一种L-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法与流程

本发明属于食品和药物分析
技术领域：
，具体涉及一种l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法。
背景技术：
：l-2-氨基-5-胍基戊酸(cas登录号为74-79-3)属于氨基酸类化合物，具有重要的生理功能，常作为营养补充剂，也是氨基酸胶囊和输液的重要成分。l-2-氨基-5-胍基戊酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染；有利于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护患者的康护。临床上，l-2-氨基-5-胍基戊酸适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症；用于婴幼儿补充l-2-氨基-5-胍基戊酸缺乏。目前，l-2-氨基-5-胍基戊酸主要采用微生物发酵法生产，其代谢过程中会产生大量有机酸类同系物杂质(见图1)，是l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药有关物质的主要来源。难于彻底分离除去的主要包括2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸等，易于残存于l-2-氨基-5-胍基戊酸原料中，影响产品质量。现行版各国药典收载的l-2-氨基-5-胍基戊酸均没有设置有关物质检查项，不能说清楚这些有机酸类同系物杂质在l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药中的存在状况，也不利于利用该原料所制备制剂的质量控制，给临床用药带来安全隐患。现有技术没有涉及l-2-氨基-5-胍基戊酸原料的有关物质，尤其是2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸等代谢同系物杂质的定量检测。因此，非常有必要建立一个有关物质检测方法，对微生物发酵来源的l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药进行全面的杂质检测和控制。本申请利用高效液相色谱技术建立了一种能够定量检测l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，该方法具有分离度好、灵敏度高、操作简便等诸多优势。技术实现要素：本发明的目的是提供一种l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的高效液相色谱检测方法，为l-2-氨基-5-胍基戊酸的质量标准制定提供依据，以便更好控制产品质量，确保食用和药用安全。实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：一种l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法：1、色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/ml的缓冲盐溶液(ph值2.0～2.8)为流动相a，以乙腈为流动相b；流速为每分钟0.3～0.8ml；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μl；取系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，l-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；其中，系统适用性试验溶液为l-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的混合溶液；2、l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量；所述供试品溶液为l-2-氨基-5-胍基戊酸原料加稀释液溶解制成的溶液；所述对照品溶液为由2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种用稀释液制成的溶液；所述对照溶液为供试品溶液加稀释液稀释制成的溶液。进一步，所述对照品溶液中2-酮基戊二酸的浓度与供试品溶液l-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(s)-2-乙酰氨基戊二酸的浓度与供试品溶液l-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104，(e)-2-丁烯二酸的浓度与供试品溶液l-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×104～2×105；所述对照溶液与供试品溶液中l-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度之比为1:0.4×103～2×104。优选的，l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其步骤包括：1)缓冲盐溶液的制备：称取一定量的磷酸盐或柠檬酸盐或醋酸盐，加水制成浓度为1～20mg/ml的溶液，再用对应的酸调节溶液的ph值为2.0～2.8，作为缓冲盐溶液；2)稀释液的制备：取步骤1)所得的缓冲盐溶液，加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液；3)供试品溶液的制备：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为1.0～50.