一种快速测定酸性溶液中L-胱氨酸含量的电化学检测方法与流程

本发明属于电化学检测
技术领域：
，特别涉及一种快速测定酸性溶液中l-胱氨酸含量的电化学检测方法。
背景技术：
：l-胱氨酸(l-cystine)是指胱氨酸的左旋体，是一种常见的含硫氨基酸，相对分子质量240.3，分子式为c6h12n2o4s2。l-胱氨酸(胱氨酸的l-形式)是通过两个半胱氨酸通过硫二聚形成的共价二聚非必需氨基酸。在蛋白质中有少量存在，多含于头发、指爪等的角蛋白中。许多食物中都含有l-胱氨酸，包括鸡蛋、肉、奶制品、全谷类食品以及皮肤和毛发中。l-胱氨酸无臭，无味，呈白色六角形板状晶体或结晶粉末。溶于稀酸和碱性溶液，极微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、苯和氯仿。l-胱氨酸属于低毒性物质，但加热可分解为有毒气体，如硫的氧化物等。在医药领域，l-胱氨酸作为氨基酸类药物，可促进氧化还原能力，增加白血球，改善上皮细胞代谢，减少氧化应激，中和毒素，防止病原发育等作用。人体内缺乏胱氨酸会造成脱发症状。胱氨酸在人发中含量达17.6％，是毛发形成、生长十分关键的物质。l-胱氨酸是创伤愈合和上皮组织形成所需的氨基酸。它能刺激造血系统，促进白细胞和红细胞的形成。它也可以作为肠内肠外营养的组成部分。也可用于治疗皮炎和保护肝功能。此外，胱氨酸还是一种营养增补剂，使奶粉更加接近母乳；胱氨酸还可以作为化妆品的添加剂。目前，l-胱氨酸主要用来制备l-半胱氨酸。工业上常利用毛发在酸性水溶液中水解来制取l-胱氨酸，然后经电解还原得到l-半胱氨酸。电化学还原法生产l-半胱氨酸具有产品质量好、成本低、易分离、污染小等优点，是目前制备l-半胱氨酸的主要方法。ph值对该物质在水溶液中溶解度影响较大，一般而言强酸强碱条件下，l-胱氨酸溶解度较大，例如，2mol/l的盐酸溶液中其溶解度可达0.77mol/l。其他条件下l-胱氨酸溶解度较低，例如，室温下，在中性水溶液中，l-胱氨酸的溶解度为0.46mol/l。因此，在水介质中，由l-胱氨酸电合成l-半胱氨酸仅限于强酸或强碱溶液。然而，在碱性电解质中，两种氨基酸都分解成多种产物，半胱氨酸被空气或氧气迅速氧化成胱氨酸。若采用盐酸为支持电解质，溶剂蒸发可得l-半胱氨酸盐酸盐，该产品性质稳定，用途广泛，在氨电解质中电解二硫化物也可以直接生成l-半胱氨酸，溶剂蒸发即可得l-半胱氨酸游离碱化合物。与l-半胱氨酸盐酸盐不同，其游离碱化合物在长期储存期间容易分解。因此，电还原l-胱氨酸合成l-半胱氨酸通常是在强酸溶液中进行的。生产过程中及时、快速、准确的获取l-胱氨酸，l-半胱氨酸含量，对了解反应进程具有至关重要的作用。常用的氨基酸检测方法有高效液相色谱法(hplc)、高效液相色谱-质谱联用法(hplc-ms)、气相色谱-质谱联用法(gc-ms)、毛细管电泳法和荧光探针检测法等。针对l-胱氨酸和l-半胱氨酸浓度检测的报道主要采用的方法是柱前衍生液相色谱法。然而，这些方法存在成本高，耗时长，样品制备操作过程复杂，仪器的维护保养繁杂等缺点，难以用于l-半胱氨酸生产过程的现场和大批量的检测。因此，建立一种低成本、简便快捷的l-胱氨酸检测方法是十分必要的。电化学方法是仪器分析方法的重要组成部分之一，是一种简单且价廉的常规分析检测方法。电化学方法是根据溶液中物质的电化学性质及变化规律，以电位、电导、电流和电量等电化学量与被测物质浓度之间的计量关系为基础，对待测物进行定性和定量的仪器分析方法。电化学检测通常具有以下优点：电化学检测器与光谱检测器相比便宜，电化学装置(包括电极)可以容易地最小化以开发具有简单程序的便携式传感器，并且能量需求低，可以用于实验室或现场测量。电化学对物质的定性定量的分析在食品、药品、工业生产已被广泛的开发应用。循环伏安法(cyclicvoltammetry)是电化学测试中最常用的一项技术，信号发生器给出线性变化的“电位-时间”信号，电位信号扫描到某一值再反向扫描至初始电位，通过恒电位仪施加在研究电极上，记录响应电流与电位的变化关系的曲线。利用电化学响应信号与待测物浓度具有一一对应关系，实现对待测物的定量检测。通过采用循环伏安法检测所述工作电极上的电化学还原峰电流获得电化学响应信号，可以建立峰电流与待测物浓度一一对应关系，并对物质浓度进行定量测量。循环伏安法测定l-胱氨酸有如下优点：设备简单、操作简便、成本低廉、试剂和样品用量少，灵敏度高和选择性好，并且可以实现连续快速检测。目前国内外对于胱氨酸检测方法的探讨依然很少，探寻一种更加简单、快速和灵敏测定酸性溶液中l-胱氨酸的电化学方法显得极为重要。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种快速、简便、准确的定量检测胱氨酸的电化学检测方法。可直接用于电化学还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸过程电解液中l-胱氨酸的浓度检测，而不需要进行样品前处理，解决了现有技术中存在的操作步骤复杂、检测时间长、检测成本高等问题。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种快速测定酸性溶液中l-胱氨酸含量的电化学检测方法，包括如下步骤：以银电极或银修饰电极作为工作电极，铂电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，构成三电极体系，将三电极体系置于含l-胱氨酸的酸性溶液中后，与电化学工作站连接，采用循环伏安法或差分脉冲伏安法，测定酸性溶液中l-胱氨酸的峰位电流值。