本发明涉及一种基于N-端和C-端等重标记和串级质谱成对碎片离子峰强度的完整N-糖肽相对定量方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、糖蛋白质组学等
技术领域：
：。
背景技术：
：：蛋白质是生物体内生命活动的重要承担者，蛋白质的翻译后修饰对于蛋白质参与生物体内的生命活动有着重要作用。蛋白质组学通过对正常生物体系与疾病生物体系内的蛋白质组进行大规模检测，比较分析两种体系内的差异，可以找到某些疾病的生物标志物。目前定量分析的主要方法是通过同位素标记或者同重标记的方式对两种生物体系内的多肽进行标记，同位素标记技术主要是通过一级质谱的信号进行定量，同重标记是通过二级质谱报告离子的相对强度进行定量，相比于同位素标记，受杂质信号干扰小，准确度更好(Nicholson,J.K.；Lindon,J.C.；Holmes,E.,'Metabonomics':understandingthemetabolicresponsesoflivingsystemstopathophysiologicalstimuliviamultivariatestatisticalanalysisofbiologicalNMRspectroscopicdata.Xenobiotica1999,29(11),1181-1189.；Nicholson,J.K.；Connelly,J.；Lindon,J.C.；Holmes,E.,Metabonomics:aplatformforstudyingdrugtoxicityandgenefunction.NatureReviewsDrugDiscovery2002,1(2),153-161.；Nicholson,J.K.；Wilson,I.D.,Understanding'global'systemsbiology:Metabonomicsandthecontinuumofmetabolism.NatureReviewsDrugDiscovery2003,2(8),668-676.)。2004年iTRAQ技术商业化并进入市场，iTRAQ技术可以对多组多肽样本进行同位素标记并定量(Boersema,P.J.；Raijmakers,R.；Lemeer,S.；Mohammed,S.；Heck,A.J.R.,Multiplexpeptidestableisotopedimethyllabelingforquantitativeproteomics.NatureProtocols2009,4(4),484-494.)。其主要原理是将同位素标签标记到样本分子的氨基酸上，在标记后，不同标签标记的各组样本分子量仍然相同，由于同位素不改变化学性质，多肽样本在色谱中仍然同时洗脱，进入质谱，同时在一级谱图上不会区分，在将前体离子进行解离时，碎片信号会在二级谱上显示相差1Da的报告离子，达到定量的效果。稳定同位素标记技术(SILAC)，主要原理是利用同位素标记的氨基酸来培养细胞，在细胞不断生长、分裂的过程中，细胞内的蛋白质会由同位素标记氨基酸合成，一般在经历5-6次细胞传代以后，细胞中的蛋白质将都会带有同位素标记(Cox,J.；Mann,M.,MaxQuantenableshighpeptideidentificationrates,individualizedp.p.b.-rangemassaccuraciesandproteome-wideproteinquantification.NatureBiotechnology2008,26(12),1367-1372.)。18O同位素标记技术，主要原理是利用蛋白质酶切过程需要水参与反应，通过将溶液中的水全部替换成18O同位素标记的水，在酶切结束后，18O会被标记到多肽的C端，从而达到同位素标记的目的(Chu,F.；Mahrus,S.；Craik,C.S.；Burlingame,A.L.,Isotope-codedandaffinity-taggedcross-linking(ICATXL):Anefficientstrategytoprobeproteininteractionsurfaces.JournaloftheAmericanChemicalSociety2006,128(32),10362-10363.)。传统的准等重同位素标记技术大多采用13C和D的组合实现准等重标记，但由于D和H在色谱中可能存在保留时间的差异，导致标记两种多肽不能完全同时洗脱进入质谱进行检测，这会带来一定的定量误差。