一种天然植物提取物中残留二氧化硫的快速检测方法与流程

本发明涉及一种天然植物提取物中残留二氧化硫的快速检测技术，尤其涉及一种采用拉曼光谱特征峰信号强度的检测方法，适用于保健食品中天然植物提取物的残留二氧化硫检测方法。

背景技术：

二氧化硫具有漂白性。工业上常用二氧化硫来漂白纸浆、毛、丝、草帽等。二氧化硫的漂白作用是由于它(亚硫酸)能与某些有色物质生成不稳定的无色物质。这种无色物质容易分解而使有色物质恢复原来的颜色，因此用二氧化硫漂白过的草帽辫日久又变成黄色。二氧化硫和某些含硫化合物的漂白作用也被一些不法厂商非法用来加工保健食品中天然植物提取物，以使天然植物提取物增白等。食用这类保健食品，对人体的肝、肾脏等有严重损伤，并有致癌风险。

目前，食品中二氧化硫的检测方法(gb5009.34)为蒸馏法：在密闭容器中对样品进行酸化、蒸馏，蒸馏物用乙酸铅溶液吸收。吸收后的溶液用盐酸酸化、碘标准溶液滴定，根据所消耗的碘标准溶液量计算出样品中的二氧化硫含量。

发明专利《一种枸杞中二氧化硫的快速检测方法》(公开号104198485a)中采用二氧化硫易被氧化的原理进行设计，先采用碱溶液对二氧化硫进行提取，再采用酸溶液酸化，同时对蒸馏瓶进行加热，利于二氧化硫从蒸馏瓶中释放出，再将释放出的二氧化硫加入到含有滴定液的淀粉溶液中进行氧化还原反应，观察淀粉溶液颜色的变化，判断滴定终点，根据消耗的滴定液体积计算出二氧化硫的量。

发明专利《一种食品中二氧化硫的检测方法》(公开号106323944a)中利用拉曼光谱仪进行筛选样品中是否含有二氧化硫，具体操作方法，将加入样品的水中，加入碳酸盐与酸，生产二氧化碳；利用氢氧化钠溶液收集蒸馏气体及水蒸气，等到的二氧化硫待测液，并通过加入金属纳米溶胶及无机盐絮凝剂混匀，利用拉曼光谱仪检测。实现大批量样品的快速筛选。

发明专利《一种食品中二氧化硫残留的快速检测方法》(公开号103698314a)中，

技术实现要素：
为：(1)提取：取1重量份样品于容器中，同时加入0.1-10重量份的碳酸盐、碳酸氢盐或硼氢化钠等产气片物质，0.05-10重量份消泡剂，然后再加入反应试剂酸，加入的量为样品g/试剂体积比ml＝1:10-50；在沸腾情况下蒸馏，利用2-10ml碱性溶液收集蒸馏所产生的二氧化硫气体；加入的量为样品g/碱性溶液体积比ml＝1:2-10；成为收集液；(2)检测：取上述收集液于玻璃检测池，之后加入金属纳米溶胶及无机盐絮凝剂混匀，然后放在便携拉曼光谱仪检测室内进行检测。本发明方法检测时间短、可实现大批量样品的快速筛选。

发明专利《硫熏食品或药品的鉴定方法》(公开号105806822a)包括以下步骤：(a)对待测样品进行预处理以形成待测样品提取液；(b)用激发光照射待测样品提取液并收集来自待测样品提取液的拉曼散射光；(c)由所收集到的拉曼散射光获得待测样品提取液的拉曼光谱曲线；以及(d)将该拉曼光谱曲线与参考拉曼光谱曲线进行对比以确定待测样品中是否含有二氧化硫残留物。