作为优选，所述银修饰电极为玻炭载银电极，铜载银电极或钛载银电极。作为优选，采用循环伏安法或差分脉冲伏安法，分别测定含有不同标准l-胱氨酸浓度的酸性水溶液的还原峰位电流值，建立峰位电流值与l-胱氨酸浓度的标准曲线和线性回归方程。一种快速测定酸性溶液中l-胱氨酸含量的电化学检测方法，具体操作步骤如下：步骤1、含l-胱氨酸的酸性溶液的配制过程：空白对照溶液：在水加入质量分数为36％～38％浓盐酸，制备成含盐酸浓度介于0.1～2mol/l的酸性水溶液；标准溶液：取25ml上述空白对照溶液，向其中加入物质的量为0.005mmol～0.5mmol的标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.1mmol/l～10mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；步骤2、绘制标准曲线并建立线性回归方程：分别将不同浓度的l-胱氨酸标准溶液注入电解槽，将工作电极，对电极，参比电极插入电解槽，电极区域浸没于溶液液面下方。将工作电极，对电极，参比电极与电化学工作站连接。采用电化学工作站测定不同浓度的l-胱氨酸标准溶液的循环伏安曲线，得到关于l-胱氨酸浓度和循环伏安曲线峰电流的标准曲线和线性回归方程，其中，循环伏安法的参数设置如下：扫描速度为20mv/s～200mv/s，电位扫描范围介于0.5v～-1.5v；步骤3：待测样品检测：直接取待测样品，经滤布过滤后，将所得待测样品加入电解槽，将工作电极，对电极，参比电极插入电解槽，电极区域浸没于溶液液面下方。将工作电极，对电极，参比电极与电化学工作站连接。采用电化学工作站测定待测溶液的循环伏安曲线，可根据l-胱氨酸还原峰电流数值，结合步骤1所得线性回归方程确定待测样品中l-胱氨酸的浓度。其中，循环伏安法的参数设置如下：扫描速度为20mv/s～200mv/s，电位扫描范围介于0.5v～-1.5v；作为优选，所述银电极的预处理步骤为：步骤a、选取银电极，并将银电极用氧化铝粉末抛光至镜面，步骤b、然后采用砂纸对步骤a中抛光的银电极进行物理打磨，步骤c、将步骤b中打磨过的银电极用去离子水超声清洗1min，得到工作电极。所述步骤a中，选取的银电极面积为1～20mm2，银电极依次采用粒径为0.1μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光至镜面；所述步骤b中，依次采用800目和2000目的砂纸对抛光的银电极进行物理打磨；所述步骤c中，超声清洗的时间为1min。所述酸性溶液中盐酸浓度范围为1.0×10-3mol/l～2mol/l，所述酸性溶液中胱氨酸浓度范围为1.0×10-6mol/l～1.5mol/l。作为优选，所述电化学工作站的参数设置为：高电位0.1v，低电位-0.7v，扫描速率为100mv/s。作为优选，三电极体系装载于三电极测试装置内，所述三电极测试装置包括用于容纳电解液的电解槽本体和用于通氮气除去氧气的支管，即在电解槽本体的侧壁上设有第一支管和第二支管，第一支管与电解槽本体内部连通，并深入电解槽底部，用于通入氮气，第二支管与电解槽本体内部连通，并始终处于液面上方，用于除去氧气。电解槽上部采用磨口设计，以保证测试体系的密封性和稳定性。更具体地，所述电化学工作站是由计算机控制的电化学分析仪，可以从市场购得，例如上海辰华仪器有限公司的chi760e电化学工作站。优选地，电化学检测在室温下进行。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明提供了一种快速测定l-胱氨酸含量的电化学检测方法，通过使用银电极采用电化学检测方法对l-胱氨酸进行定量测定。相比常用的柱前衍生液相色谱法，电化学检测方法最大的优点在于仪器造价低、操作方便、检测速度快、灵敏度高，并且基本不排放废液。2、本发明所述的电化学检测方法中所用的电极为银电极，面积约为1～20mm2，制作成本低廉，制作过程简单、快速，可实现批量生产。银电极的前处理只需抛光，打磨，无需负责的负载，烘干等程序，无需对电极进行修饰便可对l-胱氨酸进行简便、准确的定量，避免了修饰电极的冗长过程和时间精力损耗。3、本发明提供了一种测定酸性溶液中l-胱氨酸含量的检测方法。在工业生产中，所接触到的l-胱氨酸溶液多为酸性的，如在酸性溶液中从毛发中提取l-胱氨酸；酸性溶液中电解还原l-胱氨酸制备半胱氨酸等。常规的l-胱氨酸含量测试手段无法在酸性条件下实现，需要取样后对样品进行前处理，如加入碱调节溶液的酸碱度以降低酸性，本发明可以在盐酸溶液中快速测量l-胱氨酸含量，无需进行样品前处理。4、本发明检测周期短，适用于现场快速检测，在现场测试时，制备好的电极与电化学工作站连接，另一端置于反应池内，电化学工作站与笔记本电脑连接，待测样品加入后，启动电化学工作站，通过笔记本电脑对参数进行设置，测试结果可直接读取，数据直观可见，测试过程在1min左右即可完成，电化学工作站体积小，配合笔记本电脑使用，设备便于携带。附图说明图1为三电极测试装置的结构示意图；图2为实施例2中l-胱氨酸在银电极上的循环伏安曲线；图3为实施例3中根据峰电流及标准溶液的浓度绘制l-胱氨酸浓度-电流标准曲线及线性回归方程。