红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法与流程

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法。

背景技术：

红花(Carthamus tinctorius L.)作为一种活血化瘀、疏通经络的中药，常用来治疗痛经、胸痛腹痛、跌打损伤和消除肿胀。临床上还可用于治疗各种心脑血管疾病，如冠心病、脑血栓和心肌缺血。HSYA是红花中最有效的水溶性生物活性成分之一，具有抑制血小板聚集和血栓形成、改善心肌缺血、抗炎和抗氧化等作用，通常用于食品着色添加剂和保健品的制造，也可用于制药工业。AHSYB是除HSYA以外红花中主要的生物活性成分。从它的化学结构来看，具有大量的酚羟基并有较强的抗氧化活性。但目前对于AHSYB的研究很少。

传统的中药提取方法有很多种，包括煎煮法、浸渍法、加热回流法、渗漉法、超临界萃取法和超声提取法。其中超声提取法工艺简单方便，提取时间较短，提取率较高。中药有效成分的提取率受诸多因素影响，如提取温度、时间、溶剂浓度、液料比、PH值、超声功率、粒径大小和提取次数等。

传统的中药提取方法的优化方法多基于实际实验，这样大大耗费了人力和物力而且未必能实现最优的效果。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法的技术方案。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于包括以下步骤：

1)对红花进行超声提取，采用单因素试验选择超声温度、超声时间、液料比和超声功率作为影响提取率的因素；

2)根据Box-Benhnken的中心组合设计原则进行超声温度、超声时间、液料比和超声功率四因素三水平的实验设计；

3)采用HPLC测定HSYA和AHSYB的含量，计算出提取率；

4)通过熵权法计算出HSYA和AHSYB权重值，并将综合评价值作为评价指标；

5)采用响应面软件进行分析，取综合评价值为最大值，得到最优的提取条件。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于所述步骤3)中HPLC选用乙腈-0.1％甲酸水作为流动相，检测波长403nm。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于所述步骤3)中提取率＝C/C生药*100％，其中C为HSYA和AHSYB浓度，C生药为生药浓度。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于所述步骤4)中HSYA和AHSYB的权重系数分别为0.478和0.522，综合评价值＝HSYA提取率×0.478+AHSYB提取率×0.522。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于所述步骤5)中采用响应面软件进行分析得到综合评价指标为：

Y＝-6.36227+0.038180A+0.036360B+0.61164C+9.86701*10^-3D-8.69385*10^-5AB+1.90308*10^-4AC+8.67310*10^-6AD-3.75000*10^-4BC-7.33154*10^-5BD-4.75769*10^-5CD-2.96936*10^-4A²-1.91736*10^-4B²-0.019321C²-2.34436*10^-5D²，其中A为超声温度，B为超声时间，C为液料比，D为超声功率。

所述的红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化方法，其特征在于包括以下步骤：对红花进行超声提取，其中超声温度为66℃，超声时间为36min，液料比为16：1，超声功率为150W。

本发明首先通过单因素试验对影响提取率的试验因素进行筛选，再用Box-Benhnken中心组合法对实验进行设计，然后HPLC法测定HSYA和AHSYB的含量，计算出提取率，并根据权重值计算出综合评价值作为评价指标，最后用响应面设计软件确定红花中这两种成分的最佳提取工艺条件。本发明能够高效快速有效地提取得到红花中的HSYA和AHSYB，提取时间短，提取率高。

附图说明

图1为混合对照品溶液(a)和红花供试品溶液(b)的HPLC图，1：HSYA；2:AHSYB；

图2超声温度与超声时间对HSYA和AHSYB提取率影响的响应面；

图3超声温度与液料比对HSYA和AHSYB提取率影响的响应面；

图4超声温度与超声功率对HSYA和AHSYB提取率影响的响应面；

图5超声时间与液料比对HSYA和AHSYB提取率影响的响应面；

图6超声时间与超声功率对HSYA和AHSYB提取率的响应面；

图7液料比与超声功率对HSYA和AHSYB提取率影响的响应面。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例：

