微球的设置减少了稀土离子在样品溶液的猝灭，提高了稀土离子发出的荧光强度，因此不仅提高了检测的精确度，而且便于检测结果的显示和操作者的观察。

本实施例中，所述高分子纳米微球的直径为300nm，在使用过程中一般也可以根据实际需要将所述高分子纳米微球的直径设为50-500nm，即所述高分子纳米微球的直径可设为50nm，也可以设为500nm，当然也可以设为这两个数值之间的其他任意值。

进一步，所述第一检测带8、所述第二检测带7、所述质控带6平行设置；其中，所述第二检测带7与所述结合垫5相邻相隔距离为0.3cm～0.7cm；所述第二检测带7位于所述第一检测带8和质控带6之间，与所述第一检测带8相隔距离为0.3cm～0.7cm，与所述质控带6相隔距离为0.3cm～0.7cm。在本实施例中，上述三者都相互平行设置，所述第一检测带8与所述结合垫5相邻相隔距离为0.7cm；所述第二检测带7位于所述第一检测带8和质控带6之间，与所述第一检测带8相隔距离为0.5cm，与所述质控带6相隔距离为0.5cm。

在上述实施例的基础上，所述吸水纸3设于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述吸水纸3与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分在所述底板1长度方向的长度为2mm。所述结合垫5位于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述结合垫5与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分在所述底板1长度方向的长度为2mm；所述样品垫4设于所述结合垫5的上方，且所述样品垫4与所述结合垫5相重叠的部分沿所述底板1长度方向的长度为2mm；其中，为了保证该试纸条的顺利使用，所述结合垫5沿所述底板1长度方向的长度大于4mm，也即，结合垫5的长度要大于样品垫4与结合垫5重叠部分沿所述底板11长度方向的长度和结合垫5与硝酸纤维素膜2重叠部分沿所述底板11长度方向的长度之和。

在上述的基础上，本实施例提供了上述同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条的制备方法：

抗体的预处理：将her-2-t-1单克隆抗体、he4-t-1单克隆抗体和羊抗鼠igg，分别用ph7.20.05mol/l的磷酸盐缓冲液在4℃下透析过夜。

标记微球的制备：向高分子纳米微球溶液中加入碳二亚胺(edc)(终浓度为20mmol/l)和预处理过的her-2-t-1单克隆抗体(微球质量：抗体质量＝50:1)，室温反应2小时。离心，去除上清液。用含有表面活性剂的缓冲液反复洗涤微球两次，弃上清后，加入样品稀释液(含有1％bsa的ph7.20.05mol/l磷酸盐缓冲液)至微球(所述微球为标记有her-2-t-1单克隆抗体的微球)浓度为1.0g/l，待用。高分子纳米微球偶联he4-t-1单克隆抗体的方法同上。

结合垫的制备：将制备好的he4-t-1单克隆抗体微球和her-2-t-1单克隆抗体微球混合，用喷金划膜仪以3μl/cm-5μl/cm的量将混合液喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，置于35-38℃避光烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

硝酸纤维素膜的制备：使用含1％蔗糖的ph7.40.02mol/l磷酸盐缓冲液，分别将透析过的her-2-t-2单克隆抗体、he4-t-2单克隆抗体和1g/l的羊抗鼠igg抗体，使用定量喷金划膜仪以1μl/cm的量将三者以一定的间隔喷于硝酸纤维素膜2上，这三条喷涂线分别被命名为第一检测带8、第二检测带7、质控带6。将已喷涂好的硝酸纤维素膜于28-38℃烘干2h备用。

试纸条的组装：在底板1中间先铺设硝酸纤维素膜2，然后在与质控带6相临近的一端铺吸水纸3，使吸水纸3与硝酸纤维素膜2部分重叠；在与第一检测带8相临近的一端铺结合垫5，使硝酸纤维素膜2与结合垫5部分重叠；最后贴样品垫4。将贴有硝酸纤维素膜2、样品垫4、结合垫5、吸水纸3的底板1用切条机切斩切成细条。