具体实施方式下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。本发明的快速测定酸性溶液中l-胱氨酸含量的电化学检测方法，但本发明的保护范围不局限于这些实施例中。本发明电化学工作站仅以chi760e为例，其购自于上海辰华仪器有限公司。l-胱氨酸和标准品购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。本发明的电化学方法检测原理为：因含有s-s键氨基酸可在电极表面被还原断裂，进而发生氢化反应生成两分子巯基化合物，利用循环伏安法记录电化学反应过程中的e-i曲线，其还原峰电流与l-胱氨酸浓度在一定范围内呈线性关系。据此，可实现l-胱氨酸的定量分析。被检测物质含有连二硫键，被还原生成两分子含有巯基的物质，如图1所示，三电极测试装置包括用于容纳电解液的电解槽本体和用于通氮气除去氧气的支管，即在电解槽本体的侧壁上设有第一支管和第二支管，第一支管与电解槽本体内部连通，并深入电解槽底部，用于通入氮气，第二支管与电解槽本体内部连通，并始终处于液面上方，用于除去氧气。电解槽上部采用磨口设计，以保证测试体系的密封性和稳定性。实施例1本发明所述银电极的预处理，本发明所述银电极需要进行抛光，打磨，清洗等前处理过程，具体包括如下步骤：1、选取直径为2mm的银圆盘电极，将电极用0.1μm氧化铝粉末抛光。2、将抛光后的电极用800目的砂纸物理打磨。3、打磨过的银电极用丙酮和去离子水分别超声清洗1min，得到预处理的银电极。4、电极浸入乙醇溶液备用。实施例2酸性溶液中l-胱氨酸的电化学检测方法。空白对照溶液：在水加入浓盐酸(质量分数37％)，制备成含盐酸浓度介于0.5mol/l的酸性水溶液；标准溶液：取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.3mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为6.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；将浓度为6.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液注入电解槽，将工作电极，对电极，参比电极插入电解槽·，电极区域浸没于溶液液面下方。将工作电极，对电极，参比电极与电化学工作站连接。采用电化学工作站测定l-胱氨酸标准溶液的循环伏安曲线。循环伏安法的参数设置如下：扫描速度为100mv/s，电位扫描范围介于-0.1v至-0.7v；测得l-胱氨酸标准溶液在-0.538v处有个还原峰(参见图2)。由此表明银电极可以识别l-胱氨酸。实施例3酸液中电还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸过程中样品l-胱氨酸浓度的测定。1.溶液配制空白对照溶液：在水加入浓盐酸(质量分数37％)，制备成含盐酸浓度介于0.5mol/l的酸性水溶液；标准溶液：取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.005mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.1mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.01mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.2mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.02mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.4mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.03mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.6mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.04mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为0.8mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.05mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为1.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.1mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为2.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.2mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为4.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.3mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为6.