一种重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条及其制备方法和应用，属于食品检测技术领域。

背景技术：

镉的毒性很大，可在人体内积蓄，主要积蓄在肾脏，会引起泌尿系统的功能变化。镉主要来源如电镀、采矿、冶炼、燃料、电池和化学工业等排放的废水；废旧电池中镉的含量较高，水果和蔬菜尤其是蘑菇及奶制品和谷物中也有少量存在。镉能够干扰骨中钙，若长期摄入微量镉，会使骨骼严重软化，干扰人和生物体内的酶系统，引起胃脏功能失调。镉中毒又称为痛痛病，它可以通过与酶类巯基的结合或替代作用，置换出细胞内的酶类金属，降低机体抗氧化酶的活性，使机体清除自由基的能力下降，引起氧化损伤；镉进入细胞内，可使细胞内钙稳态失衡，干扰细胞内钙代谢；能引起dna单链断裂，损害dna修复系统，进而导致细胞凋亡。镉的绝大部分形态均可被植物利用及蓄积，且通过食物链富集作用危害人类健康，主要包括肾脏、肝脏和肺部的累积毒性，被国际癌症研究机构确定为可导致人类和实验动物肺癌和前列腺癌的确认致癌物。

建立食品样品中镉快速准确的检测方法势在必行。目前，传统的重金属检测方法概括起来主要包括以下几种：原子吸收光谱法（aas）、原子发射光谱法（aes）、电感耦合等离子体质谱法（icp-ms）、原子荧光光谱法（afs）、紫外可见分光光度法（uv-vis）、阳极溶出伏安法（asv）等。但这些方法专业性要求高、分析时间长、分析价格昂贵，不利于推广和现场检测。而免疫分析方法与以上分析方法相比具有特异性强、操作简便、仪器化程度和分析成本低的优点。荧光定量检测试纸条可以进行定量或半定量的测定，具有相当高的灵敏度，能满足不同样品的快速检测要求。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重金属镉离子荧光定量检测试纸条及其制备方法与应用，可大规模地对粮食及其加工产品残留重金属镉进行快速、方便、准确的检测。

本发明的技术方案，一种重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条，包括样品垫、荧光微球标记垫、检测线、质控线、吸水垫、硝酸纤维素膜检测层和pvc底板；

所述pvc底板两端分别设有样品垫和吸水垫；在pvc底板中部设有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设有荧光微球标记垫；所述荧光微球标记垫一端与样品垫互相叠加，另一端与硝酸纤维素膜检测层互相叠加；所述硝酸纤维素膜检测层上依次设有质控线和检测线。

所述重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条的制备方法，步骤如下：

（1）荧光微球储备液的制备：取0.05mph为8的硼酸缓冲液400μl于2ml离心管中，加入100μl-120μl荧光微球，漩涡震荡，混匀备用；

（2）荧光微球镉离子标记抗体的制备：取10mg/ml的edc溶液20μl，室温震荡活化15min，2000rpm10℃离心10min，弃上清，对固相物用0.5ml0.05mph=8硼酸缓冲液复溶，超声分散；加入重金属镉离子抗体，使抗体终浓度为30-50μg/ml，置于250rpm摇床上2h；加入封闭液，即最终浓度为1%-2%bsa，置于摇床封闭1-2h，2000rpm离心10min，弃上清，固相物用0.5ml硼酸缓冲液复溶，洗涤离心后，再用偶联储存缓冲溶液复溶，超声分散后得到荧光标记的重金属镉离子抗体，4℃保存；

（3）荧光微球标记垫的制备：将步骤（2）制备所得0.2mg/ml标记荧光的重金属镉离子抗体均匀喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.5-1μl/cm，37℃烘干过夜，得荧光微球标记垫，封袋备用；

（4）包被膜的制备：将稀释好的0.2mg/ml的重金属镉离子抗原均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠igg均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到质控线，37℃烘干过夜，封袋备用；

（5）组合：将pvc底板（7）、样品垫（1）、荧光微球标记垫（2）、涂有检测线（3）和质控线（4）的硝酸纤维素膜检测层（6）和吸水垫（5）组合，即得产品重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条。

所述重金属镉离子抗体是由高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号分泌所得。

一株高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为cgmccno.17306，保藏日期为2018年5月24日。

所述高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号的筛选，具体步骤如下：

（1）抗镉离子单抗的制备：用双功能螯合剂itcbe与klh偶联之后加入重金属镉离子进行螯合，以此作为完全免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用重金属镉离子的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用重金属镉离子的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用重金属镉离子完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。

（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（hat培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用ht培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-elisa法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得重金属镉离子的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号。

