碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法与流程

本发明属于检测技术领域。

背景技术：

真菌是生物界中很大的一个群体，种类繁多，在生长过程中会产生一定的毒素，近年来真菌类感染呈逐年上升的趋势。白色念珠菌也称假丝酵母菌，是导致真菌感染的重要因素之一，此外它还是重要的食源性致病菌，因此快速准确检测白色念珠菌的含量在食品安全检测领域具有重要的意义。

近年来国内食品检测机构对白色念珠菌的检测几乎全是利用白色念珠菌的形态特征和生理生化特性，用微生物培养的传统方法对白色念珠菌进行分离鉴定。这些传统检测手段均存在一定的缺陷，如常规的平板计数法耗时长、工作量大且易产生假阳性的情况。由于白色念珠菌是一种条件致病菌，其致病性与之存在量效关系，因此定量检测方法的建立对判断食品受污染的程度以及可食用性具有重要的意义。基于以上研究状况，需发明一种简单、准确、快速的方法检测白色念珠菌。

碳量子点是尺寸在10nm以下、具有单分散性、几何形状近似于类球形的一种新型的荧光碳纳米功能材料。相对于传统有机染料和金属量子点，碳量子点对环境危害小、制备成本低廉、低毒、易于功能化，并且具有良好的生物相容性；因此越来越多的研究者将其广泛地应用在细胞标记、生物成像、药物传输、荧光探针、有机污染物降解、光解水制氢与光催化剂等领域。

技术实现要素：

本发明的目的是以廉价的生物质玉米秸秆为碳源制备具有荧光的碳量子点，再以碳量子点为基础对其进行修饰制成复合探针，进而检测白色念珠菌的碳量子点的复合探针及检测白色念珠菌含量的方法。

本发明的复合探针：

(1)碳量子点的制备：

将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30ml去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点；

(2)碳量子点氨基化：

将1ml乙二胺与步骤(1)中10ml碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋透析2-3天即可，得到的氮掺杂的碳量子点；

(3)复合探针的制备：

①分别称取50mg的edc和nhs，溶于5ml氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；

②称取7mg水溶性的两性霉素b，溶于2ml的pbs缓冲液中，混匀备用；

③将步骤①产生的液体与步骤②产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；

④最后将步骤③中的混合液放在透析袋里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素b复合的荧光探针。

本发明复合探针检测白色念珠菌含量的方法：

(1)将食材切成小块，置于锥形瓶中121℃灭菌20min，除去杂菌，备用；

(2)从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10ml含步骤(1)中食材的sab培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；

(3)将1ml复合探针与1ml步骤(2)混合液混合均匀；并放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min，使复合探针中的两性霉素b能够与实样中的白色念珠菌充分结合；

(4)取1ml步骤(3)中混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；

(5)将步骤(4)中的重悬液体置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；

(6)将所测得的荧光强度值代入上述制备的荧光标准曲线中，计算出白色念珠菌的含量。

本发明所述的荧光标准曲线是荧光强度值与白色念珠菌浓度标准曲线，其获得方法是：

(1)配制一系列浓度的白色念珠菌溶液样品；

(2)将1ml不同浓度的菌液样品分别与1ml复合探针混合均匀；

(3)将步骤(2)中的混合液放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min；

(4)将步骤(3)中的混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；

(5)将步骤(4)中混合溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；

(6)以荧光强度值为纵坐标，白色念珠菌的浓度为横坐标，拟合建立荧光标准曲线。

本发明所述的荧光标准曲线包含由水溶性的两性霉素b获得的荧光标准曲线和由醇溶性的两性霉素b获得的荧光标准曲线。

本发明制备原料丰富低廉，制备过程简单，灵敏度高，解决了现有方法的问题如干扰因素多、操作复杂、耗时耗力等。

具有优点和积极效果如下：

(1)发明了一种检测白色念珠菌的荧光分光光度法，能够准确、快速检测白色念珠菌的含量；

(2)复合探针检测白色念珠菌的检测限为1124cfu/ml；

(3)和现有的方法相比，该方法具有良好的特异性，缩短了检测时间，简化了操作流程，节约了检测成本；

(4)利用废弃农作物玉米秸秆为碳源制备碳量子点，变废为宝，并且对环境无危害；

(5)用醇溶性的两性霉素b替代水溶性的两性霉素b，进一步降低了检测成本。上述检测限单位cfu/ml是指每毫升菌液里有多少菌体量。

附图说明

图1是碳量子点的xrd图；

图2是碳量子点和氮掺杂碳量子点的ftir图；

图3是在最佳激发波长为355nm条件下的荧光强度值与白色念珠菌浓度的关系标准曲线；

图4是复合探针中水溶性的两性霉素b被替代为醇溶性的两性霉素b形成新的复合探针；

图5展示了复合探针具有良好的特异性。

具体实施方式

本发明主要是以廉价的生物质玉米秸秆为碳源制备具有荧光的碳量子点，并且通过氨基化修饰制备氮掺杂碳量子点(n-cqds)，最后与两性霉素b结合形成复合探针，进而检测白色念珠菌的含量；同时克服现有检测方法的缺陷，提供一种操作简便、特异性好、快速准确的荧光分光光度法。