但这些方法理化方法耗时长、灵敏度差；仪器方法前处理和仪器操作过程复杂、费时(大约需要2-3小时)、仪器昂贵。

拉曼光谱1928年被发现，1930年获得诺贝尔物理学奖，它普遍存在于一切分子中，能够可靠地提供分子的结构信息，不受各种溶剂的影响，随着激光光源的使用，激光拉曼光谱已经成为重要化合物的分析手段，广泛应用于刑侦鉴定、矿物质分析等领域，1974年fleischmannm发现的表面增强拉曼散射使痕量物质检测成为可能。表面增强拉曼光谱技术(sers)利用痕量分子吸附于cu、ag、au等金属溶胶和电极表面，其拉曼光谱信号可增强10⁴～10⁶，克服了常规拉曼光谱法灵敏度低的缺点。

近年来随着表面增强技术、傅里叶红外技术与表面增强拉曼光谱的结合，已开始应用于天然植物提取物安全检测。表面增强拉曼光谱(sers)具有快速灵敏、信息丰富、选择性高等特点，但主要用于定性检测。

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种基于表面增强拉曼光谱试验，稳定、快速、可定性、定量的检测天然植物提取物中残留二氧化硫的方法。

发明内容

本发明涉及一种快速提取天然植物提取物，并定性、定量分析天然植物提取物中二氧化硫的检测技术，采用拉曼光谱特征峰信号强度，选择618cm^-1(±3cm^-1)作为特征拉曼峰，定性准确，整个检测过程在15分钟内完成，实现快速定性、定量、便捷、低成本。

本发明采用超声波对天然植物提取物中残留二氧化硫进行提取，并用表面增强激光拉曼光谱特征峰信号强度对天然植物提取物材中二氧化硫快速定性、定量，其中：包括以下步骤：

(一)二氧化硫标准溶液配制

a.环己二胺四乙酸二钠溶液，c(cdta-2na)＝0.05mol/l

称取1.82g反式1，2-环己二胺四乙酸(cdta)，加入氢氧化钠溶液(1.5mol/l)6.5ml，用水稀释至100ml。

b.甲醛缓冲吸收液

吸取36％～38％的甲醛溶液5.5ml，cdta-2na溶液20.00ml；称取2.04g邻苯二甲酸氢钾，溶于少量水中；将三种溶液合并，在用水稀释至100ml。再稀释100倍，临用稀释。

c.二氧化硫标准溶液

称取0.200g亚硫酸钠，溶于200ml乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)溶液(0.05g/100ml)中，缓缓摇匀使其溶解。放置2～3h后标定。此溶液每毫升相当于320～400μg二氧化硫。

标定方法：吸取三份20.00ml上述二氧化硫标准溶液，分别置于250ml碘量瓶中，加入50ml新煮沸但已冷却的水，20.00ml碘溶液(0.05mol/l)及1ml冰乙酸，盖塞，摇匀。于暗处放置5min后，用硫代硫酸钠标准溶液(0.05mol/l)滴定溶液至浅黄色，加入2ml淀粉溶液(0.5g/100ml)，继续滴定至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录滴定硫代硫酸钠标准溶液的体积v，ml。

吸取三份edta-2na溶液20ml，用同法进行空白实验。记录滴定硫代硫酸钠标准溶液的体积v0，ml。

平行样滴定所耗硫代硫酸钠标准溶液体积之差应不大于0.04ml。取其平均值。

(二)样品前处理过程

a.称取一定量样品，研磨成粉于离心管中，加入适量纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

所述加入纯水与待测样品的质量比为1-10:1；优选1-5:1；更优选4:1。

(三)表面增强激光拉曼光谱速测分析

取一定量待测液，依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，记录618cm^-1(±3cm^-1)对应峰的强度，从标准曲线上查出对应的二氧化硫含量。

