一种检测四水合辅羧酶杂质A含量的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种检测四水合辅羧酶中杂质a含量的高效液相分析方法。

背景技术：

四水合辅羧酶为维生素类药，在体内参与糖代谢中丙酮酸和a-酮戊二酸的氧化脱羧反应，是糖类代谢所必需，临床上常用于脚气病或wernicke脑病的治疗，亦可用于辅羧酶四水合物缺乏引起的周围神经炎、消化不良等的辅助治疗，目前也用作复方维生素制剂产品注射用多种维生素(12)的其中一种原料药。四水合辅羧酶杂质a(硫胺素一磷酸酯)为四水合辅羧酶的降解产物，其结构式为：

在国内外药典中并未收载四水合辅羧酶的标准，在国家标(ybh03552014)四水合辅羧酶有关物质检查中，有四水合辅羧酶杂质a的检测，但是适用于原料的检验，不适合于含有四水合辅羧酶的复方制剂产品如注射用多种维生素(12)中四水合辅羧酶杂质a的检验，专属性不符合规定，且检测四水合辅羧酶杂质a的方法为衍生法，检测器为荧光检测器，操作繁琐，且样品处理方法并不适用。

技术实现要素：
：

为解决上述问题，本发明提供一种检测四水合辅羧酶原料以及含有四水合辅羧酶原料的维生素制剂中四水合辅羧酶杂质a含量的方法，本申请的技术方案如下：

一种检测四水合辅羧酶杂质a含量的分析方法，该方法采用高效液相色谱仪测定，其色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相a：含己烷磺酸钠或类似效能离子对的磷酸盐缓冲溶液；

流动相b：甲醇、乙腈、流动相a-甲醇或流动相a-乙腈中的一种；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-50℃；

检测波长：240-270nm；

进样量：20μl；

流动相a、b按梯度程序进行。

其中，优选的色谱柱为agelavenusilxbpc18(l)，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的色谱柱；

优选的，流动相a为0.01mol/l-0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液，己烷磺酸钠的浓度为1g/l-4g/l，流动相a用磷酸调节ph值为3.0-5.0，流动相a中的离子对试剂可以是与己烷磺酸钠作用类似的其他离子对试剂如庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等磺酸钠离子对试剂，磷酸盐可以为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等。

优选的，流动相b为甲醇、乙腈、流动相a-甲醇或流动相a-乙腈中的一种，其中流动相a与甲醇或乙腈的比例为20～30：80～70；

优选的流速为1.0ml/min

优选的柱温为45℃；

优选的检测波长为248nm；

进样梯度洗脱程序为：

该方法可用于检测四水合辅羧酶原料或含有四水合辅羧酶原料的制剂中四水合辅羧酶杂质a的含量，特别是维生素制剂中杂质a含量的检测，从而进行原料及制剂中四水合辅羧酶杂质a含量的质量控制。

本发明产生的有益效果：

1)通过使用高效液相色谱仪的技术，提供了一种检测四水合辅羧酶中四水合辅羧酶杂质a含量的方法，耗材易得、准确度、灵敏度高。

2)经过检测，四水合辅羧酶杂质a定量限为5.002ng，检测限为1.701ng，表明该法检测灵敏度较高。

3)四水合辅羧酶杂质a在0.250μg/ml～17.864μg/ml浓度范围内，线性回归方程为a＝30965c-2366，相关系数为0.9999，线性关系良好。

4)在样品中加入已知量的四水合辅羧酶杂质a对照品，测得的平均回收率为98.13％，符合可接受标准，说明该方法准确度良好。

附图说明：

图1是实施例2中四水合辅羧酶杂质a的标准曲线图

图2是实施例4中检测待测样品的色谱图

具体实施方式：

实施例1检测限和定量限的检测

步骤(1)取四水合辅羧酶杂质a对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；

步骤(2)精密量取步骤(1)中的溶液1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；

步骤(3)精密量取步骤(2)中的溶液6ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl，注入液相色谱仪，信噪比s/n约为10:1，作为定量限，四水合辅羧酶杂质a浓度为0.25μg/ml；