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；4)对照品溶液的制备：精密称取2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种，用稀释液溶解并稀释成制成浓度分别为2.5μg/ml、2.5μg/ml和0.25μg/ml的溶液，作为对照品溶液；5)对照溶液的制备：取步骤3)所得的供试品溶液，用稀释液稀释成制成l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为供试品溶液浓度千分之一的溶液，作为对照溶液；6)系统适用性溶液的制备：分别称取l-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种各适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml中约含l-2-氨基-5-胍基戊酸2.5mg、2-酮基戊二酸2.5μg、(s)-2-乙酰氨基戊二酸2.5μg与(e)-2-丁烯二酸0.25μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；7)空白溶剂的制备：取步骤2)所得的稀释液作为空白溶剂；8)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为1～20mg/ml的缓冲盐溶液(ph值2.0～2.8)为流动相a，以乙腈为流动相b；流速为每分钟0.3～0.8ml；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为25～35℃；进样量为10～50μl；取步骤6)制备的系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，l-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；9)l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取步骤3)、4)和5)所制备的供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量。进一步，l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，其优化的步骤包括：1)缓冲盐溶液的制备：称取一定量的磷酸二氢钠，加水制成浓度为3～10mg/ml的溶液，再用对应的酸调节溶液的ph值为2.0～2.5，作为缓冲盐溶液；2)稀释液的制备：取步骤1)所得的缓冲盐溶液，加入乙腈混合制成缓冲盐溶液和乙腈体积比为99:1～85:15的溶液，作为稀释液；3)供试品溶液的制备：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为2.5～5.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；4)对照品溶液的制备：精密称取2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种，用稀释液溶解并稀释成制成浓度分别为2.5μg/ml、2.5μg/ml和0.25μg/ml的溶液，作为对照品溶液；5)对照溶液的制备：取步骤3)所得的供试品溶液，用稀释液稀释成制成l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为供试品溶液浓度千分之一的溶液，作为对照溶液；6)系统适用性溶液的制备：分别称取l-2-氨基-5-胍基戊酸与2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的一种或多种各适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml中约含l-2-氨基-5-胍基戊酸2.5mg、2-酮基戊二酸2.5μg、(s)-2-乙酰氨基戊二酸2.5μg与(e)-2-丁烯二酸0.25μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；7)空白溶剂的制备：取步骤2)所得的稀释液作为空白溶剂；8)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为3～10mg/ml的缓冲盐溶液(ph值2.0～2.5)为流动相a，以乙腈为流动相b；流速为每分钟0.4～0.6ml；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为205～215nm；柱温为28～32℃；进样量为10～30μl；取步骤6)制备的系统适用性试验溶液进行系统适用性试验，l-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；9)l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的测定：取步骤3)、4)和5)所制备的供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各10～30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的含量；按自身对照法以对照溶液主峰面积计算其他单个未知杂质和其他未知杂质总和的含量。进一步，l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测方法，所述的梯度洗脱为下表所示梯度洗脱。相比现有技术，本发明具有如下有益效果：1、本发明检验方法具有较高的灵敏度、准确度、精密度，耐用性强，可准确反映l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药有关物质的含量，适合工业上用于l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质的检测及质量控制，从而为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用的安全性。2、本发明能有效检测出l-2-氨基-5-胍基戊酸的有关物质，有利于l-2-氨基-5-胍基戊酸生产的过程控制，也有利于更好地进行产品质量控制，确保食用和药用安全。系统适用性试验的l-2-氨基-5-胍基戊酸与相邻溶剂峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；所述高效液相色谱法检测l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质时，检测2-酮基戊二酸和(s)-2-乙酰氨基戊二酸的灵敏度为0.1％，检测(e)-2-丁烯二酸的灵敏度为0.01％，检测其他未知杂质的灵敏度为0.1％。