一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物的制作方法

本发明属于生物医药及生物分离相关的技术领域，涉及一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物。

背景技术：

外泌体是细胞多泡内体与质膜融合时释放产生的具有生物活性的微小囊泡，其直径约为30～150nm，是细胞间通讯的重要介质之一；在人健康的生理情况下，外泌体可以在细胞之间运送dna、蛋白质、mrna、mirna等多种生物活性物质，参与细胞通讯、细胞迁移、肿瘤细胞增长等多种过程，完成细胞间物质及信息的传递。文献研究发现，几乎所有类型的细胞均会分泌外泌体，并且在血液、唾液、尿液、脑脊液、积液和乳汁等体液中都能够提取到外泌体。

外泌体与肿瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等很多疾病相关，当机体发生病变时，细胞分泌的外泌体的成分、含量、性质等都可能发生改变；糖基化外泌体在包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展过程中均有着重要作用，外泌体的检测研究能有效监测疾病的发生、发展；由于外泌体在样本中含量比较低，外泌体的分离富集对外泌体的研究至关重要。

目前，外泌体的分离方法很多，主要有：超速离心法或梯度密度离心法，免疫磁珠法等。其中：超速离心法或梯度密度离心法是基于外泌体与其他生物组份密度的微小差异进行分离，该方法需要特殊设备，样品需求量比较大，耗时长，且因为不同临床样本的特点不同，采用该方法的分离效果稳定性差，进一步地超速离心还容易造成囊泡损伤从而影响后续实验；免疫磁珠法的原理是外泌体表面的特异性蛋白如：cd9/cd63/cd81等与包被有对应抗体的免疫磁珠相结合，进行磁分离，但由于免疫磁珠体积较小，粒径为纳米级别且小于等于外泌体的直径，因此免疫磁珠与外泌体结合的空间位阻较大，外泌体结合不充分，分离效率不高。此外，采用免疫磁珠法分离获得的外泌体因为洗脱时使用酸性洗脱液进行洗脱，导致外泌体形态不完整。

因此，一种能用于精准、高效分离富集样本中的糖基化外泌体的组合物、分离装置及分离方法的研究建立是必须的。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，本发明还提供了一种含有该凝集素-大分子载体偶联复合物的糖基化外泌体分离组合物，以及使用该凝集素-大分子载体偶联复合物进行糖基化外泌体分离的方法及应用。本发明提供的凝集素-大分子载体偶联复合物可以精准分离临床样本中的糖基化外泌体，分离效率高，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌体液体检测，或直接进行免疫学相关检测，或直接提取外泌体内相关核酸进行基因检测分析。本发明提供的糖基化外泌体分离的方法中，利用外泌体外表面丰富的糖链可以和凝集素结合的原理，采用有效地离心清洗及有效地洗脱方法可以分离糖基化外泌体，并且非常简便、快速，重复性好，分离后的外泌体形态完整，无破裂或碎裂，将其应用于疾病的发生、发展等过程中检测、监控及诊断。

本发明提供了一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素；其中：

所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素、蜗牛凝集素(haa和/或hpa)中的任意一种或者两种及以上；

所述大分子载体包括：葡聚糖微球、琼脂糖微球、树脂或环氧树脂微球、聚苯乙烯微球中的任意一种或者两种及以上。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述大分子载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物中，每1ml大分子载体上偶联有1-20mg，优选为5-15mg，进一步优选为10-15mg凝集素。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述临床样本包括:血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液的任意一种。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素中的任意一种或者两种及以上。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述糖基化外泌体包括：n-糖基化外泌体、o-糖基化外泌体、岩藻糖基化外泌体中的任意一种或两种及以上。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存在保存液中，所获得的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的凝集素-大分子载体偶联复合物的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％；凝集素-大分子载体偶联复合物保存液的体积是指凝集素-大分子偶联复合物分散在保存液中后，其与保存液的总体积。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液分装于包括亲和吸附离心管的分离装置中；所述亲和吸附离心管包括：上部离心管和外部保护套管两部分；所述上部离心管的直径小于外部保护套管的直径，所述上部离心管套设于外部保护套管内且在其上部外侧存在凸起的环形边缘或支柱用于支撑上部离心管的开口处高于外部保护套管；所述上部离心管包括离心管盖、离心管壁和与离心管壁固定连接的过滤膜底部，过滤膜底部所使用的过滤膜的孔径小于凝集素-大分子载体偶联复合物的粒径，同时大于外泌体的粒径，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液保存于上部离心，组成糖基化外泌体的分离装置，过滤膜孔径优选为150nm-1000nm。