技术实现要素：本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N-糖肽，使用同位素酯化反应对完整N-糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N-糖肽1:1混合，使用RPLC-MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。本发明中，在完整N-糖肽的C端使用酯化反应进行同位素标记时，其中，正常生理体系完整N-糖肽的C端使用CH3CH2CH2OH试剂进行标记，患病体系的C端使用(CD3)2CHOH试剂进行标记。本发明中，在完整N-糖肽的N端通过控制反应体系的pH值实现只对N端的二甲基标记，对于正常体系完整N-糖肽使用DCDO试剂和NaBD3CN试剂进行同位素标记，对于患病体系完整N-糖肽使用HCHO和NaBH3CN进行标记。本发明中，1:1混合指：按照正常生理体系和患病体系标记后完整N-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。本发明中，经过同位素酯化反应、同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽进行标记后，两种体系的完整N-糖肽具有相同的分子量。本发明中，使用RPLC-MS/MS进行检测时，在液相色谱中两种体系的完整N-糖肽同时洗脱，两种体系的完整N-糖肽同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量。本发明中，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析是指：对采集到的质谱数据进行定性和定量搜索，找出患病体系相对于正常体系差异表达的完整N-糖肽，获得其结构信息。GPSeeker数据库的具体信息请见：KaijieXiao,ZhixinTian*.GPSeekerenablesquantitativestructuralN-glycoproteomicsforsite-andstructure-specificcharacterizationofdifferentiallyexpressedN-glycosylationinhepatocellularcarcinoma.JournalofProteomeResearch,2019,10.1021/acs.jproteome.9b00191.本发明中，使用Trypsin酶切细胞的蛋白质，zic-HILIC富集细胞的完整N-糖肽。本发明中，蛋白质提取后，还原、烷基化、天冬氨酸及谷氨酸酯化保护，再使用Trypsin酶切细胞的蛋白质，zic-HILIC富集细胞的完整N-糖肽。本发明首先培养正常体系细胞和患病体系细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，使用Trypsin酶切两种细胞的蛋白质，zic-HILIC富集两种细胞的完整N-糖肽，使用同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽N端进行标记(可以参考Zhang,S.；Wu,Q.；Shan,Y.C.；Zhou,Y.；Zhang,L.H.；Zhang,Y.K.,PartiallyisobaricpeptideterminilabelingassistedproteomequantitationbasedonMSandMS/MSsignals.JournalofProteomics2015,114,152-160.)，使用同位素酯化反应对完整N-糖肽C端进行标记(可以参考Hunt,D.F.；Yates,J.R.；Shabanowitz,J.；Winston,S.；Hauer,C.R.,ProteinSequencingbyTandemMass-Spectrometry.PNatlAcadSciUSA1986,83(17),6233-6237.)，将两种标记后的完整N-糖肽1:1混合，使用RPLC-MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析。与现有技术相比，本发明所采用的准等重同位素标记技术，是在完整N-糖肽的N端与C端分别标记两种标签，每种同位素标签标记后都会使分子量增加6Da，并且在两种标签中都引入了相同数量的D。