1.仪器与试剂

1.1仪器XS250电子天平(梅特勒国际有限公司)、超纯水仪(Mettler Toledo公司)、Waters2695型高效液相色谱仪(在线真空脱气机、自动进样系统、柱温箱、2498型紫外检测器、Empower软件，)、抽滤瓶、布氏漏斗、SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(河南省太康科教器材厂)、2-16PK离心机(德国Sigma公司)、SK5210HP超声波清洗仪器(上海科导超声仪有限公司)

1.2试剂红花购于杭州惠远实业有限公司(产地：新疆，批号：151020)、HSYA对照品购于南京世洲生物科技有限公司(批号SZ201702005QA，含量≥98％)、AHSYB对照品购于上海源叶生物科技有限公司(批号S08M9D60888，含量≥98％)、乙腈、甲醇(色谱纯，Tedia公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1HPLC方法的建立

2.1.1色谱条件：色谱柱：Extend-C18；流动相：乙腈(B)、0.1％甲酸水(D)；梯度洗脱(0-12min，10％-22％B；12-20min，22％-26％B；20-30min，26％-95％B；30-40min，95％-10％B)；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测波长：403nm；进样量：10μL。

2.1.2对照品溶液的制备：分别精密称取羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B对照品适量，分别用纯净水配制成1mg/ml的对照品储备液。

2.1.3供试品溶液的制备：称取红花样品5g，置于锥形品中，以液料比为16：1，温度为70℃、功率为200W条件下超声提取30min，提取液用布氏漏斗抽滤，滤液在12000r·min^-1离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即为供试品溶液。

2.1.4标准曲线的制备：精密吸取HSYA对照品储备液，分别用水稀释至浓度为：0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml。按照“2.1.1”色谱条件下进样检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标,绘制标准曲线，得到HSYA的标准曲线为：Y＝2×10⁷X-1×10⁶，R²＝0.9996；精密吸取AHSYB对照品储备液，分别用水稀释至浓度为：0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml、0.14mg/ml、0.16mg/ml。按照“2.1.1”色谱条件下进样检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标,绘制标准曲线，得到AHSYB的标准曲线为：Y＝3×10⁷X-476451，R²＝0.9997。

2.1.5专属性试验：分别精密吸取混合对照品溶液和红花供试品适量，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，HSYA和AHSYB峰分离完全，峰形较好，分离度大于1.5，见图1。表明该方法专属性良好。

2.1.6精密度试验：分别精密吸取0.5mg/ml的HSYA和0.1mg/ml的AHSYB对照品溶液适量，按照“2.1.1”项下色谱条件平行测定6次，得到峰面积RSD值分别为0.91％和0.73％，表明仪器精密度良好。

2.1.7重复性试验：称取红花5g，按照“2.1.3”项制备供试品溶液6份，在“2.1.1”项色谱条件下测定，得到HSYA峰面积RSD值为1.8％，AHSYB峰面积RSD值为1.1％,表明该方法重复性良好。

2.1.8提取率计算：各供试品溶液在“2.1.1”项色谱条件下进样检测，将HSYA和AHSYB峰面积值代入回归方程，分别计算出HSYA和AHSYB的浓度，根据以下公式计算出提取率：C/C生药*100％。其中C为HSYA和AHSYB浓度，C生药为生药浓度(生药质量/提取体积)。

2.2单因素实验

2.2.1超声时间对提取率的影响：称取5份5g红花，以液料比为12：1，温度为60℃，功率为200W条件下分别超声提取20、30、40、50、60min，实验结果表明超声时间为40min时，HSYA和AHSYB提取率最高，故选用30、40、50min作为响应面设计中超声时间的三水平。

2.2.2超声温度对提取率的影响：称取5份5g红花，以液料比为12：1，功率为200W，分别在温度为40、50、60、70、80℃条件下超声提取30min，实验结果表明超声温度为70℃时，HSYA和AHSYB提取率最高，故选用60、70、80℃作为响应面设计中超声温度的三水平。

2.2.3超声功率对提取率的影响：称取5份5g红花，以液料比为12：1，温度为70℃，分别在功率为40、80、120、160、200W条件下超声提取30min，实验结果表明超声功率为160W时，HSYA和AHSYB提取率最高，故选用120、160、200W作为响应面设计中超声功率的三水平。