所述重金属镉离子抗体纯化：

将高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取1ml腹水，加入相当于腹水体积1ml的醋酸钠缓冲液，于室温搅拌下逐滴加入辛酸33.3μl，震荡30min，8000rpm离心5min，得到上清液；加入饱和硫酸铵1ml，静置1-2h；8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀溶于pbs溶液中进行透析3天，得到抗镉离子单克隆抗体。

所述重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条的应用，将其应用于食品中重金属镉离子的快速检测，适用于海关、企业、检验检疫单位等，可实现大米样本中重金属镉离子的快速检测。

本发明的有益效果：本发明对重金属镉离子检测速度快，全过程只需要5min即可，可以实施大批量样品的快速检测；本发明灵敏度高，大米样本检测限为10ng/ml；

本发明过程简单，直接上样检测，样品前处理简单，无需经过专业培训，易于推广，不需要仪器，适合现场检测。

生物材料样品保藏：一株高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.17306，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2018年5月24日。

附图说明

图1是本发明结构示意图。

图2是大米样本镉离子检测标准曲线。

附图标记说明：1、样品垫；2、荧光微球标记垫；3、检测线；4、质控线；5、吸水垫；6、硝酸纤维素膜检测层；7、pvc底板。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条，包括样品垫1、荧光微球标记垫2、检测线3、质控线4、吸水垫5、硝酸纤维素膜检测层6和pvc底板7；

所述pvc底板7两端分别设有样品垫1和吸水垫5；在pvc底板7中部设有硝酸纤维素膜检测层6，在硝酸纤维素膜检测层6与样品垫1之间设有荧光微球标记垫2；所述荧光微球标记垫2一端与样品垫1互相叠加，另一端与硝酸纤维素膜检测层6互相叠加；所述硝酸纤维素膜检测层6上依次设有质控线4和检测线3。

所述重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条的制备方法，具体步骤如下：

（1）抗镉离子单抗的制备：用双功能螯合剂itcbe与klh偶联之后加入重金属镉离子进行螯合，以此作为完全免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用重金属镉离子的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用重金属镉离子的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用重金属镉离子完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。

（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（hat培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用ht培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-elisa法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得重金属镉离子的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号。

（3）重金属镉离子抗体纯化：将高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株f号扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取1ml腹水，加入相当于腹水体积1ml的醋酸钠缓冲液，于室温搅拌下逐滴加入辛酸33.3μl，震荡30min，8000rpm离心5min，得到上清液；加入饱和硫酸铵1ml，静置1-2h；8000rpm离心5min，弃上清液，将沉淀溶于pbs溶液中进行透析3天，得到抗镉离子单克隆抗体；

（4）重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条的制备：

a、荧光微球储备液的制备：取0.05mph为8的硼酸缓冲液400μl于2ml离心管中，加入100μl荧光微球，漩涡震荡，混匀备用；

b、荧光微球镉离子标记抗体的制备：取10mg/ml的edc溶液20μl，室温震荡活化15min，2000rpm10℃离心10min，弃上清，对固相物用0.5ml0.05mph=8硼酸缓冲液复溶，超声分散；加入重金属镉离子抗体，使抗体终浓度为30μg/ml，置于250rpm摇床上2h；加入封闭液，即最终浓度为1%bsa，置于摇床封闭2h，2000rpm离心10min，弃上清，固相物用0.5ml硼酸缓冲液复溶，洗涤离心后，再用偶联储存缓冲溶液复溶，超声分散后得到荧光标记的重金属镉离子抗体，4℃保存；

c、荧光微球标记垫的制备：将步骤（2）制备所得0.2mg/ml标记荧光的重金属镉离子抗体均匀喷在玻璃纤维膜上，喷液量1μl/cm，37℃烘干过夜，得荧光微球标记垫，封袋备用；

d、包被膜的制备：将稀释好的0.2mg/ml的重金属镉离子抗原均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠igg均匀喷在硝酸纤维素膜检测层上，得到质控线，37℃烘干过夜，封袋备用；

e、组合：将pvc底板7、样品垫1、荧光微球标记垫2、涂有检测线3和质控线4的硝酸纤维素膜检测层6和吸水垫5组合，即得产品重金属镉离子的荧光定量快速检测试纸条。

实施例2

检测时按如下步骤处理样品：准确称量粉碎至合适粒径的大米样品3g于50ml离心管中，加入9ml0.5m稀盐酸溶液和6ml二氯甲烷，于振荡器上震荡3min，8000rpm离心3min，取上清液500μl加1ml的正己烷萃取分层，取下层溶液200μl用1mnahco3稀释4倍作为测试样备用，同时做试剂空白。

用试纸条对测试样和空白样分别检测，捡测反应结束，将试纸条放入荧光定量检测仪，即可检测出重金属镉离子浓度，图2为大米样本镉离子检测标准曲线；如果试纸条质控线不显色，则说明试纸条质量有问题。