一种与结肠癌相关的新型分子诊断标志物及其用途的制作方法

本发明属于生物技术和肿瘤生物学技术领域，涉及一种与结肠癌相关的新型分子诊断标志物及其应用。

背景技术：

结肠癌是当今最常见的疾病之一，每年全球约有120万名患者被确诊为结肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结肠癌。根据我国国家癌症中心最新发布的权威数据显示，截至2017年8月30日，结肠癌新发病例在男性、女性中分别排名第3位和第2位，死亡病例在男性、女性中分别排名第4位和第3位。我国东部地区结肠癌发病率、死亡率最高，中部地区相对较低，有分析指出，这可能与不健康的饮食、较高的肥胖率有关。随着生活质量的提高和饮食习惯的改变，中国出现越来越多的结肠癌患者。然而目前可用的用于判断结肠癌患者的分子标志物没有几个，其中癌胚抗原(cea)是唯一一个推荐用于结肠癌患者检测的分子标志物，但经过大量的临床实践，发现不仅胃肠道的恶性肿瘤cea值可以升高，在乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤的血清中也有升高。因此，癌胚抗原算得上是一种广谱肿瘤标志物，特异性不好，更何况用它作为分子标志物诊断时患者基本上都到了中晚期，不具有预防、提前筛查、监测诊断的价值。另外像ca50、timp-1虽也可以作为判断结肠癌预后的血清标志物，但是特异性和灵敏性都远远达不到临床要求。在结肠癌发生、发展的相关作用机制仍然不完全清楚，但人们防癌意识逐渐增强，对结肠癌的早期筛查诊断有了更高的期待。所以一种新型的、特异性强、灵敏度高的能够用于结肠癌早期筛查，并改善了部分患者预后的肿瘤分子标记物急需被发现来指导临床的工作。

p21是细胞周期调控相关的重要基因，它是位于p53基因下游的细胞周期依赖性激酶抑制因子，其表达产物p21蛋白参与细胞的增殖、分化调控和凋亡，对细胞周期具有负调控作用。p21^waf1/cip1是p21基因编码表达的蛋白，它是细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)的抑制剂，通过与一系列cyclin-cdk复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致cyclin-cdk无法磷酸化rb，非磷酸化的rb保持与e2f的结合，使e2f这一转录调节因子不能活化，阻止细胞周期中g1期向s期的转化，从而调节细胞周期进程。

研究发现，celf6是一种新的潜在肿瘤抑制因子，其作为肿瘤抑制因子在结肠癌中调控泛素化蛋白降解新机制及潜在的结肠癌精准治疗新靶点，具体来讲就是，一种名为celf6的生物标记物在结肠癌组织样本中低表达，提示与结肠癌患者的预后密切相关，这对于寻找替代性的结肠癌治疗策略具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目是：针对现有技术之不足，提供一种与肿瘤相关的新型分子诊断标志物，诊断标志物为celf6，该诊断标志物特异性好，能准确鉴别肿瘤/非肿瘤患者；敏感性高，能早期检测出肿瘤患者且诊断效率高，可靠性有保障，能够实现结肠癌的快速筛查。

本发明的第二个目的是：提供与肿瘤相关的诊断标志物的用途。

本发明的第三个目的是：提供诊断肿瘤、判断肿瘤预后的试剂或试剂盒。

本发明的第四个目的是：提供预防或治疗结肠癌的药物。

本发明所采用的技术方案是，一种与肿瘤相关的新型分子诊断标志物，诊断标志物为celf6。

一种与肿瘤相关的新型分子诊断标志物在制备用于诊断肿瘤的试剂或试剂盒中的用途。

一种与肿瘤相关的新型分子诊断标志物在制备用于判断肿瘤预后的试剂或试剂盒中的用途。

进一步地，肿瘤为结肠癌。

一种诊断肿瘤、判断肿瘤预后的试剂或试剂盒，试剂或试剂盒中包含celf6。

进一步地，肿瘤为结肠癌。

一种与肿瘤相关的新型分子诊断标志物在制备预防或治疗结肠癌的药物中的用途。

一种预防或治疗结肠癌的药物，药物中包含celf6。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新型的结肠癌诊断分子标志物，其特异性好，能准确鉴别肿瘤/非肿瘤患者；敏感性高，能早期检测出肿瘤患者且诊断效率高，可靠性有保障，能够实现结肠癌的快速筛查。

附图说明

图1是本发明实施例1中结肠癌组织中celf6表达量分析图，分析tcga结肠癌rna表达数据库，其中包括480例肿瘤组织和41例正常组织样本，肿瘤组织中celf6的表达水平显著低于正常组织；

图2是本发明实施例2中结肠癌组织免疫组织化学实验图，其中图a为在57例结肠癌和3例正常结肠组织中通过免疫组织化学实验检测celf6表达量图，结肠癌组织中celf6的表达水平显著低于正常结肠组织，图b为结肠癌组织和正常结肠组织中celf6免疫组织化学ihc染色示意图；