碳量子点的制备及其氨基化

(1)将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30ml去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点。

(2)将1ml乙二胺与步骤(1)中10ml碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天即可；得到的氮掺杂的碳量子点装瓶室温保存备用。

上述所用秸秆的制备：预先在阳光下暴晒1-2天，之后用粉碎机粉碎即可；透析时将透析袋放入装有去离子水的烧杯中，浸没即可。

本发明的研究结果证明，不同地域获取的玉米秸秆不影响制备的碳量子点的质量及应用效果。

复合探针的制备

(1)分别称取50mg的edc和nhs，溶于5ml氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；

(2)称取7mg水溶性的两性霉素b，溶于2ml的pbs缓冲液中，混匀备用；

(3)将步骤(1)产生的液体与步骤(2)产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；

(4)最后将步骤(3)中的混合液放在透析袋(1000道尔顿)里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素b复合的荧光探针，保存备用。

上述edc和nhs分别为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；两性霉素b为水溶性；pbs的配方为：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，khpo40.24g，ph7.4，体积为1000ml。

本发明的复合探针的检测方法是：

(1)取一定量的食材切成小块，于锥形瓶中121℃灭菌20min，除去杂菌，备用；

(2)从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10ml含步骤(1)中食材的sab培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养；

(3)将1ml复合探针与1ml步骤(2)混合液混合均匀；并放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min，使复合探针中的两性霉素b能够与实样中的白色念珠菌充分结合；

(4)取1ml步骤(3)中混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；

(5)将步骤(4)中的重悬液体置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；

(6)将所测得的荧光强度值代入上述制备的荧光标准曲线中，计算出白色念珠菌的含量；

(7)同时取1ml步骤(3)的混合液，稀释成10⁸cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml6个不同梯度浓度，取200μl不同梯度的混合液分别置于sab平板上，涂板；

(8)将步骤(7)中的平板置于37℃培养箱中，培养12h；

(9)计算步骤(8)的各个梯度的平板菌落数，取平均值，此数据作为对照；

(10)比较步骤(6)和步骤(9)中白色念珠菌的含量，发现复合探针检测白色念珠菌含量的准确度在90％以上。

食材是在市场购得，复合探针是由本实验制备所得。复合探针是由n-cqds与两性霉素b复合形成，n-cqds是一种具有荧光性质的零维碳纳米材料，在一定的激发波长下会发出强烈的蓝色荧光，本实验制备的n-cqds的最佳激发波长为355nm；两性霉素b是一种广谱的抗生素，能与白色念珠菌细胞膜上的麦角固醇特异性结合；基于两性霉素b能与白色念珠菌特异性结合的原理，将氮掺杂的碳量子点与白色念珠菌间接结合在一起，因此可以通过检测实样的荧强度来计算白色念珠菌的含量。

图3中在最佳激发波长为355nm条件下的荧光强度值与白色念珠菌浓度的关系标准曲线的线性关系式为y＝ax+b，r²＝0.9912；其中a的值为28.5819，b的值为80.2003，因此拟合后的方程为y＝28.5819x+80.2003，x为白色念珠菌的浓度，y为白色念珠菌与复合探针混合后在激发波长为355nm条件下的荧光强度值。

图4中在最佳激发波长为355nm条件下的荧光强度值与白色念珠菌浓度的关系标准曲线的线性关系式为y＝ax+b，r²＝0.9931。其中a的值为42.28391，b的值为117.67865，因此拟合后的方程为y＝42.28391x+117.67865，x为白色念珠菌的浓度，y为白色念珠菌与复合探针混合后在激发波长为355nm条件下的荧光强度值。

图3和图4中左侧是测荧光的结果图，右侧是整理出来的标准曲线图，图3左侧图中的8条曲线由下至上分别对应右上角由上至下的8个浓度梯度的菌液检测到的荧光值，而图4左侧图中的6条曲线由下至上分别对应右上角由上至下的6个浓度梯度的菌液检测到的荧光值。

