狂犬病抗体胶体金检测试剂的制作方法

本实用新型涉及检测检验技术领域，具体地涉及一种狂犬病抗体胶体金检测试剂。

背景技术：

狂犬病(Rabies Virus，RV)病毒属于弹状病毒科、狂犬病病毒属，形态呈子弹状，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。病毒基因组由11930左右个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，病毒粒子由5个结构蛋白构成，核蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L)。狂犬病毒是一种人兽共患传染性病原体，该病是迄今为止人类唯一病死率高达100％的急性传染病，每年在世界范围内造成约5万以上死亡病例，亚洲是狂犬病持续高发地区，我国是养犬大国，也是狂犬病发病率较高的国家。预防狂犬病唯一有效的办法是及时接种狂犬病疫苗，同时加强检测疫苗免疫效果，以掌握免疫情况。

目前常见的狂犬病抗体检测方法为快速荧光灶抑制试验(RFFIT)法和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法两种以及竞争ELISA试验方法等，这些方法都具有特异性强、敏感性高等优点。但这些种方法均存在检测时间长、对实验室条件要求高、操作技能要求高、操作繁琐及需要单份样品量多等缺点。鉴于此，开发快速简便的检测及时掌握免疫情况为预防控制此病毒的传播是非常必要的。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种狂犬病抗体胶体金检测试剂。

具体地，本实用新型的目的在于提供一种免疫快速检测狂犬病抗体的检测卡，本实用新型的检测卡具有较高的灵敏度和准确性。

本发明金标免疫检测法，建立对犬血液样品的抗体直接检测，此方法操作简便、准确、检测时短等特点，是一个非常有效实用的检测法。

在本实用新型的第一方面，提供了一种狂犬病抗体胶体金检测试剂，所述检测试剂包括一检测卡(侧流片)，所述的检测卡包括背衬(7)，以及位于所述背衬上的从近端到远端的以下结构：样品垫(1)、金标垫(2)、检测区(3)、质控区(4)、硝酸纤维素膜(5)、和吸收垫(6)；

并且所述的金标垫(2)包被有胶体金标记的狂犬病抗原；

并且所述检测区(3)包被有狂犬病抗原。

在另一优选例中，所述标记抗原和包被抗原可以相同种。

在另一优选例中，所述胶体金标记的抗原和所述检测区(3)包被的抗原是相同的。

在另一优选例中，所述的抗原结合于狂犬免疫和病毒产生的抗体。

在另一优选例中，所述的质控区(4)包被有能结合于所述狂犬病抗原的二抗。

在另一优选例中，所述的质控区(4)包被二抗为兔抗狂犬抗原IgG。

在另一优选例中，所述的40nm胶体金颗粒。

在另一优选例中，所述的背衬(7)为PVC板。

在另一优选例中，所述样品垫(1)为玻璃纤维。

在另一优选例中，所述吸收垫(6)为吸水纸。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(5)、和吸收垫(6)粘贴于所述背衬上。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)和金标垫(2)部分重叠。

在另一优选例中，所述的检测区(3)设置在靠近金标垫(2)的一侧，且所述的质控区(4)设置在靠近吸收垫(6)的一侧。

在另一优选例中，所述检测试剂还包括卡盒(8)，以及位于所述卡盒上的加样孔(9)和观察窗(10)。

在另一优选例中，所述的检测卡完全设置于卡盒(8)中，所述加样孔(9)对应于所述检测卡上的样品垫(1)，且所述观察窗(10)对应于所述检测卡上的检测区(3)和质控区(4)。

在另一优选例中，所述卡盒的长度为80-90mm，宽度为10-20mm，且高度为4-5mm。

在另一优选例中，所述检测卡的长度为60-70mm，且宽度为3-4mm。

在另一优选例中，所述的检测区(3)和质控区(4)位于硝酸纤维素膜(5)上。

在另一优选例中，所述检测试剂检测的样本包括全血、血浆、血清。

在本实用新型的第二方面，提供了一种用于狂犬病抗体胶体金检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)一容器；以及

(ii)如本实用新型第一方面所述的狂犬病抗体胶体金检测试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。

应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本实用新型一种优选例的检测卡的结构剖视图。其中，1为样品垫，2为金标垫，3为检测区，4为质控区，5为硝酸纤维素膜，6为吸收垫，7为背衬。