上述凝集素-大分子载体偶联复合物在某些实施方式中，分装于上部离心管中的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的凝集素-大分子载体偶联复合物体积占上部离心管体积的1/2-1/4。

本发明另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离组合物，所述糖基化外泌体分离组合物包括：上述凝集素-大分子载体偶联复合物，还包括用于清洗去除分离过程中非特异性结合的、未发生糖基化的外泌体及其他杂质的清洗液和/或用于洗脱特异性结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体的洗脱液。这里的组合物并非是指其混合为一体，而是指其同时存在于一个套装中。

上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述清洗液为无金属盐离子清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子清洗缓冲液，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。

上述糖基化外泌体分离组合物在某些实施方式中，所述洗脱液为溶解有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露糖的硼酸盐缓冲液，进一步可选地ph值为6.5±0.2，用于洗脱结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。

本发明另一方面还提供了一种糖基化外泌体分离方法，包括应用上述的凝集素-大分子载体偶联复合物分离糖基化外泌体的分离步骤，所述分离步骤包括：

临床样本前处理：

取前处理后的样本，可选地与清洗液混合均匀进行稀释，作为待检测样本；

完全去除凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存液部分，保留凝集素-大分子载体偶联复合物；

取待检测样本加入到除去保存液后的凝集素-大分子载体偶联复合物中，室温静置孵育，去除样本；

取清洗液清洗已结合有糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物，去除清洗液，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质；

取洗脱液，洗脱清洗后的凝集素-大分子载体偶联复合物，室温静置，收集洗脱上清液，即为分离后的糖基化外泌体溶液。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，待检测样本与凝集素-大分子载体偶联复合物的比例为1：1-3；

和/或，单次加入清洗液的体积与已结合有糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物体积的比例为1-3：1；

和/或，清洗液清洗步骤重复进行1-3次；

和/或，加入洗脱液的体积与清洗后的凝集素-大分子载体偶联复合物体积的比例为0.5-2：1，优选为0.5-1：1。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，完全去除凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存液部分、去除样本、去除清洗液、和/或，收集洗脱上清液的方式为3000rpm以下的速度、室温下离心20秒。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，室温静置孵育10-30min，优选为10-15min。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，样本前处理的方法包括以下步骤：

对血清、血浆、唾液、脑脊液或淋巴液样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min，去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，取离心后上清液备用；

对组织或细胞培养上清液、尿液的样本，将样本经3000g以下速度离心10-15min，去除样本中的细胞碎片、沉淀物杂质，然后将上清液通过超滤管进行10-1000倍浓缩后备用。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，所述清洗液为无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子的清洗缓冲液，进一步可选为ph值7.6±0.2的无金属盐离子的清洗缓冲液。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，所述洗脱液为溶有糖的硼酸盐缓冲液，可选地为溶有甘露醇的硼酸盐缓冲液，进一步可选地为ph值6.5±0.2的硼酸盐-甘露糖缓冲液。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，孵育的条件为：室温孵育1-30min，优选为5-20min，进一步优选为10-15min。

上述糖基化外泌体分离方法在某些实施方式中，包括应用上述凝集素-大分子载体偶联复合物分离糖基化外泌体和分离装置的分离步骤，所述分离步骤包括：

临床样本前处理：

取前处理后的样本，可选地与清洗液混合均匀进行稀释，作为待检测样本；

装载有凝集素-大分子载体偶联复合物的亲和吸附离心管完全去除凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存液部分，保留凝集素-大分子载体偶联复合物，并更换新的外部套管；