图3是本发明实施例3中celf6对细胞增殖活性的影响实验图，其中图a为在hct116细胞中敲低celf6后，对细胞增殖活性的影响实验图，其中sicelf6为敲低实验组，sictrl为对应的阴性对照组，图b为在hct116细胞中敲除celf6基因后，对细胞增殖活性的影响实验图，其中celf6-ko为敲除实验组，ctrl为阴性对照组；

图4是本发明实施例4中蛋白质免疫印迹实验图，其中图a为在hct116细胞中敲低celf6后，蛋白质免疫印迹检测p21、celf6蛋白的表达水平，其中sicelf6为敲低实验组，sictrl为对应的阴性对照组，gapdh为内参蛋白，图b为在hct116细胞中敲除celf6后，蛋白质免疫印迹检测p21、celf6蛋白的表达水平，其中celf6-ko为敲除实验组，ctrl为阴性对照组，gapdh为内参蛋白，图c为在hct116细胞中过表达his-celf6质粒后，蛋白质免疫印迹检测p21、his蛋白的表达水平，其中his-celf6为过表达his-celf6质粒实验组，pcdna3.1为his-celf6的空载对照，gapdh为内参蛋白，图d为在hct116细胞中过表达gfp-celf6质粒后，蛋白质免疫印迹检测p21、gfp蛋白的表达水平，其中gfp-celf6为过表达gfp-celf6质粒实验组，pegfp-c1为gfp-celf6的空载对照，gapdh为内参蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步说明，但应该理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。

实施例1结肠癌组织中celf6表达量分析

本申请发明人从癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,tcga)官网下载结肠癌的rna-seq数据进行分析，分析了480例肿瘤组织与41例正常结肠组织中celf6的表达量。

实验结果如图1所示，显示celf6在结肠癌组织中的表达显著低于正常结肠组织。

实施例2结肠癌组织免疫组织化学实验

将57例结肠癌与3例正常结肠临床组织切片经脱蜡水化、磷酸盐缓冲液pbs清洗、抗原修复、血清封闭等一系列步骤后，再分别用1：10005％bsa(胎牛血清)体积比稀释的celf6抗体4℃冰箱过夜孵育，经生物素标记的二抗37℃恒温孵育30min后，显色、复染、清洗、脱水透明后封片。

实验结果如图2所示，显示结肠癌组织中celf6的表达水平显著低于正常结肠组织。

实施例3celf6对细胞增殖活性的影响

在hct116细胞中敲低celf6或敲除celf6基因后，做细胞增殖实验，步骤如下：

1)在hct116细胞中转染sicelf6敲低celf6的表达，sictrl为阴性对照组或利用crispr/cas9技术获得celf6基因敲除的hct116细胞系，ctrl为对应的阴性对照组，；

2)制备细胞悬液，用细胞计数仪计数悬液中细胞数量，按比例依次用培养液等比稀释成一个细胞浓度梯度，做5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔，然后接种在96孔板中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，每100ul培养基加10ulcck-8试剂，2h后用酶标仪测定在450nm处的od值，制作出一条以od值为纵坐标，细胞数量为横坐标的标准曲线。在实验条件完全一致的前提下，可根据此标准曲线计算出未知样品的细胞数量；

3)在96孔板中接种celf6敲低或celf6敲除细胞悬液(3x10³个/100ul/孔)，接种4块96孔板，将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养，24h、48h、72h、96h后分别取一块96孔板，向每孔中加入10ul的cck-8试剂，将培养板置于培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的od值，记录并统计4天测得的od值，根据之前绘制的标准曲线计算出每一个od值对应的细胞数量，然后以细胞数量为纵坐标，天数为横坐标制作细胞增殖曲线。

实验结果如图3所示，显示敲低或敲除celf6基因后，细胞的增殖活性性明显增强，说明celf6可调控细胞的增殖。

实施例4蛋白质免疫印迹实验

收集celf6基因敲除/敲低/过表达的细胞样品，经细胞裂解、蛋白质定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、一抗4℃过夜孵育、二抗37℃孵育45min、曝光等一系列蛋白质免疫印迹步骤后分析在敲低celf6基因或敲除celf6基因以及过表达celf6后，p21蛋白的表达情况。

具体的his-celf6/gfp-celf6质粒转染步骤如下：1)提前接种40万hct116细胞于6cm皿中，培养至细胞完全贴壁；2)准备3个无菌离心管，在其中两个离心管中各加入250ul无血清培养基opti-mem、1.5ug的质粒和p3000转染试剂，另一个离心管中加入500ulopti-mem和8ul的lipo3000转染试剂，超净工作台中静置5min；3)将含有lipo3000的离心管中液体均分到对照组或实验组管中，用移液器轻微吹打混匀，静置20min；4)将质粒与脂质体的混合物滴加入对应的6cm皿中，补充基本培养基至1ml体系，将6cm皿置于37℃、5％co2培养箱中；5)12h后更换培养基，继续置于培养箱中培养，48h后收集样品待用。

实验结果如图4所示，显示敲低或敲除celf6基因后，p21蛋白的表达显著下调，而过表达celf6后，p21蛋白的表达显著上调，说明celf6影响p21蛋白的表达，进而影响细胞的周期进程。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。