氟比洛芬酯对映异构体及杂质A的液相色谱分离检测方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及氟比洛芬酯对映异构体及杂质a的液相色谱分离检测方法。

背景技术：

氟比洛芬是一种非甾体类抗炎药，具有抗炎镇痛作用。氟比洛芬酯是氟比洛芬的前体药物，化学名为(±)-2-(2-氟-4-联苯基)丙酸-1-乙酰氧基乙酯。其在临床上应用十分广泛，可用于手术后及各种癌症的镇痛。作用机理主要是抑制花生四烯酸环氧酶的活性，从而抑制疼痛和炎症反应的前列腺素的合成。

氟比洛芬酯有两对对映异构体，目前临床上使用的氟比洛芬酯药物为其消旋体，制剂类型为脂肪乳注射液，该剂型是依据药物传递系统概念研发的以脂肪乳为药物载体，包封氟比洛芬酯的制剂，其注射时刺激性小，止痛作用起效快。该消旋体具有两种光学异构体，s型和r型。目前国内外的一些研究表明，s-氟比洛芬酯对环氧合酶有抑制性，起主要的抗炎镇痛活性，r-氟比洛芬酯对环氧合酶无抑制作用，但能起到镇痛作用。也有研究表明r-氟比洛芬酯能够通过调整γ-分泌酶，选择性抑制aβ1-42淀粉状前体蛋白从而防治阿尔茨海默病，并由美国myriadgenetics公司开发，正处于阿尔茨海默病的三期临床研究。专利cn1736374a公开了一种r-氟比洛芬酯在制备镇痛及治疗癌症或老年痴呆药物中的用途。专利cn102670502a公开了一种以s(+)-氟比洛芬酯为药用活性成分的注射乳剂，从而降低氟比洛芬酯的临床用量，解决副作用大的缺点。专利cn103301063a也公开了一种s(+)-氟比洛芬酯注射乳剂，其给出了氟比洛芬酯的s(+)-对映体相对于氟比洛芬酯消旋体注射液的有效剂量。由此可见，由于氟比洛芬酯的对映异构体在体内药理作用的差异，为便于进行立体选择性药效和药动学研究，确保疗效，保证药物的质量控制，对氟比洛芬酯药物两对对映异构体的分离检测具有重要意义。

氟比洛芬酯与其主要相关物质(杂质a：脱氟氟比洛芬酯)结构相似(图1)，都有两个手性中心，各有两对对映异构体(enantiomers)或一对非对映异构体。因二者结构相似，仅相差一个f元素，存在两个手性中心，每个成分在反相色谱柱上会出现两个峰，因此分离氟比洛芬酯与杂质a的困难非常大。

为确保氟比洛芬酯注射液的质量控制，有必要提供一种分析方法能够分离检测氟比洛芬酯的两对对映异构体以及其相关物质。

专利申请cn201710127127.3公开了一种氟比洛芬酯注射液中有关物质的检测方法。此方法描述了在反相色谱柱上用梯度的方法分离氟比洛芬酯与其主要相关物质杂质的两对非对映异构体的方法。然而，该发明的色谱方法较为复杂，并且仅定量地报告了氟比洛芬酯的两对对映异构体的基线分离，而相关物质杂质a的两对对映异构体之间的分离以及它们与氟比洛芬酯的两对对映异构体之间的分离结果则没有详尽描述。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供一种氟比洛芬酯的对映异构体及其相关物质杂质a的色谱分离检测方法，本发明分离度良好，操作流程简易，色谱方法简单。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是，一种氟比洛芬酯对映异构体及杂质a的液相色谱分离检测方法，所述液相色谱分离检测方法具体为：

(1)将待测的氟比洛芬酯供试溶液、杂质a对照液稀释溶解，备用；

(2)将步骤(1)中包含杂质a的氟比洛芬酯供试溶液上样到十八烷基硅烷键合硅胶柱及五氟苯基硅烷键合硅胶串联柱上，对所述氟比洛芬酯进行分离检测；

(3)以甲醇和磷酸水溶液为流动相，进行等度洗脱；

(4)洗脱结束后，使用紫外检测器检测，记录色谱图，得到待测样品的信号强度，将得到的信号强度代入相应的标准曲线并引入校正因子，计算得到待测样品中氟比洛芬酯及其非对映异构体、杂质a及其非对映异构体四种组分的浓度。

优选的，步骤(1)中对氟比洛芬酯供试溶液、杂质a对照液的稀释溶解液为甲醇溶液。

优选的，步骤(2)中采用十八烷基硅烷键合硅胶柱及五氟苯基硅烷键合硅胶柱串联，所述2种不同硅胶柱的串联顺序没有要求。

优选的，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的型号为chromcorec185μm，五氟苯基硅烷键合硅胶柱的型号为chromcorepfp5μm，所述2种硅胶柱的填料粒径为5±0.5μm。