所述表面增强试剂为金纳米溶胶、银纳米溶胶或铜纳米溶胶中的任意一种，优选金纳米溶胶；

所述无机盐凝聚剂为氯化钠水溶液或氯化钾水溶液；

所述氯化钠水溶液或氯化钾水溶液浓度为0.1％-10％质量分数的水溶液；

所述表面增强试剂与待测液的体积比为1:3-4；优选1:3；

所述无机盐凝聚剂与待测液的体积比为1:1-10；优选1:1-5。

本发明采用专用并固化于便携式拉曼光谱仪的专用软件来实现的一种对天然植物提取物中二氧化硫的超快速、高灵敏、低成本、现场鉴别方法。一个样品检测时间小于15分钟，操作简单，不需要操作人员有较强的专业背景，读数直观，可直接从仪器界面上读取数值。

本研究首次将该技术应用到天然植物提取物中二氧化硫的定量检测，通过对二氧化硫的拉曼光谱特性分析，检测天然植物提取物中二氧化硫含量情况，试验在15min内完成，检出限达到10mg/kg，完全满足国家标准要求，具有准确、快速、无损、低成本的明显特点，适用于现场应急检测、企业自控检测和大批量样品筛查检测等，有效辨别问题天然植物提取物，保护消费者权益。

本发明的优点：

1、简单方便，成本低廉，利于现场操作，快速给出检测结果；

2、同时实现定性分析和定量检测；

3、大大减少强酸的使用量，减少对操作人员的危害，同时减少废弃物对环境的污染；

4、速度快(15min内)、灵敏度高(10mg/kg)、低成本(每个样品检验约需成本2元左右)、易操作。

附图说明

图1天然植物提取物中含10mg/kg的二氧化硫拉曼光谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述。但不以此限制本发明。

一、二氧化硫标准溶液配制，提前准备好。

a.环己二胺四乙酸二钠溶液，c(cdta-2na)＝0.05mol/l

称取1.82g反式1，2-环己二胺四乙酸(cdta)，加入氢氧化钠溶液(1.5mol/l)6.5ml，用水稀释至100ml。

b.甲醛缓冲吸收液

吸取36％～38％的甲醛溶液5.5ml，cdta-2na溶液(6.1.1)20.00ml；称取2.04g邻苯二甲酸氢钾，溶于少量水中；将三种溶液合并，在用水稀释至100ml。再稀释100倍，临用稀释。

c.二氧化硫标准溶液

称取0.200g亚硫酸钠，溶于200ml乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)溶液(0.05g/100ml)中，缓缓摇匀使其溶解。放置2～3h后标定。此溶液每毫升相当于320～400μg二氧化硫。

标定方法：吸取三份20.00ml上述二氧化硫标准溶液，分别置于250ml碘量瓶中，加入50ml新煮沸但已冷却的水，20.00ml碘溶液(0.05mol/l)及1ml冰乙酸，盖塞，摇匀。于暗处放置5min后，用硫代硫酸钠标准溶液(0.05mol/l)滴定溶液至浅黄色，加入2ml淀粉溶液(0.5g/100ml)，继续滴定至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录滴定硫代硫酸钠标准溶液的体积v，ml。

吸取三份edta-2na溶液20ml，用同法进行空白实验。记录滴定硫代硫酸钠标准溶液的体积v0，ml。

平行样滴定所耗硫代硫酸钠标准溶液体积之差应不大于0.04ml。取其平均值。二氧化硫标准溶液浓度按下式计算：

式中：

c---二氧化硫标准溶液的浓度，μg/ml

v0---空白滴定所耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml

v---二氧化硫标准溶液滴定所耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml

---硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/l

32.02---二氧化硫(1/2so2)的摩尔质量。

标定出准确浓度后，立即用吸收液稀释为2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml的二氧化硫的标准溶液。

二、样品制备

a.称取1克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入4g纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

三、定性测定

仪器条件

a)激光功率：200mw。

b)积分时间：10sec。

c)平均次数：2。

d)平滑参数：1。

取一定量待测液，依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：有则说明样品中含有二氧化硫，如无明显特征拉曼峰，则说明样品中二氧化硫含量在检测限值以下。