取待检测样本加入到除去保存液后的上部离心管中，室温静置孵育，去除样本；

取清洗液加入上部离心管中，将亲和吸附离心管离心后将上部离心管取出，装入新的外部套管中，将原外部套管及其中液体全部弃去，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质；本步骤进行1-3次；

取洗脱液，加入上部离心管，洗脱清洗后的凝集素-大分子载体偶联复合物，室温静置，收集外部套管中的洗脱上清液，即为分离后的糖基化外泌体溶液，洗脱分离后糖基化外泌体形态完整，无破损或裂解。

本发明还提供了一种使用上述方法分离的外泌体的应用，所述应用包括：糖基化外泌体液体检测、外泌体免疫学检测，或外泌体中核酸提取后的核苷酸片段检测分析。

有益效果：

1、本发明凝集素-大分子载体偶联复合物，分离得到的外泌体均为糖基化外泌体，其形态完整，无破损，可直接用于糖基化外泌体液体检测，外泌体免疫学检测，或核酸提取后的核苷酸序列检测分析等，还可以进一步通过配合相应的设备实现糖基化外泌体的全自动分离。

2、本发明凝集素-大分子载体偶联复合物中，所使用的大分子载体的粒径为一般用于免疫检测领域的大分子载体粒径的10-1000倍，单个大分子载体上具有更大表面积，减小了凝集素与大分子载体偶联时的空间位阻，利于偶联更多的凝集素，相比之下，同样总体积的一般大分子载体虽然具有更大的比表面积，但由于空间位阻较大，偶联上的凝集素反而更少，本发明的凝集素-大分子载体偶联复合物中，每1ml大分子载体上可以偶联1-20mg凝集素，而研究发现使用体积较小的大分子载体时，每1ml大分子载体偶联凝集素的数量为ng级别，偶联效率低；同时该粒径也远远大于外泌体本身的直径，可以减少凝集素和糖基化外泌体结合的空间位阻，有利于凝集素与糖基化外泌体结合，大幅提高外泌体的分离效率。

3、本发明凝集素-大分子载体偶联复合物，对于外泌体含量较少的临床样本，如尿液、组织或细胞培养上清液中的外泌体也有很好的效果；对于外泌体含量较多的临床样本，如血浆中的外泌体进行分离，分离所得糖基化外泌体的浓度可达10^11-14个/ml。

4、本发明凝集素-大分子载体偶联复合物中，所采用的凝集素优选植物凝集素，包括：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素，植物凝集素的大量获取更容易，原料更加丰富。

5、本发明凝集素-大分子载体偶联复合物，出厂时即可分装于特定结构的亲和吸附离心管中组成糖基化外泌体的分离装置，既方便用户使用，又利于凝集素-大分子载体偶联复合物的保存，过滤膜孔径的选择利于各种保存液、清洗液、洗脱液的顺利通过，尤其是洗脱液中添加有甘露糖，会导致洗脱液的粘度增大，该孔径下能保证洗脱液的顺利通过，也能保证凝集素-大分子载体偶联复合物无漏出。

6、本发明糖基化外泌体分离组合物，所使用的是无金属盐离子的清洗缓冲液或纯化水，金属盐离子对凝集素与糖基化外泌体的亲和吸附具有解离作用，影响凝集素与糖基化外泌体的亲和吸附，且金属盐离子浓度越高，解离作用越强，从而影响外泌体的分离效果，甚至无法分离外泌体。

7、本发明糖基化外泌体分离组合物，所使用的洗脱液是硼酸盐缓冲液，相比其他缓冲液，具有针对外泌体的更好的洗脱效果，洗脱效率高，使用少量的洗脱液即可完成洗脱，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解，同时由于使用量较少，相当于同时完成了浓缩外泌体的过程。

