一种盐酸伊立替康注射液中异构体的高效液相色谱检测方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱分析盐酸伊立替康注射液中异构体的方法。

背景技术：

盐酸伊立替康(irinotecanhydrochloride)其化学名称为l-(+)-n-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲氨基]苯甲三水合物，是半合成喜树碱衍生物，本品及其代谢产物sn-38为dna拓扑异构酶1抑制剂，对各种癌细胞如肺癌，结肠癌等具有强大的杀伤作用。该药物是由日本daiichiseiy-aku和yakulthonsha公司研制开发的，1994年在日本首次上市，现已在20多个国家上市。其结构式如式1所示：

盐酸伊立替康有1个手性中心，根据美国药典(usp)规定，盐酸伊立替康原料药(api)中其异构体含量需要控制在0.15％以下，而美国药典只收载了盐酸伊立替康原料药异构体的分析方法，并没有收载盐酸伊立替康注射液异构体的分析方法。由于近年来，注射液开发要求不断趋于严格，国内注射液药物研发中必须对异构体杂质进行检测和控制。当我们使用usp收载原料药方法用于盐酸伊立替康注射液异构体检测时，发现该方法基线异常波动且有一未知杂质峰位于异构体出峰位置，导致准确度和专属性较差，影响异构体检测。因此，usp原料药方法不适用于盐酸伊立替康注射液中异构体杂质的检测。

目前，尚无国家标准、其他国家药典及文献收载盐酸伊立替康注射液异构体的色谱分析方法，因此开发一种适用于盐酸伊立替康注射液异构体的色谱分析方法对盐酸伊立替康注射液质量控制具有重要意义。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术不足，本发明人通过研究，开发了一种盐酸伊立替康注射液异构体的高效液相色谱分析方法，通过使用特定的色谱柱及控制其他检测条件，能够消除基线波动及未知杂质的干扰，实现对盐酸伊立替康注射液异构体杂质的分离和测定。

一种盐酸伊立替康注射液异构体的检测方法，其特征在于，在高效液相色谱仪上通过等度洗脱的方法检测。

色谱柱为键合型手性色谱柱；流动相为甲醇、无水乙醇、正己烷、二乙胺组成的混合物；其中甲醇、无水乙醇、正己烷、二乙胺的体积比为99～101:99～101:18～22:0.2；紫外检测器的检测波长：370nm；流动相的流速为1.7ml/min～1.9ml/min；柱温为30℃～40℃；稀释液为磷酸与无水乙醇组成的混合物，其中无水乙醇和磷酸的体积比为1000:0.5～5。

优选地，所述的键合型手性色谱柱为ic手性色谱柱。

优选地，所述流动相的流速为1.8ml/min。

优选地，所述柱温为35℃。

更进一步优选地，所述的ic手性色谱柱的规格为5μm，4.6×250mm。

更进一步优选地，所述流动相甲醇、无水乙醇、正己烷、二乙胺的体积比为100:100:20:0.2。

更进一步优选地，所述稀释液由无水乙醇与磷酸组成，无水乙醇、磷酸的体积比为1000:0.5。

本发明人通过多次实验尝试，通过筛选不同填料的手性色谱柱、流动相组成以及比例、柱温、流速等检测条件，确定了一种可准确检测盐酸伊立替康注射液异构体含量的检测方法。发明人曾尝试使用odh、ic手性色谱柱等其他手性色谱柱，使用美国药典收载的原料药异构体的检测方法对供试品进行分析检测，结果显示采用二乙胺和乙醇的混合物做稀释液，正己烷、无水乙醇和二乙胺的混合物为流动相，使用odh色谱柱时，基线异常波动。更改稀释液后，该问题被解决。但后续发现有一未知杂质峰位于异构体出峰位置，导致异构体检测的准确度较差，更换色谱柱及流动相后能有效解决了该问题。最终使用ic手性色谱柱，以甲醇、无水乙醇、正己烷和二乙胺的混合物为流动相对供试品进行分析检测，能够实现对盐酸伊立替康注射液异构体杂质的分离和测定。

更进一步地，本发明所述的检测方法，可按以下步骤实现：

1)分别称取盐酸伊立替康对照品和伊立替康手性异构体对照品，用磷酸与无水乙醇体积比为1000:0.5组成的稀释液溶解并稀释制成每1ml含有盐酸伊立替康0.1mg和伊立替康手性异构体0.1mg的系统适用性溶液；