四、定量测定

对测定的拉曼谱图进行基线调整和归一化处理，得到二氧化硫标准曲线，基本操作如下：

(1)首先将测定的拉曼光谱数据进行基线调整；

(2)以618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；

(3)归一化后得到的特征拉曼峰强度可根据当天测得的标准曲线进行定量评估，此分析方法适用浓度范围是10～200mg/kg。

计算

绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

结果按式(1)计算：

式中：

x—样品天然植物提取物中二氧化硫的含量，单位为毫克/千克(mg/kg)；

c—从标准曲线得到的二氧化硫含量，单位为毫克/升(mg/l)；

v—样品定容体积，单位为毫升(ml)；

m—样品称量质量，单位为克(g)。

允许差

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均数的10％。

实施例1白术提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售白术提取物。

a.称取1克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入4ml纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.3ml金纳米溶胶、0.1ml1％的氯化钠溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处有特征峰，则说明样品中含有二氧化硫。

定量分析：

根据618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；根据当天测得的标准曲线进行定量评估。

计算出样品中二氧化硫的含量x＝(2.5*4)/1＝10mg/kg。

实施例2当归提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售当归提取物。

a.称取5克样品，研磨成粉于50ml离心管，加入25ml纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.4ml金纳米溶胶、0.5ml1％的氯化钠溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处没有特征峰，样品中二氧化硫含量在检测限值以下。说明样品可能无二氧化硫残留，如果有，含量也在10mg/kg以下，远远低于国家标准要求的数值。

实施例3当归提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售当归提取物。

a.称取1克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入6g纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.3ml银纳米溶胶、0.1ml1％的氯化钾溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处有特征峰，则说明样品中含有二氧化硫。

定量分析：

根据618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；根据当天测得的标准曲线进行定量评估。

计算出样品中二氧化硫的含量x＝(20*6)/1＝120mg/kg。

实施例4白花前胡提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售白花前胡提取物。

a.称取10克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入10g纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.3ml银纳米溶胶、0.1ml1％的氯化钾溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处有特征峰，则说明样品中含有二氧化硫。

定量分析：

根据618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；根据当天测得的标准曲线进行定量评估，

计算出样品中二氧化硫的含量x＝(30.0*10)/10＝30mg/kg。

实施例5金盏花提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售金盏花提取物。

a.称取5克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入10g纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.4ml金纳米溶胶、0.4ml1％的氯化钾溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处有特征峰，则说明样品中含有二氧化硫。

定量分析：

根据618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；根据当天测得的标准曲线进行定量评估。

计算出样品中二氧化硫的含量x＝(5*10)/5＝10mg/kg。

实施例6甘草提取物中残留二氧化硫定性、定量分析

样品：取自市售甘草提取物。

a.称取1克样品，研磨成粉于10ml离心管，加入10g纯水振荡，置于超声萃取仪中超声10分钟。

b.取1.5ml提取液于2ml离心管内，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

c.取1ml上清液于2ml离心管，依次加入200μlotr-fb-pr-a及200μlotr-fb-pr-b，涡旋混合1分钟，于离心机内离心2分钟(10000转/分钟)。

d.取500μl上清液于2ml离心管内，加入50μlotr-fb-sf，混合，所得溶液即为待测液。

定性分析：

取0.1ml待测液，依次加入0.4ml金纳米溶胶、0.1ml1％的氯化钾溶液，摇匀后检测，根据618cm^-1(±3cm^-1)处有无特征拉曼峰进行评估：

该待测液在618cm^-1(±3cm^-1)处有特征峰，则说明样品中含有二氧化硫。

定量分析：

根据618cm^-1(±3cm^-1)处的特征拉曼峰作为定量基准峰，对碱性嫩黄特征拉曼峰进行归一化处理；根据当天测得的标准曲线进行定量评估。

计算出样品中二氧化硫的含量x＝(20*10)/1＝200mg/kg。