8、本发明糖基化外泌体分离方法，样品前处理的方法简单易行，通过简单的离心和/或浓缩，即可有效获得适用于本发明的样本，无需超高速离心处理样本，可以最大程度地保护样本中的糖基化外泌体。

附图说明

图1：凝集素-大分子载体偶联复合物的亲和吸附离心管示意图。

图2：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)类型分离糖基化外泌体电镜观察图片。

图3：血浆样本分离后糖基化外泌体的nta分析图。

图4：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测结果图。

图5：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测结果图。

图6：4种不同样本(细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液)外泌体calnexin抗体的westernblot检测结果图。

图7：5种不同清洗缓冲液对结合有糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物进行清洗后，再对其进行洗脱所得洗脱液的进行外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测结果图。

图8：3种不同洗脱液分离得到的糖基化外泌体溶液的电镜检测结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明，现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。

实施案例1凝集素-大分子载体偶联复合物制备

凝集素-大分子载体偶联复合物包括：大分子载体；和偶联在大分子载体外侧的凝集素，其是通过凝集素和大分子载体在特定条件下偶联制备而成，主要用于分离样本中的糖基化外泌体，分离后得到的糖基化外泌体形态完整。其中：

凝集素选用主要包括：木菠萝凝集素(jacalin)、花生凝集素(pna)、豌豆凝集素(vva和/或vvl)、刀豆凝集素(cona)、小扁豆凝集素(lca)、麦胚素(wga)、大豆凝集素(sba)、芸豆凝集素(pvl)、蜗牛凝集素(haa和/或hpa)中的任意一种，或者两种及两种以上凝集素联合使用，主要原因为：不同凝集素之间的组合可以实现各种类型糖基化外泌体的分离，如：lca、aal对岩藻糖基化外泌体的分离；cona、pvl、sba、wga、aal等凝集素对n-糖基化外泌体的分离；haa、hpa、vva、pna、jacalin等凝集素对o-糖基化外泌体的分离；单一凝集素主要用于分离与凝集素对应的特定糖基化外泌体，两种及两种以上凝集素联合使用可以用于分离多种不同形态的糖基化外泌体，或者两种或两种以上凝集素联合使用可以针对特定糖基化外泌体进行协同增效地分离。

为更进一步说明本发明，以下实施案例主要采用小扁豆凝集素(lca)(购自于美国sigma公司)对本发明进行更进一步说明。

大分子载体主要是指大分子微球，主要包括：葡聚糖微球、琼脂糖微球、树脂或环氧树脂微球、聚苯乙烯微球中的任意一种，或者两种及以上的大分子载体联合使用，所述大分子载体粒径分布范围为1μm-200μm，优选为10μm-200μm，更进一步优选为30μm-150μm。在大分子载体的生产中，同一批次生产的大分子载体的粒径也不是均一的，因此大分子载体的粒径描述通常既可以采用平均粒径的方式，也可以采用本发明中粒径分布范围的方式，对于采用粒径分布范围的方式的描述可以认为其具体分布符合或基本符合在此分布范围内的正态分布。本发明实施例凝集素-大分子载体偶联复合物中，所使用的大分子载体的粒径为一般用于免疫检测领域的大分子载体粒径的10-1000倍，单个大分子载体上具有更大表面积，减小了凝集素与大分子载体偶联时的空间位阻，利于偶联更多的凝集素，相比之下，同样总体积的一般大分子载体虽然具有更大的比表面积，但由于空间位阻较大，偶联上的凝集素反而更少，本发明的凝集素-大分子载体偶联复合物中，每1ml大分子载体上可以偶联1-20mg凝集素，而研究发现使用体积较小的大分子载体时，每1ml大分子载体偶联凝集素的数量为ng级别，偶联效率低；同时该粒径也远远大于外泌体本身的直径，可以减少凝集素和糖基化外泌体结合的空间位阻，有利于凝集素与糖基化外泌体结合，大幅提高外泌体的分离效率。