图2为本实用新型一种优选例的狂犬病抗体胶体金检测试剂(检测卡和卡盒)的俯视图。其中，8为卡盒，9为加样孔，10为观察窗。

具体实施方式

本实用新型人经过广泛而深入地研究，开发了一种狂犬病抗体胶体金检测试剂，所述检测试剂包括一检测片和一卡盒，检测片包括背衬7以及位于背衬上的样品垫1，金标垫2，检测区3，质控区4，硝酸纤维素膜5，吸收垫6，所述的金标垫(2)包被有胶体金标记的狂犬病抗原；并且所述检测区(3)也包被有狂犬病抗原。本实用新型的检测试剂可检测狂犬免疫抗体和病毒抗体，稳定性好、灵敏度高、使用方便。在此基础上，完成了本实用新型。

检测方法和工作原理

为了便于理解本实用新型，给出本实用新型检测试剂的检测原理。应理解，本实用新型的保护范围并不受该原理的影响或限制。

本发明提供的一种快速检测狂犬病抗体的免疫检测试剂，其包括一检测卡和一卡盒，采用双抗原免疫夹心法原理检测狂犬病抗体。具体地，是将胶体金标记的狂犬病抗原吸附在结合垫上，同时又将另一狂犬病抗原(可以与胶体金标记的狂犬病抗原相同或不同)固定在硝酸纤维膜上，再将结合垫和硝酸纤维膜组装到PVC板上，两头分别贴样品垫和吸水纸便形成检测条。检测时，当待检样本加到试纸条(检测卡)一端的样品垫后，液体样通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记物，如果样本中含有被检测的狂犬病抗体时，抗体被胶体金标记的狂犬病抗原捕获形成复合物，当复合物移动到膜的检测线处，又被固定在膜上的狂犬病抗原捕获形成双夹心复合物，也就是抗体与胶体标记的抗原的结合物又被检测线处的抗原结合而截留聚积在检测带上形成颜体色带，颜色强弱程度，也就是样品中抗体的情况；如果样品中没有抗体，溶解的胶体金没有被检测线截留，在检测区没有出现颜色带，样品为阴性样品。为了便于判断反应进行和试剂的好坏，在质控区(C)固定质控线，所以不管结果怎样，质控线C始终出现色带，来证明试剂有效性。由此所述的检测试剂便于携带和保存、操作简单、检测过程5-10min之内完成。

灵敏度

本实用新型的狂犬病抗体胶体金检测试剂的灵敏度在0.3IU/ml以上。

特异性

本实用新型的狂犬病抗体检测试剂对犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬副流感度、犬冠状病毒等特异性抗体检测结果均为阴性。

检测试剂的制造

在本实用新型中，所述检测试剂的各组分(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

背衬7可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其上的各组分。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬7较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬7是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。

样品垫1可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纤维素、玻璃纤维等。

吸收垫6可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫6的吸收能力应足够大，以便吸收添加至检测卡的液体全部经过检测区。适用于吸收垫6的材料的例子包括纤维素和吸水滤纸。

胶体金标记

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

检测试剂的制备

本实用新型检测试剂的各组分(或组件)采用本领域通用的技术方法制造和组装。

优选地，用包被缓冲液稀释狂犬病抗原和质控抗体，将稀释后的两种捕获液分别均匀地包被于作为检测部件的硝酸纤维膜上，两种捕获液体渗入硝酸纤维素膜后分别形成检测区和质控区。

分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫通过粘合剂粘贴于背衬上。用切条机切成4mm的检测卡，置于卡盒内，加样孔对准检测卡样品垫位置，压紧后组装成检测试剂盒，加入干燥剂用铝箔密封包装保存。

检测试剂的结构

本实用新型的狂犬病抗体胶体金检测试剂包括卡盒和位于卡盒内的检测卡(侧流片、试纸条、检测条、或测试条)。

一种优选的检测卡的结构如图1所示，其包括背衬7，以及位于背衬上的：样品垫1、金标垫2、检测区3、质控区4(或对照区、对照线、质控线)、硝酸纤维素膜5、和吸收垫6。

一种优选的卡盒8的结构如图2所示，其上包括加样孔9和观察窗10。并且，所述的检测卡完全设置于卡盒8中，所述加样孔9对应于所述检测卡上的样品垫1，且所述观察窗10对应于所述检测卡上的检测区3和质控区4。