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.4mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为8.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；取25ml上述空白对照溶液，向其中加入0.5mmol标准品l-胱氨酸，超声振荡溶解，用上述空白对照液定容至50ml，制得浓度为10.0mmol/l的l-胱氨酸标准溶液；2.绘制标准曲线并建立线性回归方程将银电极、铂电极和ag/agcl参比电极插入到l-胱氨酸标准溶液中，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.1v～-0.7v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈，分别检测上述11个不同浓度l-胱氨酸标准溶液，得各浓度l-胱氨酸标准溶液在-0.538v处的还原峰电流数值(参见表1)，根据峰电流数值及标准溶液的浓度绘制l-胱氨酸浓度-电流标准曲线(参见图3)，得到线性回归方程为y＝-2.2616-10.6432x，并计算相关系数r2＝0.9993。表1l-胱氨酸标准溶液的电化学检测结果浓度(mmol/l)电流(ua)0.1-3.780.2-4.270.4-7.1090.6-8.950.8-10.911-13.362-23.034-446-64.398-86.8710-110.53.电还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸样品中l-胱氨酸含量的电化学检测检测溶液配制：取25ml上述空白对照溶液，向其中加入1ml含有l-胱氨酸的样品液，超声振荡，用上述空白对照液定容至50ml，制得检测溶液。；将银电极、铂电极和ag/agcl参比电极插入到该检测溶液中，然后将电极连接到电化学工作站上，常温下采用循环伏安法进行检测，设置电位扫描范围为-0.1v～-0.7v，扫描速度为0.1v/s，循环圈数为1圈，测得-0.538v处的还原峰电流数值为0.0214ma，带入l-胱氨酸标准曲线方程计算得该检测液中l-胱氨酸的浓度c＝1.7982mmol/l，该样品液中l-胱氨酸原料药中l-胱氨酸的浓度为89.9100mmol/l；该样品液中l-胱氨酸原料药中l-胱氨酸的含量为21.6053g/l。实施例4电还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸反应进程的监测。组装带隔膜板框式电解槽：以dsa电极(以钛为基体，涂层含钌、铱等贵金属元素)为阳极，以铅电极为阴极，电极面积为15cm2，两电极间的极间距为5mm，隔膜为nafion117型阳离子交换膜。配置电解液：阴极电解液为l-胱氨酸(浓度为1.0mol/l)、hcl溶液(浓度为1.0mol/l)的混合液，体积为100ml，阳极电解液为hcl溶液(浓度为1.0mol/l)。控制电解温度为室温，采用稳压直流电源(型号为吉时利2231a-30-3)在电解槽中进行电解实验，控制电流密度为50ma·cm-2，电解时间为8h。电解过程中每小时按照实施例3中方法，将银电极，铂电极，以及银/氯化银电极组成的三电极体系测试电解液中l-胱氨酸含量以检测反应进程。监测结果如表2所示。实验结果表明，采用本发明的方法能够很好的在线监测电化学还原l-胱氨酸制备l-半胱氨酸反应进程。表2银电极对电还原l-胱氨酸反应进程的监测电解时间(小时)l-胱氨酸含量(mol/l)01.01110.87120.73430.59940.46650.33360.21270.07580.000实施例5银电极上电化学检测l-胱氨酸实验的稳定性。为了验证所制备电极的重现性与稳定性，用相同方法处理3支银电极，并对相同浓度的l-胱氨酸进行测定，相对标准偏差为2.9％；用同一支电极对0.6mmol/l的l-胱氨酸平行测定3次，相对标准偏差为2.3％；电极重复使用50次后对l-胱氨酸的电流响应仍能保持到初始响应的93％。可见，该电极具有良好的重现性和稳定性。实施例6银电极上电化学检测l-胱氨酸加标回收实验。为验证测定结果的可靠性，采用标准加入法对本发明的检测方法的准确度进行考察，将所制备的银电极按照实施例1中的方法前处理后用于强酸溶液中电解l-胱氨酸合成l-半胱氨酸中的l-胱氨酸测定，实验分三个加标水平分别为0.20mmol/l、1.00mmol/l、6.00mmol/l，每个水平的样品进行了3次测定，根据测定量和加标量计算各添加水平的加标回收率和相对标准偏差。实验结果见表3。可见，样品中l-胱氨酸的测定结果的rsd值均在5.0％以内，加标回收率则在97.0％～105.0％之间，说明本方法测定结果是准确可靠的。表3银电极对电还原l-胱氨酸样品中l-胱氨酸的测定结果(n＝3)添加量(mmol/l)检测值(mmol/l)rsd(％)回收率(％)0.200.214.1105.01.000.973.697.06.006.162.8102.6以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3