上述凝集素与大分子载体偶联结合，形成凝集素-大分子载体偶联复合物，不同大分子载体通过调节浸泡、偶联、清洗、保存等步骤后，均能达到与凝集素偶联结合的效果，当然针对不同凝集素的最适大分子载体可能是不同的；在凝集素-大分子载体偶联复合物制备过程中大分子载体(ml)与凝集素(mg)的比例为1:1-1:20，优选为1:5-1:15，进一步优选为1:10-1:15。

制备后的凝集素-大分子载体偶联复合物于保存液中进行保存，凝集素-大分子载体偶联复合物在所得凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存浓度(体积比)为10％-60％，优选比例为30％-50％，进一步优选为40％-50％；凝集素-大分子载体偶联复合物保存液分装于亲和吸附离心管的上部离心管中；所述亲和吸附离心管包括：上部离心管和外部保护套管两部分；所述上部离心管的直径小于外部保护套管的直径，所述上部离心管套设于外部保护套管内且在上部外侧存在凸起的环形边缘或支柱用于支撑上部离心管的开口处高于外部保护套管；所述上部离心管包括离心管盖、离心管壁和与离心管壁固定连接的过滤膜底部，过滤膜底部所使用的过滤膜的孔径小于凝集素-大分子载体偶联复合物的粒径，同时大于外泌体的粒径，过滤膜孔径优选为150nm-1000nm，用于装载凝集素-大分子载体偶联复合物，组成糖基化外泌体的分离装置。

为更进一步说明本发明，以下实施案例均采用粒径分布范围30μm-150μm的琼脂糖微球进行说明，上述琼脂糖微球为商品化的溴化氢活化琼脂糖微球(购自pharmacia公司或sigma公司)，所述琼脂糖微球进一步优选为：琼脂糖4b(sephrose4b)、琼脂糖6b(sephrose6b)、琼脂糖ff(sephroseff)、琼脂糖cl-4b(sephrosecl-4b)、琼脂糖cl-6b(sephrosecl-6b)，以下实施案例均以琼脂糖4b(sephrose4b)微球为例进行说明。

凝集素-大分子载体偶联复合物，即lca-琼脂糖微球偶联复合物的制备过程详情如下：

(1)称取活化琼脂糖4b1g，加入ph2-3的1mmhcl溶液不少于200ml，混匀浸泡直至完全溶胀，用ph2-3的1mmhcl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min，清洗结束后，收集完全溶胀的琼脂糖4b备用，完全溶胀的琼脂糖4b约3-5ml。

(2)取0.1-1.0m的碳酸盐缓冲液溶液15ml，加入小扁豆凝集素，然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4b，其中完全溶胀的琼脂糖4b体积(ml)与小扁豆凝集素(lca，mg)的比例为1:1-1:20(即每1ml完全溶胀的琼脂糖4b与1-20mg小扁豆凝集素混合)，室温混匀反应时间0.5h-5h，去上清；为更好的说明本发明，本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1m，完全溶胀的琼脂糖4b体积(ml)与小扁豆凝集素(lca，mg)的比例为1:10，即15ml碳酸盐缓冲液溶液加入5ml完全溶胀的琼脂糖4b和50mglca，室温混匀反应时间3h。

(3)加入100ml0.1m碳酸盐缓冲液，混匀去上清；然后加入200ml纯化水，混匀去上清。

(4)用不少于完全溶胀的琼脂糖4b体积10倍体积的0.1mol/lph4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/l的nacl)和0.1mol/lph8.0的tris-hcl缓冲液(含0.5mol/l的nacl)依次反复洗涤至少3次。

(5)加入0.1mol/lph8.0的tris-hcl缓冲液洗涤一次，收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4b，加入tris-hcl缓冲液，配置成10％-60％的lca-琼脂糖微球保存液备用，优选配置成30％-50％的lca-琼脂糖微球保存液，为更好的说明本发明，在本实施案例中均配置成体积比为50％的lca-琼脂糖微球保存液。