具体地，本实用新型的检测试剂具有以下特点：

背衬7的长度与检测卡相同。

样品垫1位于检测卡的一端，吸收垫6位于检测卡的另一端。

金标垫2上负载有胶体金标记的狂犬病抗原。

检测区3(也称检测线)位于样品垫1和吸收垫6之间，检测区3位于靠近样品垫1的一端，检测区设置在硝酸纤维素膜5上，通过所述硝酸纤维素膜连接标记的金标垫2和吸收垫6。优选地，所述硝酸纤维素膜5上还设置有质控区4(也称质控线)，质控区4位于检测区3和吸收垫6之间。

其中，所述的检测区3包被有狂犬病抗原，质控区4包被有二抗。

本实用新型的优点：

本实用新型检测试剂可特异性检测狂犬病抗体，稳定性好、灵敏度高、特异性强、使用方便、常温保存和运输，可用于检测疫苗免疫效果，以掌握免疫情况同时通过检测也掌握此病毒感染情况及时控制病源扩散。

下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

狂犬病抗原制备

1生产毒种

制造本品所用毒种为狂犬病病毒Flury-LEP株、CVS-11株、PV株和SAD株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

2细胞

制造本品所用细胞为能够形成致密单层、生长良好的Vero细胞，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

3毒液制备

将每种狂犬病病毒毒株的冻干毒种按安瓿瓶标签标明装量用无血清MEM细胞营养液水化，按细胞生长液的1％～3％接种Vero细胞单层，置37℃吸附1小时后，加入含2％牛血清的MEM细胞营养液，33～35℃培养5～6日，将细胞瓶移至-20℃，反复冻融3次后收获病毒液，分别分装并置-20℃冻结保存。

4抗原浓缩和灭活

将每种抗原分别解冻后，以12000rpm，离心30min后，取上清，经超滤浓缩包浓缩10倍，将浓缩后的悬液按照体积比1:4000的比例加入β-丙内酯，4℃条件下边搅拌，边灭活，连续灭活36h，将灭活后的病毒液置于37℃水解2h，-20℃冻结保存。

5抗原纯化

将每种灭活后的抗原分别解冻后，经镍离子琼脂糖凝胶6FF亲和层析纯化，收集狂犬病病毒抗原，-20℃冻结保存。

实施例3

检测狂犬病毒的检测卡的制备

1、金标垫制备

选40nm胶体金，用0.1M K2CO3调pH到等电点附近，以每毫升胶体金5μg抗原进行标记，标记液离心后得沉淀，沉淀用10mM pH7.2PBS溶解，并在650nm下测定吸光值OD，以基础液1-3OD稀释，涂铺聚脂材料上，在37℃，相对湿度小于20％干燥室烘干10小时，即抗原-Au金标垫。

2、硝酸纤维素膜检测区和对照区的制备

在硝酸纤维膜的检测区上包被浓度0.4-1.0mg/ml含2％蔗糖的0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中的抗原，同时在对照区包被浓度为0.8mg/ml含2％蔗糖的0.01MpH7.3磷酸盐缓冲兔抗狂犬抗原IgG，包被量为10μl/cm²，在37℃，相对湿度小于20％干燥室烘干15小时。

3、样品垫的制备

按下20mM pH7.4磷酸缓冲液含胆酸钠0.5％，S17 1％配制，均匀铺在样品垫聚酯纤维上并维持在37℃，相对湿度小于20％烘干。

4、测试卡组装

将包被抗原和兔抗狂犬抗原IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸水纸、一定宽度的胶体金标记垫(Au-抗原)、样品垫依次贴在PVC板上组成测试大卡，将大卡切3-4mm条装卡中，装入铝箔袋中封好，就是组成完整的相应的检测抗体测试卡。

实施例4

样品的检测

1.采集检测样本，样本可以是全血、血浆、血清，本实施例采用新鲜血液作为检测样本。

2.将检测卡平放，用滴管吸取待检样本液，垂直滴加2-3滴于加样孔中，加样后开始计时。

3.5-10分钟读取检测结果。

4.结果判断：

A：检测区、和质控区同时变色(红色)，表明检测样本中含有狂犬病免疫抗体或病毒感染抗体，检测结果为阳性。

B:质控区变色(红色)，而检测区不变色，表明检测样本中不含狂犬病抗体或狂犬病抗体的浓度低于最低检测值，检测结果为阴性。

C：质控区不变色，无论检测区是否变色，均表明本次检测无效。

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。