对比例1

本实施例与实施例3基本相同，区别仅在于，将其中的her-2-t-1单克隆抗体和he4-t-1单克隆抗体替换为美国abcam公司的her-2单克隆抗体和he4单克隆抗体，所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

实验例1

利用实施例3所述的试纸条同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4含量的方法，包括如下步骤：

样品制备：血清样本为用血清管收集的静脉血，离心取上清使用。

校准品溶液的制备：采用her-2和he4抗原制备成系列浓度的校准品溶液。用含2g/lbsa和1g/lnan3的ph7.850mmol/ltris-hcl缓冲液将所述her-2和he4抗原配制成含所述her-2抗原浓度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml以及含所述he4抗原浓度为0pmol/l、10pmol/l、50pmol/l、100pmol/l、200pmol/l、1000pmol/l的系列混合校准品溶液。

反应过程使用前，先将试纸条和其他试剂恢复室温。将20μl样品或者校准品与50μl样品缓冲液，滴加入试纸条的样品垫上，室温反应一定时间后，将试纸条放入检测仪器中读数，用时间分辨荧光免疫层析分析仪检测荧光信号值，分别获得所述校准品溶液和待测样品的荧光值，校准品溶液中的检测结果见下表1、2，然后根据所述校准品溶液的浓度和对应的t/c值(检测带的荧光值比质控带的荧光值)绘制标准曲线，以校准品溶液中对应的her-2抗原或he4抗原的浓度为横坐标，t/c值为纵坐标，建立log-log方程并拟合标准曲线，her-2标准曲线见图3，he4标准曲线见图4，然后将所述待测样品检测得到的t/c值分别为her-2(0.252、0.820、1.568)，he4(0.325、0.776、1.328)，代入对应的所述her-2或he4标准曲线中。

检测结果：计算得到所述待测样品中her-2含量分别为2.72ng/ml、64.86ng/ml、261.65ng/ml，he4的含量分别为25pmol/l、138pmol/l、352.95pmol/l。

表1her-2校准品的检测结果

表2he4校准品的检测结果

实验例2

利用对比例1所述的试纸条同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4含量的方法，包括如下步骤：

样品制备：采用实验例1中相同的样品。

校准品溶液的制备：采用her-2和he4抗原制备成系列浓度的校准品溶液。用含2g/lbsa和1g/lnan3的50mmol/lph7.8tris-hcl缓冲液将所述her-2和he4抗原配制成含所述her-2抗原浓度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml以及含所述he4抗原浓度为0pmol/l、10pmol/l、50pmol/l、100pmol/l、200pmol/l、1000pmol/l的系列混合校准品溶液。

反应过程使用前，先将试纸条和其他试剂恢复室温。将20μl样品或者校准品与50μl样品缓冲液，滴加入试纸条的样品垫上，室温反应一定时间后，将试纸条卡壳放入检测仪器中读数，用时间分辨荧光免疫层析分析仪检测荧光信号值，分别获得所述校准品溶液和待测样品的荧光值，校准品溶液中的检测结果见下表3、4，然后根据所述校准品溶液的浓度和对应的t/c值绘制标准曲线，以校准品溶液中对应的her-2抗原或he4抗原的浓度为横坐标，t/c值为纵坐标，建立log-log方程并拟合标准曲线，her-2标准曲线见图5，he4标准曲线见图6，然后将所述待测样品检测得到的t/c值分别为her-2(0.234、0.726、1.554)，he4(0.365、0.682、1.023)，代入对应的所述her-2或he4标准曲线中。

检测结果：计算得到所述待测样品中her-2含量分别为3.03ng/ml、59.82ng/ml、308.90ng/ml，he4的含量分别为24.86pmol/l、126.45pmol/l、289.44pmol/l。

表3her-2校准品的检测结果

表4he4校准品的检测结果

实验例3

样品制备：采用实验例1中相同的样品。

采用her-2和he4电化学发光法(ecli)(试剂盒购自罗氏公司)和实验例1中的方法检测所述待测样品，重复三次，验证本发明实验例1试纸条的正确性，结果见下表5。

表5检测结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

sequencelisting

<110>江苏省原子医学研究所

<120>同时检测妇科肿瘤标志物her-2和he4的试纸条

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