3、本发明最突出的特点之一是解决了l-2-氨基-5-胍基戊酸与有机酸类同系物杂质的分离度问题。本发明通过流速选择、流动相比例选择、缓冲盐浓度选择、洗脱方式选择、色谱柱选择等研究，实现了l-2-氨基-5-胍基戊酸与各有机酸类同系物杂质的有效分离，可对同系物杂质2-酮基戊二酸、(s)-2-乙酰氨基戊二酸和(e)-2-丁烯二酸的含量进行定量检测。图1显示，l-2-氨基-5-胍基戊酸发酵液的有关物质非常复杂，利用本发明能清楚地掌握产品纯化过程杂质的去除状况。4、本发明最突出的特点之二是解决了l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质检测的灵敏度问题。l-2-氨基-5-胍基戊酸及其同系物杂质的紫外吸收非常弱，各组分的检测信号很弱，因而灵敏度很低，不能满足有关物质的限度要求。本发明以对照品溶液中各同系物杂质浓度与供试品溶液l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度之比为主要研究对象，通过多种技术手段使该比值获得提高，以满足各组分的检测灵敏度。附图说明图1：l-2-氨基-5-胍基戊酸发酵液的有关物质色谱图图2：样品有关物质检测的色谱图图3：系统适用性试验的色谱图图4：未破坏的色谱图图5：强酸破坏的色谱图图6：高温破坏的色谱图图7：强光破坏的色谱图具体实施方案下面通过具体优选实施方式对本发明作进一步描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1：三批l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药及其有关物质检测仪器及色谱条件：采用安捷伦1260高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×250mm，5μm)，柱温为30℃；流速为0.5ml/min；检测波长为210nm；进样量为20μl；取磷酸二氢钠3.9克，加水溶解并稀释至1000ml，用20％磷酸调节ph值至2.3作为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表进行洗脱，其比例如下：精密量取供试品溶液、对照品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法，以峰面积计算2-酮基戊二酸(杂质a)、(s)-2-乙酰氨基戊二酸(杂质b)和(e)-2-丁烯二酸(杂质c)的含量；以自身对照法计算未知单杂和未知总杂的含量；实验步骤：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药适量，加稀释液[磷酸盐缓冲液-乙腈(92:8)]溶解并稀释制成每1ml中约含2.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密称取杂质a、b、c对照品适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中含杂质a2.5μg、杂质b2.5μg与杂质c0.25μg的溶液，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液适量，加稀释液稀释制成每1ml中约含2.5μg的溶液，作为对照溶液；取稀释液作为空白溶剂。取l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药、杂质a、杂质b、杂质c对照品各适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml中l-2-氨基-5-胍基戊酸2.5mg、杂质a2.5μg、杂质b2.5μg与杂质c0.25μg的溶液，作为系统适应性溶液。系统适用性试验中l-2-氨基-5-胍基戊酸及各杂质保留时间及分离度结果见下表：注：未知杂质2是杂质b对照品带来的杂质，计算为杂质b，下同。系统适用性溶液在测定条件下，主峰与相邻杂质分离度均大于2.0，l-2-氨基-5-胍基戊酸峰后各已知杂质与相邻杂质分离度均大于1.5，系统适用性良好。三批l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药有关物质检测结果见下表，色图谱见图2：样品批号杂质a(％)杂质b(％)杂质c(％)未知单杂(％)未知总杂(％)20180501———0.0510.13720180502———0.0570.12320180503———0.0560.118实施例2：有关物质定位试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：分别称取杂质a、杂质b、杂质c对照品适量，分别用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml约含杂杂质a、杂质b为2.5μg、杂质c为0.25μg的溶液作为各杂质的定位溶液；混合溶液的配制方法同实施例1的系统适用性溶液，取上述各杂质的定位溶液和混合溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。l-2-氨基-5-胍基戊酸与各杂质的分离度结果见下表，色图谱见图3：结果显示：l-2-氨基-5-胍基戊酸中的各有关物质及各有关物质之间均能达到良好分离。实施例3：专属性破坏试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：分别称取杂质a、杂质b、杂质c对照品适量，分别用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml约含杂质a、杂质b为2.5μg、杂质c为0.25μg的溶液作为各杂质的定位溶液；混合溶液的配制方法同实施例1的系统适用性溶液，取上述各杂质的定位溶液和混合溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。