一种多元检测芯片及其在营养性贫血检测中的应用的制作方法

本发明涉及生化检测领域，特别是用于多个营养性贫血相关标志物同步定量测定的多元检测芯片和检测方法。

背景技术：

据报道，全球15％以上的人都患有贫血症状。其中，由于营养摄入不均衡或是人体消化系统出现问题，导致营养性贫血成为了所有贫血中的主导部分。根据机理的不同，营养性贫血可分为由缺铁导致的缺铁性贫血和由缺叶酸或维生素b12导致的巨幼细胞性贫血，通过对血清中铁、叶酸和维生素b12这些相关标志物的浓度进行定量检测即可判断是否患有营养性贫血。目前针对营养性贫血只存在对单一标志物的生化检测方法，例如可以采用荧光探针来分别进行标志物铁、叶酸和维生素b12的浓度检测。能同步检测多个营养性贫血相关标志物的方法尚未见报道。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种用于多个营养性贫血相关标志物同步定量测定的多元检测芯片和检测方法。

在阐述本发明的方案之前，对以下英文简称予以解释：

ddh2o：去离子水；pei：聚乙烯亚胺；cdcl2：氯化镉；na2s：硫化钠；znso4：硫酸锌；pbs：磷酸盐缓冲液。

本发明方案为：

一种用于多个营养性贫血相关标志物同步定量测定的多元检测芯片，所述多元检测芯片设有多个样品反应区，不同的样品反应区加有针对不同标志物的荧光探针，所述标志物分别为铁、叶酸和维生素b12，其中用于检测铁的荧光探针为绿色荧光碳点，用于检测叶酸的荧光探针为黄色荧光碳点，用于检测维生素b12的荧光探针为蓝色荧光碳点，在365nm波长激发下，所述蓝色荧光碳点的最大发射波长在440nm波长附近、所述绿色荧光碳点的最大发射波长在525nm波长附近和所述黄色荧光碳点的最大发射波长在581nm波长附近，所述多元检测芯片为三通道芯片，所述三通道分别对应添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域，

其中，所述绿色荧光碳点的合成过程为：0.5g的多巴胺溶解在10ml的ddh2o中，充分震荡混合均匀。随后，加入250μl的乙二胺溶液，充分震荡混匀后，加入到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃加热6小时。冷却到室温以后，收集深棕色的溶液，超声30分钟，随后，8000rpm离心20分钟，除去较大的聚集颗粒，使用500da透析袋透析24小时，收集透析袋中的溶液，稀释到100ml，

所述蓝色荧光碳点的合成过程为：1g的柠檬酸三钠，1.01ml的二乙烯三胺加入到30ml的ddh2o中，充分震荡混匀以后，加入到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，160℃加热6小时。冷却到室温，0.2μm的滤膜过滤后，使用1000da透析袋透析10小时，收集透析袋中的溶液，

所述黄色荧光碳点的合成过程为：280mg的pei(mw:10000),1mmol的cdcl2,0.5mmol的na2s溶解在47.5ml的ddh2o中，充分震荡混匀以后，60℃加热搅拌15分钟，随后，逐滴加入2.5ml的znso4(0.08m),继续加热搅拌20分钟后，冷却到室温,使用12-14kd的透析袋在pbs缓冲液(0.01m，ph7.4)中透析1小时,收集透析液。

进一步的，上述多元检测芯片为三通道纸质点阵芯片，所述三通道纸质点阵芯片的多个样品反应区排列为3×3的点阵，其中所述点阵中每一行添加同一种荧光探针且对应一个所述通道。采用纸质点阵芯片作为信号载体，可以有效降低对样本量的需求，增加样本的保存和运输能力。

再进一步的，在所述三通道纸质点阵芯片中，每个样品反应区的直径为5mm，石蜡宽度为1mm，用于形成疏水的壁垒，防止样品渗出。

样品反应区探针溶液的浓度会直接影响检测结果。所加探针浓度太大，荧光强度太强，在强背景下由靶标物引起的荧光相对变化较小，影响检测灵敏度。反之，所加探针浓度太小，荧光强度太弱，稳定线性检测范围会很小。所以，再进一步的，蓝色荧光碳点的浓度为0.1mg/ml、绿色荧光碳点的浓度为0.5mg/ml以及黄色荧光碳点的浓度为1mg/ml。上述浓度值为最佳的探针溶度。