本发明的原理：一定范围内不同浓度的白色念珠菌接种到sab培养基中，培养一段时间后，加入复合探针；利用两性霉素b能与白色念珠菌特异性结合的原理，将氮掺杂的碳量子点与白色念珠菌相互结合在一起，再用分光光度计在激发波长为355nm处检测其荧光值，发现其荧光强度值与白色念珠菌的浓度呈一定的线性关系，由此进行白色念珠菌浓度的测定。

制备白色念珠菌待测体系以供如下验证使用：

从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于含10mlsab培养基的小试管中，37℃，200rpm摇床培养12h，至菌体生长到对数生长中期，备用。

上述sab培养基中各组分用量占sab培养基质量用量的百分比分别为：蛋白胨1％；葡萄糖4％；ph5.6；于121℃灭菌20min。

上述所用白色念珠菌(candidaalbicansgim2.194)购于广东微生物菌种保藏中心。

荧光强度值与白色念珠菌浓度标准曲线的获得：

(1)配制一系列浓度的白色念珠菌溶液样品；

(2)将1ml不同浓度的菌液样品分别与1ml复合探针混合均匀；

(3)将步骤(2)中的混合液放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min；

(4)将步骤(3)中的混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；

(5)将步骤(4)中混合溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；

(6)以荧光强度值为纵坐标，白色念珠菌的浓度为横坐标，拟合建立标准曲线。

上述一系列浓度的白色念珠菌样品的制备方法：将白色念珠菌接种于sab培养基中，37℃，200rpm过夜培养；然后进行平板计数，求出每毫升白色念珠菌的数量，用无菌生理盐水将菌液稀释成8个梯度浓度的白色念珠菌样品。

复合探针的改进

用醇溶性的两性霉素b代替水溶性的两性霉素b，然后与氮掺杂的碳量子点混合，后续步骤与水溶性两性霉素b一致。其中水溶性的两性霉素b及醇溶性的两性霉素b均购自北京酷来博科技有限公司。

实样待测体系的制备

(1)将牛肉肠切成小块，于锥形瓶中121℃灭菌20min，备用；

(2)从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10ml含牛肉肠的sab培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养，即可得到实样体系。

实样的检测

(1)在实样待测溶液中取1ml的混合液与1ml的复合探针混合，后续操作步骤与【0026】段中一样，测得的荧光强度值代入标准曲线中，计算出菌的数量；

(2)取相同浓度和体积的实样，平板计数作为对照。

复合探针的特异性。

(1)各取相同浓度的白色念珠菌菌液和大肠杆菌菌液1ml，将这两种菌液分别与1ml复合探针混匀；

(2)在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用2mlpbs重悬，重复3次；

(3)将(2)中液体置于石英比色皿中，分别测其荧光强度；

(4)用发酵性丝孢酵母菌替代大肠杆菌，后续操作同上一致。

实施例1

碳量子点的制备及其氨基化

(1)将0.3g已粉碎的玉米秸秆与30ml去离子水在反应釜中混合均匀，然后将反应釜置于200℃条件下恒温水热反应6h；反应结束后，待其冷却至室温，先用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天；冷冻干燥即可得到以秸秆为碳源的碳量子点。

(2)将1ml乙二胺与步骤(1)中10ml碳量子点在反应釜中混匀，然后将反应釜置于180℃下恒温反应5h；反应结束后，待其冷却至室温，用0.22μm微孔过滤膜过滤并用透析袋(1000道尔顿)透析2-3天即可；得到的氮掺杂的碳量子点装瓶室温保存备用。

经实验分析：用紫外光照射制备好的氮掺杂碳量子点，可见绿色荧光。碳量子点的xrd图见图1，在2θ＝22°处有一宽峰，该峰和碳的(001)晶面一致，暗示碳的无定形；碳量子点的ftir图见图2，发现碳量子点以及氮掺杂碳量子点的羟基和羧基较多，从而证明了碳量子点和氮掺杂碳量子点具有良好的水溶性。

上述所用秸秆的制备：预先在阳光下暴晒1-2天，之后用粉碎机粉碎即可；透析时将透析袋放入装有去离子水的烧杯中，浸没即可。

实施例2

复合探针的制备及荧光标准曲线的制定

1、复合探针的制备

(1)分别称取50mg的edc和nhs，溶于5ml氮掺杂的碳量子点，在室温下搅拌4h；

(2)称取7mg水溶性的两性霉素b，溶于2ml的pbs缓冲液中，混匀备用；

(3)将步骤(1)产生的液体与步骤(2)产生的液体混匀，并在室温下搅拌6h；

(4)最后将步骤(3)中的混合液放在透析袋(1000道尔顿)里透析2-3天，得到的液体即是氮掺杂碳量子点与两性霉素b复合的荧光探针，保存备用。

上述edc和nhs分别为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；两性霉素b为水溶性；pbs的配方为：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，khpo40.24g，ph7.4，体积为1000ml。