等重标记中，成对的肽骨架N-端碎片离子(a,b,c)和C-端碎片离子(x,y,z)可独立进行相对定量或同时使用进行更加准确的相互验证相对定量。这使得两种标签标记后的样品在色谱中会有相同的保留时间，同时进入质谱，增加定量的准确度，同时本方法又有成本低，耗时短的优点。本发明能够在完整N-糖肽水平上对正常体系和患病体系进行分析，找出潜在的生物标志物，方法简明，鉴定准确。适用于基于质谱的完整N-糖肽的定量分析。附图说明图1LO2和HepG2完整N-糖肽准等重同位素标记实验流程图；图2控制组(如LO2，A)和实验组(如HepG2，B)完整N-糖肽C-端同位素酯化和N-端同位素二甲基化组合等重标记流程图。具体实施方式通过Trypsin酶切、zic-HILIC富集的方法获得LO2和HepG2两种细胞的完整N-糖，使用同位素二甲基标记和同位素酯化反应两种方法结合的准等重同位素标记技术对LO2与HepG2两种细胞完整N-糖肽进行标记，通过高效液相色谱和高分辨质谱对完整N-糖肽进行分离检测，使用GPSeeker完整N-糖肽数据搜索软件进行完整N-糖肽的定性鉴定和定量分析。LO2和HepG2完整N-糖肽准等重同位素标记实验流程如图1所示，同位素酯化反应和同位素二甲基标记原理如图2所示。正常体系LO2和HepG2细胞培养:细胞传代：首先用移液枪慢慢移除培养液，用移液枪量取2mL1XPBS清洗细胞，共2次。用移液枪量取1mL胰酶加入培养皿中并在培养箱(37℃，5％CO2)中消化细胞1min。随后加入2mL培养基终止消化。使用移液枪将细胞从培养皿底部吹打下来，全部转移至15mL离心管中。在1000rpm下离心5min。去除上层废液，加入3mL培养基。使用移液枪反复吹打至细胞均匀分散在培养基中。取三只10cm塑料培养皿，每只加入1mL分散有细胞培养基与9mL新培养基，然后放入培养箱(37℃，5％CO2)中培养。细胞收集:用新的滴管移去培养基，用移液枪移取2mL1×PBS溶液清洗细胞，共清洗两次。用移液枪移取1mL胰酶加入培养皿中，将培养皿放入培养箱中2min。完成后移取2mL培养基加入细胞中使胰酶失活，将所有溶液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，移除上层清液，在-80℃冰箱中保存细胞。LO2和HepG2蛋白质提取:蛋白质提取:用PBS溶液清洗培养好的细胞，用移液枪量取1mL细胞裂解液(600mMTris，4％SDS)加入4盘细胞中，在冰浴中进行细胞破碎，细胞破碎时的参数设置为:超声3s，停止5s，在20％能量下超声20min，超声结束后将蛋白溶液低温离心30min，用移液枪加入6倍体积的预冷丙酮溶液，在-20℃下放置4h，结束后，用8MUrea溶液溶解蛋白。并用BCA法测量蛋白质浓度。还原、烷基化、天冬氨酸及谷氨酸酯化保护、Trypsin酶切:正常酯化试剂配制:160μL乙酰氯，1mL丙醇同位素酯化试剂配制:160μL乙酰氯，1mL(CD3)2CHOH分别用移液枪量取600μgHepG2和LO2蛋白质于两支离心管中，加入100μL浓度为200mM的DTT溶液，放入55℃烘箱中反应30min，反应结束后加入200μL浓度为200mM的IAA溶液，避光保存半小时，完成后将离心管置于光线下，使反应终止，完成还原烷基化。将蛋白浓缩至干，加入1mL正常酯化试剂反应2h。用移液枪加入6倍体积的预冷丙酮溶液，在-20℃下放置4h，结束后，用8MUrea溶液溶解蛋白。并用BCA法测量蛋白质浓度。将HepG2和LO2蛋白质按照蛋白质与酶质量之比为50:1加入Trypsin进行酶切，在摇床中过夜酶切，保持摇床内温度为37℃。酶切完成后，在水浴中反应5min，结束酶切。完整N-糖肽富集步骤:按照质量比为50:1的比例称取C18填料，在移液枪头的前端加入筛板，将C18填料加入移液枪头中，制作C18除盐小柱，将多肽溶液加入移液枪头中，推动注射器使多肽溶液通过C18填料，收集通过的多肽溶液，重复操作4次，使多肽完全与C18填料相结合，用移液枪吸取100μL浓度为0.1％(v/v)的TFA溶液，推动注射器使溶液通过C18填料，带走小分子杂质，收集并保存溶液直至实验结束，重复6次，确保除盐效果。量取200μL浓度为50％的ACN(0.1％TFA)溶液加入移液枪头中洗脱多肽，共两次，用200μL浓度为80％(v/v)的ACN(0.1％TFA)洗脱两次，收集4次洗脱液并合并，将收集后的多肽溶液用真空浓缩仪浓缩至干，量取200μL上样缓冲液(80％ACN，1％TFA)重新溶解多肽。