同时，本发明还公开了一种采用上述多元检测芯片的检测方法，包括：

步骤1：采用365nm波长激发所述多元检测芯片的样品反应区，分别获取添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域的荧光强度i0，其中用于检测铁的荧光探针为绿色荧光碳点，用于检测叶酸的荧光探针为黄色荧光碳点，用于检测维生素b12的荧光探针为蓝色荧光碳点；

步骤2：再在每个样品反应区上滴加标志物标准溶液，所述标志物标准溶液中含有的标志物为铁、叶酸和维生素b12，且所述标志物标准溶液中各标志物浓度已知，干燥一段时间；再次采用365nm波长激发所述多元检测芯片的样品反应区，分别获取添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域的荧光强度i，继而分别得到铁、叶酸和维生素b12的(i0-i)/i0值；

步骤3：继续执行步骤1和步骤2，最终分别建立铁、叶酸和维生素b12浓度与(i0-i)/i0值的标准曲线；

步骤3：将待测样品溶液取代所述标志物标准溶液，按照步骤1与步骤2得到待测样品溶液中铁、叶酸和维生素b12的(i0-i)/i0值，继而根据所述标准曲线得到所述待测样品溶液中铁、叶酸和维生素b12的浓度。

由于靶标物与荧光探针的结合程度也会对检测结果产生影响，随着反应时间的增加，三种荧光探针的荧光强度都逐渐增强，考虑到快速检测的需要，前述步骤2中干燥一段时间的具体过程为：将所述芯片放入60℃烘箱干燥5分钟。

本发明的有益效果在于：多元检测芯片设有多个样品反应区，不同的样品反应区加有针对不同靶标物的荧光探针，可以同时对血清中铁、叶酸和维生素b12的进行定量荧光检测，从而为营养性贫血的精准诊断和有效治疗提供数据支持，减少因误诊导致的二次伤害。

附图说明

图1为本发明实施例2的三通道纸质点阵芯片的结构示意图；

图2为本发明实施例2的蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点、黄色荧光碳点浓度优化图；

图3为本发明实施例3的蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点、黄色荧光碳点反应时间优化图；

图4为本发明实施例3的抗干扰能力验证检测结果；

图5为本发明实施例4的蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点、黄色荧光碳点三种荧光探针同步检测维生素b12、三价铁和叶酸的纸质点阵芯片实物图；

图6为本发明实施例4的三种荧光探针在同一张纸质点阵芯片同步检测维生素b12、三价铁和叶酸的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例提供一种用于多个营养性贫血相关标志物定量测定的多元检测芯片，能够实现对血清中铁、维生素b12和叶酸的同步检测，该多元检测芯片设有多个样品反应区，不同的样品反应区加有针对不同标志物的荧光探针，所述标志物分别为铁、叶酸和维生素b12，其中用于检测铁的荧光探针为绿色荧光碳点，用于检测叶酸的荧光探针为黄色荧光碳点，用于检测维生素b12的荧光探针为蓝色荧光碳点。在365nm波长激发下，蓝色荧光碳点的最大发射波长在440nm波长附近、绿色荧光碳点的最大发射波长在525nm波长附近、黄色荧光碳点的最大发射波长在581nm波长附近，该多元检测芯片为三通道芯片，所述三通道分别对应添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域。

具体三种荧光探针的合成方法如下：

绿色荧光碳点的合成：0.5g的多巴胺溶解在10ml的ddh2o中，充分震荡混合均匀。随后，加入250μl的乙二胺溶液，充分震荡混匀后，加入到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，180℃加热6小时。冷却到室温以后，收集深棕色的溶液，超声30分钟。随后，8000rpm离心20分钟，除去较大的聚集颗粒，使用500da透析袋透析24小时，收集透析袋中的溶液，稀释到100ml,4℃冰箱保存。