(6)将步骤(5)中的50％的lca-琼脂糖微球保存液混匀后，均匀分装于包括亲和吸附离心管的分离装置中，组成糖基化外泌体的分离装置，静置密封，2-8℃保存备用；其中亲和吸附离心管包括：上部离心管和外部保护套管两部分；所述上部离心管直径小于外部套管，且在上部存在凸起的环形边缘或支柱用于支撑上部离心管的开口处高于外部套管；所述上部离心管包括离心管盖、离心管壁和与离心管壁固定连接的过滤膜底部，所述过滤膜底部所使用的过滤膜的孔径小于凝集素-大分子载体偶联复合物的粒径，同时大于外泌体的粒径，所述凝集素-大分子载体偶联复合物保存液保存于上部离心管中，可选地，过滤膜孔径优选为150nm-1000nm。亲和吸附离心管的上部离心管的尺寸可以根据具体离心设备的尺寸进行设计，凝集素-大分子载体偶联复合物体积占上部离心管体积的1/2-1/4，如选择1.5-2ml体积的上部离心管，在管中分装含有0.5ml凝集素-大分子载体偶联复合物的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液，亲和吸附离心管示意图详见图1。凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存液可以通过过滤膜进入外部保护套管中并留存于外部保护套管中不会流失。又由于上部离心管和外部保护套管的套设结构以及凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的体积浓度选择，使得凝集素-大分子载体偶联复合物能够与足够的保存液接触，不会干燥失去活性。

实施案例2糖基化外泌体分离组合物制备

本发明提供了一种糖基化外泌体分离组合物，具体包括：实施案例1中所得的分装有lca-琼脂糖微球保存液的亲和吸附离心管、即糖基化外泌体的分离装置，和清洗液、洗脱液，分别独立包装，同时存在于一个套装或试剂盒中。

上述清洗液为无金属盐离子清洗缓冲液或纯化水，可选为无金属盐离子清洗缓冲液；如：主要成分包括10-200mm无金属盐离子的tris-hcl缓冲液，其ph值为7.6±0.2。在本实施案例中，清洗液为无金属盐离子清洗缓冲液，主要成分包括100mm无金属盐离子的tris-hcl缓冲液，其ph值为7.6±0.2，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质。

上述洗脱液为溶解有糖的硼酸盐缓冲液，如：主要成分包括10-20mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的100-500mm的甘露糖、ph值6.5±0.2。在本实施案例中，溶解有糖的硼酸盐缓冲液为主要成分包括15mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的300mm的甘露糖，其ph值6.5±0.2，用于洗脱结合在凝集素-大分子载体偶联复合物上的糖基化外泌体，洗脱后的外泌体外观形态完整，无破损或裂解。

实施案例3糖基化外泌体分离组合物的使用方法

本发明还提供了一种糖基化外泌体分离方法，包括使用上述糖基化外泌体分离组合物的实验步骤，包括：

1、实验前准备

自备器材或设备：离心机，用于分离糖基化外泌体过程中的离心步骤；或使用本集团公司及旗下子公司的全自动琼脂糖微球分离仪器，主要用于糖基化外泌体全自动分离，达到节约人力的目的。全自动琼脂糖微球分离糖基化外泌体只是对手工方式的自动化实现，并能达到等同或优于手工分离的功能，本实施案例采用离心机手工分离进行进一步说明。

2、试验流程

(1)样本前处理：根据不同临床样本的特性调整样本前处理的方法。

对所述血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本而言，将样本经3000g离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物等杂质，将离心后上清液备用；为了更清楚地说明，在本实施案例中离心10min；

对所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本而言，将样本经3000g离心10-15min以去除样本中的细胞碎片、沉淀物等杂质，然后将上清液通过超滤管进行10-1000倍浓缩，将浓缩后的上清液备用；为了更清楚地说明，在本实施案例中离心10min。