2.2.4液料比对提取率的影响：称取5份5g红花，以10∶1、12∶1、14∶1、16∶1和18：1的液料比，在温度为70℃，功率为200W条件下超声提取30min。实验结果表明当液料比为16：1时，HSYA和AHSYB提取率最高，故选用14∶1、16∶1和18：1作为响应面设计中液料比的三水平。

2.2.5提取次数对提取率的影响：称取5份5g红花，以液料比为18：1，温度为70℃，功率为200W条件下分别超声提取1、2、3、4、5次。实验结果表明，当提取次数为3次时，HSYA和AHSYB提取率最高，并随着提取次数的增加，提取率趋于平缓，说明次时HSYA和AHSYB已提取完全。

2.3响应面法优化工艺

在单因素试验基础上，选取超声温度、超声时间、液料比和超声功率作为四因素，以HSYA和AHSYB的提取率作为评价指标，根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理选定实验组数为30组(每组5g红花，平行设置3组)，采用四因素三水平的响应面分析方法优化提取工艺。试验因素及水平见表1，分析方案及实验结果见表2。

综合评价值的计算：根据熵权法计算权重值，得到HSYA和AHSYB的权重系数分别为0.478和0.522，综合评价值＝HSYA提取率×0.478+AHSYB提取率×0.522。

表1 BBD试验因素及编码

表2 BBD分析方案及实验结果(n＝3)

采用Design-Expert8.0.6响应面软件对以上30组提取率进行分析(图2-7)，得到回归方程分别为：综合评价指标：

Y＝-6.36227+0.038180A+0.036360B+0.61164C+9.86701*10^-3D-8.69385*10^-5AB+1.90308*10^-4AC+8.67310*10^-6AD-3.75000*10^-4BC-7.33154*10^-5BD-4.75769*10^-5CD-2.96936*10^-4A²-1.91736*10^-4B²-0.019321C²-2.34436*10^-5D²。方差分析见表3。同时得到最佳提取工艺为：温度66.28℃、超声时间35.62min、液料比为15.62：1、超声功率151.15W、综合评价指标为1.074。根据实际情况将最佳提取条件调整为：温度66℃、超声时间36min、液料比为16：1、超声功率150W。

表3方差分析及显著性检验

注：*P<0.05显著，**P<0.01极显著。

2.5验证试验

称取5份红花，每份5g，按照上述响应面优化方法得到的提取工艺条件进行超声热回流提取，测定HSYA、AHSYB的提取率。结果见表4。工艺优化的评价综合评价值为1.083，较高与预测值，验证结果与预测值，表明所得结果准确可靠。

表4响应面最佳工艺条件下的验证试验

3.分析与讨论

超声提取是一种方法简便、提取时间短、提取效率高的中药提取方法。主要是通过超声波的空化作用、热效应和机械作用使中药中的有效物质释放、扩散和溶解，使提取率明显高于传统的提取工艺，可作为一种理想的红花提取方法。

中药提取溶剂通常选择不同浓度的乙醇，但乙醇作为一种有机物，具有易燃、易挥发、有特殊气味等特点，并具有一定的毒性。本实验中提取的两种有效成分(HSYA和AHSYB)都属于红花中水溶性成分，因此，从经济安全方面考虑，以纯净水作为提取溶剂。

HPLC色谱条件的优化中，选用乙腈-0.1％甲酸水作为流动相，能够使HSYA和AHSYB的分离效果达到更好。甲醇虽然价格相对比较便宜，但是由于粘度比较大，很容易使柱压达到上限，而且分离效果远不如乙腈。故本实验流动相选择为乙腈-0.1％甲酸水。在波长为403nm时，HSYA和AHSYB具有较大紫外吸收，故选用403nm。

响应面设计法是一种综合数学和统计学的方法，已成功应用于多方面的优化过程中，用来评估多因素及其相互作用对评价指标的影响。本实验利用Box-Benhnken中心组合实验设计和响应面分析法,对红花中HSYA和AHSYB两种有效成分的提取工艺进行优化，根据实际情况调整后得到的最佳提取条件为：温度66℃、超声时间36min、液料比为16：1、超声功率150W。该模型能够在一定程度上反映HSYA和AHSYB的提取条件，且验证结果准确可靠。

超声提取红花中的HSYA和HSYB方法简单，能够缩短提取时间，响应面分析方法可用于红花中HSYA和AHSYB的提取工艺优化。