l-2-氨基-5-胍基戊酸与各杂质的分离度结果见下表，色图谱见图3：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸适量，在0.5mol/l盐酸溶液、180℃高温和4500lx强光条件下分别对其进行强制破坏试验，各破坏样品配制方法见下表，图谱见图4～图7：分别按下表配制各专属性破坏样品溶液：取上述溶液分别进样并记录色谱图，破坏结果见下表：结果表明：在强酸和强光破坏样品中均未检出杂质a、杂质b和杂质c，说明强酸和强光均不会使l-2-氨基-5-胍基戊酸转化生成杂质a、杂质b和杂质c；在高温破坏样品中能检出杂质b和c；在强酸和强光破坏条件下，l-2-氨基-5-胍基戊酸、杂质a、杂质b、杂质c峰与前后峰的分离度均超过1.3，不影响其定量检测，l-2-氨基-5-胍基戊酸的峰纯度均大于995，而高温破坏情况下l-2-氨基-5-胍基戊酸的峰纯度下降至960～970；高温破坏样品中能检出杂质b和杂质c，不能检出杂质a，高温破坏还有许多其他杂质，本方法能以未知杂质和未知总杂质检出。可见，本方法对杂质a、杂质b和杂质c检测具有较好的专属性。实施例4：定量限、检测限试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：采用信噪比法测定l-2-氨基-5-胍基戊酸及其各有关物质的检测限和定量限。分别配制l-2-氨基-5-胍基戊酸和各有关物质的贮备液，稀释至一定浓度并进样，计算峰高和噪音的比值(信噪比)，当信噪比(s/n)约为10的样品检测量即为定量限，信噪比(s/n)约为3的样品检测量即为检测限，具体配制方法如下：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸、杂质a、杂质b和杂质c对照品适量，用稀释液溶解并稀释制成每1ml约含l-2-氨基-5-胍基戊酸为0.1μg、杂质a为0.1μg、杂质b为0.25μg和杂质c为0.005μg的溶液，作为有关物质检测限溶液；另用稀释剂稀释制成每1ml约含l-2-氨基-5-胍基戊酸为1μg、杂质a为0.5μg、杂质b为0.75μg和杂质c为0.025μg的溶液，作为定量限溶液；取上述溶液分别进样20μl，定量限溶液中各成分的信噪比(s/n)约为10，检测限溶液信噪比(s/n)约为3。l-2-氨基-5-胍基戊酸有关物质各成分的定量限、检测限具体结果见下表：结果显示：l-2-氨基-5-胍基戊酸及各有关物质的定量限浓度均小于供试品浓度的0.04％，能够准确控制各有关物质的含量。实施例5：线性试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸及各有关物质适量，用稀释剂溶解，配制不同浓度的溶液，具体配制方法如下：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸、杂质a、杂质b和杂质c对照品适量，分别用稀释剂溶解并稀释制成约含l-2-氨基-5-胍基戊酸10μg/ml、杂质a10μg/ml、杂质b5μg/ml和杂质c10μg/ml的溶液，作为线性贮备液。按下表配制各线性测试溶液，用于有关物质线性试验：取上述溶液分别进样并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到l-2-氨基-5-胍基戊酸与杂质a、杂质b和杂质c的线性回归方程；有关物质的线性结果见下表：化合物线性范围(μg/ml)线性回归方程回归系数r2l-2-氨基-5-胍基戊酸1～6y＝4.6618x+3.67050.9961杂质a0.5～6.0y＝26.959x-5.37370.9972杂质b0.75～3.0y＝17.867x+4.53810.9979杂质c0.025～6.0y＝312.19x+1.66610.9999结果显示：l-2-氨基-5-胍基戊酸与杂质a、杂质b和杂质c在一定浓度范围内，均呈现良好线性关系。实施例6：准确度试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：分别精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸及各有关物质适量，用稀释液配制成含有l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为2.5mg/ml及杂质a、杂质b和杂质c浓度分别为2.0μg/ml、2.0μg/ml和0.20μg/ml，为低浓度溶液；配制成含有l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为2.5mg/ml及杂质a、杂质b和杂质c浓度分别为2.5μg/ml、2.5μg/ml和0.25μg/ml，为中浓度溶液；配制成含有l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为2.5mg/ml及杂质a、杂质b和杂质c浓度分别为3.0μg/ml、3.0μg/ml和0.30μg/ml，为高浓度溶液；上述溶液用于有关物质的准确度试验，每个浓度三份；分别进样并记录色谱图，计算回收率，结果见下表：化合物低浓度平均回收率(％)中浓度平均回收率(％)高浓度平均回收率(％)杂质a97.93103.0295.23杂质b97.84100.26102.24杂质c99.9699.97101.20结果表明：各有关物质在低中高浓度范围内，平均回收率均在95％～105％之间，说明本方法的准确度良好。实施例7：耐用性试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：取系统适用性溶液，分别改变色谱条件，如流速变化±0.1ml/min、温度变化±5℃、波长变化±5nm、流动相变化±5％、不同型号色谱柱等，按照本方法进行色谱分析。根据杂质a、杂质b和杂质c色谱峰的拖尾因子、分离度、含量数据的rsd及其杂质含量的绝对值变化，评价本方法的耐用性。本方法的耐用性试验设计见下表：本方法的耐用性试验结果见下表：结果表明：在不同色谱条件下，杂质a、杂质b和杂质c含量的绝对值变化分别在±0.00629％、±0.00946％和±0.00034％以内，满足不大于±0.1％的可接受要求；分别与前后峰能够实现有效分离(分离度>1.17)，拖尾因子均小于2，说明本方法用于l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药有关物质检测的耐用性良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12