优选的，步骤(3)中所述流动相为体积比60～65∶35～40的甲醇/0.1％磷酸水溶液。

优选的，步骤(3)中所述流动相为体积比60∶40的甲醇/0.1％磷酸水溶液。

优选的，步骤(3)中所述流动相的流速为0.8-1.5ml/min。

优选的，所述色谱柱的柱温为20-40℃。

优选的，所述洗脱时色谱柱的柱温为30℃。

优选的，所述洗脱时的流速：线性流速范围为1.5-24.0cm/min。以4.6mm规格柱管内径换算，当流速为1ml/min时，线性流速为6.0cm/min。

优选的，所述洗脱时的进样量：5μl。

优选的，步骤(4)中紫外检测器的检测波长为240～260nm。

优选的，紫外检测器的检测波长为254nm。

采用紫外检测器进行检测，可选用的分析色谱柱柱长为10至300mm，柱内径为1.0至21.2mm。

检测中，分析色谱柱的柱长分别为100mm(c18)和50mm(pfp)，柱内径为4.6mm。

本发明的氟比洛芬酯对映异构体及杂质a的液相色谱分离检测方法，既可用于氟比洛芬酯各组分的定量检测，也可用于氟比洛芬酯的制备分离。

运用本方法进行分离检测，氟比洛芬酯的对映异构体与杂质a的对映异构体四种组分之间的分离度均＞1.6。

本发明方法的重现性和稳定性很好，受色谱柱填料的影响小，以不同批次、不同厂家的色谱柱都能较好地实现分离结果。

本发明采用两种色谱柱串联，再运用等度洗脱，在反相色谱中能够实现氟比洛芬酯的两对对映异构体以及杂质a的两对对映异构体的基线分离，分离度良好，分离结果稳定，方法再现性和稳定性上佳。此外，本发明采用等度洗脱，使色谱分离简单易操作，相比于梯度洗脱不仅在实验操作上更加简单，节省实验人力，同时也少用药剂试剂，大大降低成本。

附图说明

图1是氟比洛芬酯及其异构体与杂质a及其异构体的分子结构。

图2是实施例1的液相色谱图。

图3是实施例2柱温20℃的液相色谱图，其他色谱条件与实施例1相同。

图4是实施例2柱温40℃的液相色谱图，其他色谱条件与实施例1相同。

图5是实施例3流动相为65/35甲醇/0.1％磷酸水的色谱图，其他色谱条件与实施例1相同。

图6是对比例1单独采用五氟苯基硅烷键合硅胶柱的色谱图。

图7是对比例2单独采用十八烷基硅烷键合硅胶柱的色谱图。

图8是对比例3流动相为乙腈/磷酸溶液的液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

一种氟比洛芬酯对映异构体及杂质a的液相色谱分离方法，所述液相色谱分离方法的步骤如下：

(1)将待测的氟比洛芬酯供试溶液、杂质a对照液稀释溶解，备用；

(2)将步骤(1)中包含杂质a的氟比洛芬酯供试溶液上样到十八烷基硅烷键合硅胶柱及五氟苯基硅烷键合硅胶串联柱上，对所述氟比洛芬酯进行分离检测；

(3)以甲醇和磷酸水溶液为流动相，进行等度洗脱；

(4)洗脱结束后，使用紫外检测器检测，记录色谱图，得到待测样品的信号强度，将得到的信号强度代入相应的标准曲线并引入校正因子，计算得到待测样品中氟比洛芬酯及其非对映异构体、杂质a及其非对映异构体四种组分的浓度。

实施例1采用本发明方法分离检测氟比洛芬酯及其杂质a

1)将氟比洛芬酯料液稀释，作为供试品溶液；取杂质a料稀释，作为杂质a对照溶液；取所述供试品溶液与杂质a对照溶液混匀，作为系统适用性溶液；

2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以及五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的两种色谱柱；

3)以甲醇和磷酸水溶液为流动相，洗脱模式：等度洗脱。

色谱条件：

色谱柱：chromcorec185μm(4.6×100mm)和chromcorepfp5μm(4.6×50mm)串联使用

流动相：60/40甲醇/0.1％磷酸水v/v

柱温：30℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。仪器记录峰值数据见表1。

表1

结果表明，在本发明方法及所述色谱条件下，谱图基线平稳，氟比洛芬酯的非对映异构体与杂质a的非对映异构体一共四种组分之间的分离度均大于1.6，分离度良好。

实施例2采用实施例1相同的色谱柱，流动相，仅柱温不同，分别在20℃、40℃条件下分离检测氟比洛芬酯的对映异构体及杂质a的对应异构体。

色谱条件：

色谱柱：chromcorec185μm(4.6×100mm)和chromcorepfp5μm(4.6×50mm)串联使用

流动相：60/40甲醇/0.1％磷酸水v/v

柱温：20℃/40℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3、图4。其中，图3是柱温20℃的液相色谱图，其他色谱条件与实施例1相同。图4是柱温40℃的液相色谱图，其他色谱条件与实施例1相同。