按照质量比为30:1的比例称取zic-HILIC填料，在移液枪头的前端加入筛板，将zic-HILIC填料加入移液枪头中，制作zic-HILIC除盐小柱。首先用移液枪吸取200μL上样缓冲液加入除盐小柱中，用注射器将液体推出，重复两次，使zic-HILIC填料达到平衡状态。将溶解有多肽样本的上样缓冲液加入小柱中，在注射器压力下使溶液通过zic-HILIC填料，收集溶液，重复上样4次，使完整N-糖肽与zic-HILIC充分结合。用移液枪吸取200μL上样缓冲液加入除盐小柱中，用注射器将液体推出，重复四次，保留4次溶液至实验结束。用移液枪吸取100μL浓度为0.1％TFA溶液至小柱中，在注射器压力下，使溶液通过zic-HILIC填料，收集洗脱的完整N-糖肽，重复3次，再依次用100μL浓度为50mM的NH4HCO3溶液洗脱完整N-糖肽，收集并混合所有洗脱液，用BCA法测完整N-糖肽的浓度。同位素酯化反应:用移液枪分别量取50μgLO2和HepG2完整N-糖肽于离心管中，在LO2完整N-糖肽中加入116μL正常酯化试剂(16μL乙酰氯，0.1mL(CH3)2CHOH)，在HepG2完整N-糖肽中加入116μL同位素酯化试剂(16μL乙酰氯，0.1mL(CD3)2CHOH)，室温下反应两小时，反应结束后，真空浓缩至干。同位素二甲基标记:用移液枪分别量取100μL1％CH3COOH溶解LO2和HepG2完整N-糖肽，量取8μL4％DCDO水溶液加入LO2完整N-糖肽中，量取8μL4％HCHO水溶液加入HepG2完整N-糖肽中，分别振荡1min，分别向LO2和HepG2完整N-糖肽中加入8μL0.6MNaBD3CN和NaBH3CN，室温反应10min后，分别加入10μL0.1％FA淬灭反应。使用C18除盐，除盐后的完整N-糖肽真空浓缩至干，并用50μL超纯水溶解，保存于4℃冰箱中，等待后续RPLC-MS/MS分析。液质联用分析:准等重同位素标记的完整N-糖肽溶液通过进样针上样至定量环中，六通阀切阀后糖肽样本在流动相作用下直接进入C18分析柱中，开始洗脱。质谱参数设置如下：喷雾电压设置为2.7kV，离子传输管温度设置为250℃，一级质谱和二级质谱的分辨率分别为70000和17500。自动增益控制(AGC)分别为2e5，5e5。最大扫描时间都设置为250ms。一级质谱采集范围设置为700-2000。二级质谱使用HCD(TOP20)对前体离子进行解离，最大离子注入时间300ms，前体离子选质窗口设置为3m/z，归一化碰撞能量(NCE)设置为20％，30％，30％，动态排除时间为20s。RPLC-MS/MS实验采集的数据GPSeeker中进行数据搜索，通过FDR控制进行完整的N-糖肽鉴定，在创建完整N-糖肽数据库时，从UniProt下载完整人蛋白质组的.fasta文件，下载时选择的标准为物种＝人类，已验证过的蛋白，去除组蛋白，去除片段多肽；在建立数据库时选择Trypsin；酶切时允许1个漏切位点；最小糖肽长度设定为6个氨基酸；对于LO2完整N-糖肽数据库，静态修饰选择完整N-糖肽N端二甲基化和C端同位素丙基化；动态修饰包括甲硫氨酸氧化和N-X-S/T(X≠P)基序上的N-连接糖基化。对于HepG2完整N-糖肽数据库，静态修饰选择完整N-糖肽N端同位素二甲基化和C端丙基化；动态修饰包括甲硫氨酸氧化和N-X-S/T(X≠P)基序上的N-连接糖基化。同位素峰丰度截止值(IPACO)，同位素峰质荷比偏差(IPMD)和同位素峰丰度偏差(IPAD)分别为40％/15ppm/50％和20％/15ppm/30％。完整N-糖肽谱图匹配(GPSM)的进一步搜索标准包括:N-连接糖的最小匹配碎片离子＝1，N-连接糖的TopN＝1，肽骨架的匹配碎片离子的最小百分比＝30％，TopNY1＝3。用GPSeeker分别进行LO2和HepG2完整N-糖肽的数据搜索，将每个数据的正库与反库组合并按照pg-score递减的顺序排序，确定一个pg-score值使得FDR≤1％，通过完整N-糖肽序列、糖基化位点、N-连接糖结构进行去重，最后获得完整N-糖肽的鉴定列表。通过比对二级质谱中两种体系完整N-糖肽b/y离子的相对强度，获得差异表达完整N-糖肽和糖蛋白的差异表达信息。上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
：的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3