(2)取步骤(1)中的200-300ul经过前处理的样本，既可以不用清洗液稀释直接与凝集素-大分子载体偶联复合物混合，也可以与1-2倍体积清洗液混合均匀进行稀释后再与凝集素-大分子载体偶联复合物混合，稀释后的效果更好；在本实施案例中，亲和吸附离心管的上部离心管体积为2.0ml，其中分装有1ml/管的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液(内含0.5ml/管凝集素-大分子载体偶联复合物)，经过前处理的样本选择体积为200ul，清洗液体积为300ul，混匀稀释后体积与亲和吸附离心管中的凝集素-大分子载体偶联复合物体积相同，经过清洗液稀释的样本的体积不能显著大于亲和吸附离心管中的凝集素-大分子载体偶联复合物的体积，二者体积基本相等时的结合效果最好。

(3)取出装载有凝集素-大分子载体偶联复合物的亲和吸附离心管的上部离心管，装入新的外部套管中，3000rpm室温下离心20秒，去除凝集素-大分子载体偶联复合物保存液中的保存液部分，保留凝集素-大分子载体偶联复合物，并更换新的外部套管。

(4)取步骤(2)中已经稀释好的样本500ul加入上部离心管中，室温静置孵育10-30min，优选为10-15min，之后将亲和吸附离心管于3000rpm室温下离心20秒去除样本；在本实施案例中，孵育时间选择为10min。

(5)取500ul-1500ul、ph值7.6±0.2的无金属盐离子清洗液100mmtris-hcl缓冲液加入上部离心管中，将亲和吸附离心管于3000转室温下离心20秒，将上部离心管取出，装入新的外部套管中，将原外部套管及其中液体全部弃去，用于清洗去除分离过程中非特异性结合的未发生糖基化的外泌体及其他杂质；重复步骤(5)1-3次。在本实施案例中，无盐离子清洗液体积为1ml。

(6)取与亲和吸附离心管中的凝集素-大分子载体偶联复合物体积相同的、ph值6.5±0.2的硼酸盐-甘露糖缓冲液作为洗脱液加入上部离心管，其中洗脱液中包括15mm的硼酸盐缓冲液和溶于其中的300mm的甘露糖，洗脱清洗后的凝集素-大分子载体偶联复合物，室温静置5-10min，3000rpm室温下离心20秒；收集外部套管中的洗脱上清液，即为分离后的糖基化外泌体溶液，洗脱分离后糖基化外泌体形态完整，无破损或裂解。在本实施案例中，洗脱液体积为500ul，加入上部离心管，盖上离心管盖，室温静置5min，3000rpm室温下离心20秒；收集外部套管中的洗脱上清液，即为分离后的糖基化外泌体溶液，直接用于检测或于-80±5℃保存备用。

实施案例4

本实施案例主要对糖基化外泌体的分离样本作进一步说明，可用于本发明的待分离样本主要为：血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液的任意一种；针对常规1.5-2ml上部离心管，可以分装有1ml/管的凝集素-大分子载体偶联复合物保存液(内含有0.1-0.6ml/管的凝集素-大分子载体偶联复合物，如0.5ml)，针对600ul的凝集素-大分子载体偶联复合物，则加入所述血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液、组织或细胞培养上清液、尿液的经过前处理的样本体积50-600ul，优选为100-300ul，进一步优选为200-300ul，该样本可直接加入也可清洗液稀释后再加入。在样本前处理过程中，血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本只经过离心，样本离心前后体积基本无变化，因此对50-600ul，优选为100-300ul，进一步优选为200-300ul的样本进行前处理即可获得所需体积的经过前处理的样本；而所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本在样本前处理过程中，除了离心步骤之外，还需要进行10-1000倍浓缩，所以为了获得足够的经过前处理的样本，需要对1-50ml，优选为10-50ml，进一步优选为30-50ml的所述组织或细胞培养上清液、尿液的样本进行包括离心和浓缩的前处理才能获得所需体积50-600ul，优选为100-300ul，进一步优选为200-300ul的经过前处理的样本。

不同的样本分离体积对分离效果略有影响，但基本均能达到糖基化外泌体的分离效果，为更进一步说明本发明，在本实施案例中，依据实施案例3的分离步骤，血清、血浆、唾液、脑脊液、淋巴液样本均选择200ul经过前处理的样本进行说明；组织或细胞培养上清液、尿液的样本体积均选择体积为50ml，浓缩后体积优选为200ul的经过前处理的样本进行说明。