2)取待测样品用磷酸与无水乙醇体积比为1000:0.5组成的稀释液溶解并稀释制成，配制成每1ml中含盐酸伊立替康1.6mg的供试品溶液；

3)分别取步骤1)、步骤2)的溶液各25μl，分别注入高效液相色谱仪并进行测定，记录色谱图，完成盐酸伊立替康注射液中异构体的测定。

本发明有益的技术效果：

1.本发明采用的分析方法，能够有效地将盐酸伊立替康注射液中的盐酸伊立替康与其异构体进行分离，伊立替康异构体与主成分或其他已知杂质的分离度不小于1.5，方法专属性较好。不同浓度水平的异构体杂质回收率在88.5％～103.2％的范围内，准确度良好。

2.本发明采用的磷酸与无水乙醇的混合溶剂做稀释液，能有效解决原方法基线异常波动的问题。

3.本发明采用的ic手性色谱柱和甲醇、无水乙醇、正己烷与二乙胺的混合溶剂做流动相，能有效解决原方法异构体出峰位置有干扰的问题。

4.采用本发明所述的分析方法，能够简单、快速、准确地分离检测出盐酸伊立替康注射液中盐酸伊立替康及其异构体杂质，有效控制异构体含量，提高药品质量，减少潜在风险，广泛运用于生产中。

附图说明

图1为对比实施例1的hplc检测结果；

图2为实施例1空白溶液的hplc检测结果；

图3为实施例1系统适用性溶液的hplc检测结果；

图4为实施例2的hplc检测结果；

图5为实施例3的hplc检测结果；

具体实施方式

为使本领有的技术人员能够更好的理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均为市场上可购得的色谱纯级别试剂。

本发明使用的盐酸伊立替康注射是根据cn109908077a实施例1制备的。

本发明盐酸伊立替康三水合物对照品来源edqm，批号为1.0，含量为91.5％。伊立替康三水合物异构体对照品来源usp，批号为r02530，含量为94.0％(以盐酸伊立替康计)。

本发明乳酸来源无锡福祈制药有限公司，批号为cd171109c，含量为88.1％。山梨醇来源石家庄瑞雪制药有限公司，批号为17112401，含量为99.2％。

对比实施例1：按照usp收录的api异构体检测方法

检测条件：

仪器：waters2695，waters2489紫外检测器

色谱柱：odh(5μm，4.6×250mm)手性色谱柱

流动相：乙二胺：无水乙醇：正己烷＝0.2:50:50

流速：1.0ml/min

柱温：30℃

进样量：20μl

检测波长：370nm

实验步骤：

稀释液配制：0.4％二乙胺的无水乙醇溶液

供试品配制：取5ml盐酸伊立替康注射液(根据cn109908077a实施例1制备的)于100ml量瓶中，取上述配制的稀释液，稀释至刻度，摇匀，配制成供试品溶液。

精密量取供试品溶液20μl，按上述检测条件进行检测分析，连续进样3针，结果见图1。

图1中，在伊立替康主峰处出现基线异常波动，该现象将会严重影响方法的专属性和准确度，干扰异构体的测定。

对比实施例2：更换稀释液的usp方法

仪器：waters2695，waters2489紫外检测器

色谱柱：odh(5μm，4.6×250mm)手性色谱柱

流动相：乙二胺：无水乙醇：正己烷＝0.2:50:50

流速：1.0ml/min

柱温：30℃

进样量：20μl

检测波长：370nm

实验步骤：

稀释液配制：0.05％磷酸的无水乙醇溶液

供试品配制：取5ml不同放置条件(常温放置0天，白光放置5天、10天，白光加紫外放置11天，60℃放置5天、10天)的盐酸伊立替康注射液(根据cn109908077a实施例1制备的)于100ml量瓶中，取上述配制的稀释液，稀释至刻度，摇匀，配制成供试品溶液。

精密量取供试品溶液20μl，按上述检测条件进行检测分析，结果见表1。

异构体杂质为工艺杂质或潜在降解杂质，在光照和高温条件下不会增长。然而如表1中所示，在光照和高温情况下，采用本实施例的方法，异构体杂质含量明显增长。通过调查，发现有一未知杂质峰位于异构体出峰位置，该未知杂质结构如式2所示：