结果表明，在上述色谱条件下，基线平稳，氟比洛芬酯的对映异构体分离度、杂质a的非对映异构体间的分离度均随着温度的降低而升高，本发明在20-40℃内均可实现四种物质的基线分离。综合分离度和分析时间等因素，本发明最优选在30℃柱温下进行色谱分离。

实施例3采用实施例1相同的色谱柱，柱温，流动相，仅变化流动相甲醇/磷酸水溶液的比例，分离检测氟比洛芬酯的对映异构体及杂质a的对应异构体

色谱条件：

色谱柱：chromcorec185μm(4.6×100mm)和chromcorepfp5μm(4.6×50mm)串联使用

流动相：65/35甲醇/0.1％磷酸水v/v

柱温：30℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5。

结果表明，在此色谱条件下(流动相为65/35甲醇/0.1％磷酸水，其他与实施例1相同)，氟比洛芬酯的非对映异构体与杂质a的非对映异构体一共四种组分之间的分离度较好，均大于1.6，只是稍逊于流动相为65/35甲醇/0.1％磷酸水的分离效果。

对比例1在相同温度及相同流动相下单独采用五氟苯基硅烷键合硅胶色谱柱对氟比洛芬酯及其相关杂质a进行分析

色谱条件：

色谱柱：chromcorepfp，5um(4.6*150)

流动相：60/40甲醇/0.1％磷酸水v/v

流速：1ml/min

进样量：5μl

柱温：30℃

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，分别量取供试溶液、杂质a对照溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6。

结果表明，在相同温度及相同流动相下单独采用五氟苯基硅烷键合硅胶色谱柱，氟比洛芬酯的非对映异构体之间的分离，以及杂质a的非对映异构体之间的分离效果良好，但氟比洛芬酯与杂质a之间分离效果不佳。

对比例2在相同温度相同流动相下单独采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱对氟比洛芬酯及其相关杂质a进行分析色谱条件：

色谱柱：chromcorec18，5um(4.6*150)

流动相：60/40甲醇/0.1％磷酸水v/v

流速：1ml/min

进样量：5μl

柱温：30℃

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，分别量取供试溶液、杂质a对照溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图7。

结果表明，在相同温度相同流动相下单独采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，氟比洛芬酯的非对映异构体之间的分离，以及杂质a的非对映异构体之间的分离效果良好，但氟比洛芬酯与杂质a之间分离效果不佳。

对比例3采用实施例1相同的色谱柱，柱温，流动相采用乙腈/磷酸水溶液，分离检测氟比洛芬酯的对映异构体及杂质a的对应异构体。

色谱条件：

色谱柱：chromcorec185μm(4.6×100mm)和chromcorepfp5μm(4.6×50mm)串联使用

流动相：60/40乙腈/0.1％磷酸水v/v

柱温：30℃

流速：1ml/min

进样量：5μl

检测波长：254nm

供试品溶液的制备：取氟比洛芬酯料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为供试溶液；取有关杂质a料液10μl，加甲醇20ml稀释，作为杂质a对照溶液；取供试品溶液1ml与杂质a对照溶液10μl，混匀，作为系统适用性溶液。

按照上述色谱条件，量取系统适用性溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图8。

结果表明，在以60/40乙腈/0.1％磷酸水为流动相的条件下，即使其他色谱条件均与实施例1相同，氟比洛芬酯的对映异构体分离度、杂质a的对映异构体的分离度不好，甲醇体系的分离效果明显优于乙腈体系。

氟比洛芬酯及其杂质a的分子结构非常相似，都有两个手性中心，各有两对对映异构体或一对非对映异构体，分离氟比洛芬酯与杂质a及其异构体的困难非常大。本发明将十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂以及五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的两种色谱柱串联使用，并配以合适的柱温和流动相，在反相色谱中能够实现氟比洛芬酯的对映异构体以及其有关物质(杂质a)的对映异构体的基线分离，分离度良好，方法结果稳定，重现性优良。此外，本发明采用等度洗脱，使色谱分离简单易操作，相比于梯度洗脱不仅在实验操作上更加简单，节省实验人力，同时也少用药剂试剂，大大降低成本。

除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。