蓝色荧光碳点的合成：1g的柠檬酸三钠，1.01ml的二乙烯三胺加入到30ml的ddh2o中，充分震荡混匀以后，加入到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，160℃加热6小时。冷却到室温，0.2μm的滤膜过滤后，使用1000da透析袋透析10小时，收集透析袋中的溶液，4℃冰箱保存。

黄色荧光碳点的合成：280mg的pei(mw:10000),1mmol的cdcl2,0.5mmol的na2s溶解在47.5ml的ddh2o中，充分震荡混匀以后，60℃加热搅拌15分钟。随后，逐滴加入2.5ml的znso4(0.08m),继续加热搅拌20分钟后，冷却到室温,使用12-14kd的透析袋在pbs缓冲液(0.01m，ph7.4)中透析1小时,收集透析液，4℃冰箱保存。

当体系中存在维生素b12时，通过内滤效应，蓝色荧光碳点的荧光逐渐发生猝灭；体系中存在铁时，绿色荧光碳点表面的儿茶酚会被氧化为醌，导致绿色荧光碳点荧光猝灭；同样，当体系中存在叶酸时，黄色荧光碳点的荧光也会逐渐发生猝灭。三种荧光探针的猝灭程度分别与体系中对应的标志物的浓度有关，随着标志物浓度增大，体系荧光逐渐减弱。在一定浓度范围内，体系荧光的猝灭程度与标志物浓度成正比。基于此原理，即可实现同时对血清中铁、叶酸和维生素b12进行定量荧光检测，从而为营养性贫血的精准诊断和有效治疗提供数据支持，减少因误诊导致的二次伤害。

实施例2

在本实施例中，实施例1中的多元检测芯片具体为三通道纸质点阵芯片，其制作方法为：采用whatmanno.1滤纸作为信号基底，采用富士施乐的colorqube8570喷蜡打印机打印出来了如图1所示的三通道纸质点阵芯片，该三通道纸质点阵芯片的多个样品反应区排列为3×3的点阵，其中所述点阵中每一行有3个样品反应区、添加同一种荧光探针且对应一个通道。采用纸质点阵芯片作为信号载体，可以有效降低对样本量的需求，增加样本的保存和运输能力。在该三通道纸质点阵芯片中，每个样品反应区的直径为5mm，石蜡宽度为1mm，用于形成疏水的壁垒，防止样品渗出。

样品反应区探针溶液的浓度会直接影响检测结果。所加探针浓度太大，荧光强度太强，在强背景下由标志物引起的荧光相对变化较小，影响检测灵敏度。反之，所加探针浓度太小，荧光强度太弱，稳定线性检测范围会很小。如图2(a)所示，当蓝色荧光碳点浓度小于0.1mg/ml时，随着探针浓度的增加，样品区域的荧光强度逐渐增强。当大于0.1mg/ml时，荧光强度达到饱和。基于上述发现，在本实施例中，选择0.1mg/ml为蓝色荧光碳点的浓度，同理，根据图2(b)，在本实施例中，绿色荧光碳点的浓度设为0.5mg/ml，根据图2(c)，黄色荧光碳点的浓度设为1mg/ml。

实施例3

本实施例阐述了一种采用上述实施例2所述多元检测芯片的检测方法，多元检测芯片为三通道纸质点阵芯片，检测步骤包括：

步骤1：采用365nm波长激发所述多元检测芯片的样品反应区，分别获取添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域的荧光强度i0，其中用于检测铁的荧光探针为绿色荧光碳点，用于检测叶酸的荧光探针为黄色荧光碳点，用于检测维生素b12的荧光探针为蓝色荧光碳点；

步骤2：再在每个样品反应区上滴加标志物标准溶液，所述标志物标准溶液中含有的标志物为铁、叶酸和维生素b12，且所述标志物标准溶液中各标志物浓度已知，干燥一段时间；再次采用365nm波长激发所述多元检测芯片的样品反应区，分别获取添加蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点和黄色荧光碳点的样品反应区域的荧光强度i，继而按照各个荧光碳点分别得到对应铁、叶酸和维生素b12的(i0-i)/i0值；