2、白色念珠菌待测体系的制备

从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于含10mlsab培养基的小试管中，37℃，200rpm摇床培养12h，至菌体生长到对数生长中期，备用。

上述sab培养基中各组分用量占sab培养基质量用量的百分比分别为：蛋白胨1％；葡萄糖4％；ph5.6；于121℃灭菌20min。上述所用白色念珠菌(candidaalbicansgim2.194)购于广东微生物菌种保藏中心。

3、荧光强度值与白色念珠菌浓度标准曲线的获得。

(1)配制一系列浓度的白色念珠菌溶液样品；

(2)将1ml不同浓度的菌液样品分别与1ml复合探针混合均匀；

(3)将步骤(2)中的混合液放入37℃、200rpm的摇床中混合培养5min；

(4)将步骤(3)中的混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；

(5)将步骤(4)中混合溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；

(6)以荧光强度值为纵坐标，白色念珠菌的浓度为横坐标，拟合建立标准曲线，见图3。上述一系列浓度的白色念珠菌样品的制备方法：将白色念珠菌接种于sab培养基中，37℃，200rpm过夜培养；然后进行平板计数，求出每毫升白色念珠菌的数量，用无菌生理盐水将菌液稀释成8个梯度浓度的白色念珠菌样品。

实施例3

将实施例2中水溶性的两性霉素b用醇溶性的两性霉素b替代，用无菌生理盐水将菌液稀释成6个梯度浓度的白色念珠菌样品，剩余步骤与实施例2中一致，即可得到荧光标准曲线，见图4。

实施例4

在实施例2的基础上，用水溶性的两性霉素b与氮掺杂碳量子点形成的复合探针实样检测白色念珠菌。

(1)实样体系的制备：将金锣清真牛肉肠切成小块，于锥形瓶中121℃灭菌20min，备用；从平板上挑取白色念珠菌的单克隆菌落于10ml含牛肉肠的sab培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养，得到的即为实样体系。

(2)实样检测：在实样待测溶液中取1ml的混合液与1ml的复合探针混合，在条件为37℃、200rpm的摇床中混合培养5min；然后将混合液在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用pbs重悬，重复3次；最后将混合溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定激发波长在355nm条件下的荧光强度值；测得的荧光强度值代入标准曲线中，计算出菌的数量；最后取实样相同浓度的菌液，平板计数作为对照。

(3)实样检测结果如表1所示：

表1在实样中用复合探针(水溶性的两性霉素b)检测白色念珠菌的含量(n＝6)

从表1中分析发现，用复合探针检测实样中白色念珠菌含量，并用平板计数作为对照组。用复合探针检测实样中白色念珠菌的含量与平板计数得到的结果相比，准确率在90％以上，说明该方法可以应用在实样检测中，并且该方法的检测限为1124cfu/ml。和传统方法相比，该方法的复合探针具有良好的特异性。

实验分析：取浓度为1x10⁸cfu/ml白色念珠菌菌液、大肠杆菌菌液和发酵性丝孢酵母菌菌液各1ml，分别与1ml复合探针混匀，在25℃，10000rpm条件下，离心5min，除去上清；用2mlpbs重悬，重复3次；最后将混合液置于石英比色皿中，分别测其荧光强度。

图5展示的是复合探针特异性，发现只有白色念珠菌菌液与复合探针的混合液有较大荧光强度，其他混合菌液荧光强度较弱，从而证明复合探针具有良好特异性。

实例5

在实施例3的基础上，用醇溶性的两性霉素b与氮掺杂碳量子点形成的复合探针实样检测白色念珠菌。实样待测体系、实样检测过程与实施例4中一致。

实样检测结果如表2所示：

表2在实样中用复合探针(醇溶性的两性霉素b)检测白色念珠菌的含量(n＝6)

从表2中分析发现，用氮掺杂碳量子点与醇溶性的两性霉素b复合形成新的复合探针检测实样中白色念珠菌含量，并用平板计数作为对照组。用复合探针检测实样中白色念珠菌的含量与平板计数得到的结果相比，准确率在90％以上，说明该方法可以应用在实样检测中，并且该方法的检测限为2485cfu/ml。