表1供试品溶液在不同条件放置后测得的异构体杂质含量

实施例1：

检测条件：

仪器：waters2695，waters2489紫外检测器

色谱柱：ic(5μm，4.6×250mm)手性色谱柱

流动相：甲醇-无水乙醇-正己烷-二乙胺(100:100:20:0.2)

流速：1.8ml/min

柱温：35℃

进样量：25μl

检测波长：370nm

实验步骤：

稀释液配制：0.05％磷酸的无水乙醇溶液

取盐酸伊立替康三水合物对照品约20mg于100ml量瓶中，取上述配制的稀释液，加至约2/3量瓶体积，超声使溶解，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为储备液-1。

取盐酸伊立替康三水合物异构体对照品约5.4mg于25ml量瓶中，加稀释液至约2/3量瓶体积，超声使溶解，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为储备液-2。取5ml储备液-1和5ml储备液-2，混匀，作为系统适应性溶液。

分别精密量取稀释液(作为空白溶剂)和系统适应性溶液(作为分离度溶液)各25μl，按上述检测条件进行检测分析，空白溶剂及系统适用性进样结果见图2，图3。

图3中各组分的出峰顺序依次为盐酸伊立替康三水合物异构体、盐酸伊立替康三水合物，出峰时间依次为20.725min、30.329min，二者间分离度均大于1.5，各色谱参数均符合要求。方法优化后，未知杂质峰不再干扰异构体杂质测定，稳定性试验中，异构体含量无明显增长。表明本方法能有效分离出盐酸伊立替康及其异构体，分离度高，专属性强。

实施例2：

取盐酸伊立替康三水合物对照品约20mg于100ml量瓶中，以0.05％磷酸的无水乙醇溶液为稀释液，加稀释液至约2/3量瓶体积，超声使溶解，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。取4.0ml供试品储备液至250ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取供试品溶液25μl，按实施例1的检测条件进行检测分析，见图4。

图4显示供试品中未检出异构体。

实施例3：

取盐酸伊立替康注射液(根据cn109908077a实施例1制备的)2ml于100ml量瓶中，以0.05％磷酸的无水乙醇溶液为稀释液，稀释至刻度，摇匀，配制成供试品溶液。

精密量取实施例3配制供试品溶液25μl，按实施例1的检测条件进行检测分析，见图5。

图5显示本发明所属的分析方法能有效、准确地分离出盐酸伊立替康注射中盐酸伊立替康及其异构体，方法优化后，未知杂质峰不再干扰异构体杂质测定，稳定性试验中，异构体含量无明显增长。本品的光学纯度达到了质量要求，表明本法适用于盐酸伊立替康注射液异构体杂质的检测。

实施例4：

精密称取盐酸伊立替康三水合物异构体对照品5.098mg至50ml量瓶中，加稀释液至约2/3量瓶体积，超声使溶解，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为准确度储备液。

精密移取20ml准确度储备液至100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为准确度中间储备液。

分别称取山梨醇4.5035g、乳酸0.0903g至100ml量瓶，加纯化水至约2/3量瓶体积，超声溶解，再用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。

取盐酸伊立替康注射液(根据cn109908077a实施例1制备的)混匀，按照表2，分别精密移取注射液和准确度中间储备液，移取空白辅料溶液至相应的量瓶中，加入稀释液至约2/3量瓶体积，混匀，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，平行配制份，作为准确度溶液。

表2准确度溶液的配制

精密量取表2中溶液25μl，按上述检测条件进行检测分析，结果见表3。

表3准确度验证结果

表3显示0.05％准确度溶液1的回收率为86.8％～90.6％(70％～130％)，0.20％准确度溶液2的回收率为97.4％～100.7％(80％～120％)，0.40％准确度溶液3的回收率为100.4％～103.2％(90％～110％)，均符合括号内的规定范围。表明本发明所属的分析方法能有效、准确地分离出盐酸伊立替康注射中盐酸伊立替康及其异构体，本法适用于盐酸伊立替康注射液异构体杂质的检测。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和发明本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进检测条件实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。