步骤3：继续执行步骤1和步骤2，最终分别建立铁、叶酸和维生素b12浓度与(i0-i)/i0值的标准曲线；标准曲线可以参见图5。

步骤4：将待测样品溶液取代所述标志物标准溶液，按照步骤1与步骤2得到待测样品溶液中铁、叶酸和维生素b12的(i0-i)/i0值，继而根据所述标准曲线得到所述待测样品溶液中铁、叶酸和维生素b12的浓度。

由于标志物与荧光探针的结合程度也会对检测结果产生影响，随着反应时间的增加，三种荧光探针的荧光强度都逐渐增强，在本实施例中，选择5分钟作为最佳反应时间，具体验证过程如下：先在纸质点阵芯片的样品区域加入5μl对应的荧光探针(蓝色荧光碳点、绿色荧光碳点、黄色荧光碳点三种荧光碳点的浓度分别为0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml，待其干燥后，加入5μl一定浓度的标志物溶液，再将这些纸质点阵芯片放入60℃烘箱，分别干燥1分钟、2分钟、3分钟和5分钟后，并分别记录蓝色荧光碳点区域的通道值、绿色荧光碳点区域的通道值和黄色荧光碳点区域的通道值，其结果如图3所示。从图3可以看出，随着反应时间的增加，三种荧光探针的荧光强度都逐渐增强。其中图3(a)示出的是蓝色荧光碳点的荧光强度结果，图3(b)示出的是绿色荧光碳点的荧光强度结果，图3(c)示出的是黄色荧光碳点的荧光强度结果，考虑到快速检测的需要，本实施例选择5分钟作为最佳反应时间。

实施例4

为了验证其他物质对维生素b12、铁和叶酸的检测不会造成干扰，按照实施例3所述的检测方法，采用含有100μm不同物质的蓝色荧光碳点溶液，含有300μm不同物质的绿色荧光碳点溶液和含有140μm不同物质的黄色荧光碳点溶液进行检测，检测结果如图4所示。从图可以看出蓝色荧光碳点对维生素b12的响应值、绿色荧光碳点对三价铁的响应值和黄色荧光碳点对叶酸的响应值都明显高于其他物质，证明了三种荧光探针都具有很好的抗干扰能力。

为了验证的三种荧光探针的灵敏度，按照实施例3所述的检测方法，如图5所示，即先在同一张纸质点阵芯片上的不同位置分别滴加了5μl荧光探针溶液，将其放入60℃烘箱干燥5分钟后取出，记录纸质点阵芯片中每个目标区域的i0值，再在芯片上的蓝色荧光区域滴加5μl不同浓度的维生素b12溶液(标准曲线区域维生素b12的浓度从左向右依次为6.777、13.554、20.331、27.107、33.884、40.661μg/ml，样品区域维生素b12的浓度从左向右依次为10.843、20.331、33.884μg/ml)，绿色荧光区域滴加5μl不同浓度的铁溶液(标准曲线区域铁的浓度从左向右依次为1.396、2.792、5.585、6.981、8.377、9.773μg/ml，样品区域三价铁的浓度从左向右依次为2.234、5.585、8.377μg/ml)，黄色荧光区域滴加5μl不同浓度的叶酸溶液(标准曲线区域叶酸的浓度从左向右依次为2.207、4.414、8.828、13.242、17.656、26.484μg/ml，样品区域叶酸的浓度从左向右依次为4.414、13.242、22.07μg/ml)。将其再次放入60℃烘箱干燥5min后取出，分别记录纸质点阵芯片中每个目标区域的i值,并计算每个目标区域的(i0-i)/i0值。

其中，纸质点阵芯片中标准曲线区域的(i0-i)/i0值如图6所示。从该图可以看出，三种荧光探针的(i0-i)/i0值都随对应标志物浓度的增大而线性增大，且蓝色荧光碳点的(i0-i)/i0与维生素b12浓度的拟合结果为：y＝0.007x+0.151，回归系数为0.995；绿色荧光碳点的(i0-i)/i0与铁浓度的拟合结果为：y＝0.03x+0.19，回归系数为0.996；黄色荧光碳点的(i0-i)/i0与叶酸浓度的拟合结果为：y＝0.014x+0.388，回归系数为0.996。根据计算，三种荧光探针的lod分别2.942、0.53和1.969μg/ml，与单元检测的灵敏度相当。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。