步骤(4)精密量取步骤(2)中的溶液2ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl，注入液相色谱仪，信噪比s/n约为3:1，作为检测限，四水合辅羧酶杂质a浓度为0.085μg/ml。

实施例2标准曲线的测定

步骤(1)取四水合辅羧酶杂质a对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；

步骤(2)分别精密量取步骤(1)中的溶液0.2ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.6ml和2.0ml，置不同10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为线性1、2、3、4、5、6和7溶液；

步骤(3)精密量取步骤(2)中的线性溶液各20μl，注入液相色谱仪，以浓度c(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，见说明书附图的图1，线性方程为a＝30965c-2366，相关系数r为0.9999。

实施例3回收率的测定

步骤(1)取四水合辅羧酶杂质a对照品约12mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为四水合辅羧酶杂质a对照品贮备液；

步骤(2)取四水合辅羧酶杂质a对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为四水合辅羧酶杂质a对照品溶液；

步骤(3)取注射用多种维生素(12)约190mg，精密称定，置5ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。注射用多种维生素(12)的处方组成参考专利cn107898805a。

步骤(4)取注射用多种维生素(12)约190mg，精密称定，共三份，分别置不同5ml量瓶中，分别精密加入步骤(1)溶液0.8ml、1.0ml、1.2ml，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为80％、100％、120％样品溶液，各浓度水平平行制备三份；

步骤(5)精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算供试品中四水合辅羧酶杂质a的含量，以测得量与原有量之差与加入量的比值计算回收率，结果如下表：

实施例4注射用多种维生素(12)中四水合辅羧酶杂质a含量的测定

步骤1、溶液的配制

对照品溶液的配制：取四水合辅羧酶杂质a对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含12μg的溶液，即得。

供试品溶液的配制：取注射用多种维生素(12)约190mg，精密称定，置5ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。注射用多种维生素(12)的处方组成参考专利cn107898805a。

步骤2、液相色谱条件为：

色谱柱：agelavenusilxbpc18(l)，250mm×4.6mm，5μm或效能相当的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相a：己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/l，用磷酸调节ph值至3.0-5.0，己烷磺酸钠的浓度为1g/l-4g/l，还可以为庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等作用类似的磺酸钠离子对试剂酸钠离子对试剂；

流动相b：流动相b：甲醇、乙腈、流动相a-甲醇或流动相a-乙腈中的任一种；

当流动相b为流动相a-甲醇或流动相a-乙腈时，流动相a-甲醇或流动相a-乙腈，流动相a与甲醇或乙腈的比例为20～30：80～70；流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-50℃；

检测波长：240-270nm；

进样量：20μl；

流动相a、b按梯度程序进行。

精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见说明书附图的图2。按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中四水合辅羧酶杂质a的含量为0.44％。

实施例5四水合辅羧酶中四水合辅羧酶杂质a含量的测定

步骤1、溶液的配制

对照品溶液的配制：取四水合辅羧酶杂质a对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含12μg的溶液，即得。

供试品溶液的配制：取四水合辅羧酶约15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤2、液相色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相a：己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.01-0.1mol/l，用磷酸调节ph值至3.0-5.0，己烷磺酸钠的浓度为1g/l-4g/l，还可以为庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等作用类似的磺酸钠离子对试剂酸钠离子对试剂；

流动相b：流动相b：甲醇、乙腈、流动相a-甲醇或流动相a-乙腈中的任一种；

当流动相b为流动相a-甲醇或流动相a-乙腈时，流动相a与甲醇或乙腈的比例为20～30：80～70；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-50℃；

检测波长：240-270nm；

进样量：20μl；

流动相a、b按梯度程序进行。

精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算，供试品溶液中四水合辅羧酶杂质a的含量为0.38％。