依据血清、血浆、唾液、组织或细胞培养上清液、尿液、脑脊液、淋巴液等待分离样本的样本特异性，分别选取细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液等4种样本类型做进一步说明，将其他样本类型替换后，也能达到相同的分离效果。

依据实施案例3的步骤，分别分离本实施案例中200ul的经过前处理的细胞培养上清、血浆、尿液、脑脊液样本中的糖基化外泌体，分别得到4种不同样本来源的糖基化外泌体分离溶液备用。

实施案例5

本实施案例主要对实施案例4中分离得到的糖基化外泌体进行透射电镜检测，用于观察糖基化外泌体的形态及粒径大小，主要步骤为：

吸取约5ul实施案例4中分离得到的糖基化外泌体样本，滴在铜网上，静置4-5min，用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液(0.5％的醋酸铀水溶液，ph4.5)，在铜网上反应1min，用滤纸吸干，重复清洗2次，晾干后，进行tecnaispirit(120kvtem)透射电镜观测。透射电镜观察实施案例4中的四种不同样本分离的糖基化外泌体，外泌体形态完整、无破损，粒径均在30-150nm之间，详见图2中4种不同样本类型分离糖基化外泌体电镜观察图片。

实施案例6：

本实施案例主要对实施案例4中分离得到的糖基化外泌体使用nanosightns300系统对外泌体粒度和粒径进行纳米颗粒跟踪分析(nta)，nta分析主要是在溶液状态(原位测试)下的测试，其高精度的粒度数量分布测试，可以分辨出相对粒径差异在1：1.5倍左右的颗粒，能够让外泌体颗粒在更接近其原始状态下进行测量，保证了测量数据的真实性和有效性，提供可靠的外泌体浓度数据，有效弥补目前电镜直接观察和测量外泌体时，由于一次所能观察到的范围有限，所获得的粒径分布数据往往不具代表性的缺陷，并能有效降低电镜观察的干燥、固定以及冷冻等不同方式的前处理带来的外泌体损伤。

基于实施案例5中电镜观察4种不同样本类型结果的一致性，在本实施案例中选取血浆样本分离的糖基化外泌体进行nta检测，详细步骤为：将约10ul样本稀释到1ml，采用nanosight注射泵上样，nanosightns300系统自动分析，糖基化外泌体较为均一，平均粒径均在30-150nm之间，符合外泌体的平均粒径范围，粒度均在10¹¹-10¹⁴个/ml；详见图3：血浆样本分离后糖基化外泌体的nta分析图；

实施案例7

本实施案例主要对实施案例4分离得到的糖基化外泌体进行外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81、外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101、外泌体calnexin抗体westernblot检测和鉴定，主要检测步骤如下：

(1)样本准备：取30ul糖基化外泌体洗脱液，加入等体积5×sds-page上样缓冲液，100℃处理10分钟，备用；

(2)sds电泳：配置凝胶(15％分离胶、5％浓缩胶)，加入1×电泳缓冲液，加样本10μl/孔，设置60v，120min的电泳条件；

(3)转膜：将合适大小pvdf膜，放置到转移缓冲液，浸泡10min，将凝胶与pvdf膜以及海绵垫紧密贴合，防止出现气泡，用半干转膜仪将蛋白转至pvdf膜上(恒压40v，恒流200ma，转膜20分钟)

(4)封闭：5％脱脂奶粉封闭液封闭1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；

(5)孵育：分别加入一抗(anti-cd9、anti-cd81、anti-cd63、anti-tsg101、anti-alix、anti-calnexin单抗，浓度1mg/ml，1:400稀释)孵育1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；加入二抗(羊抗鼠hrp1mg/ml，1:5000稀释)孵育1小时，tbst清洗3次，每次5分钟；

(6)显示：使用beyoeclmoon(极超敏ecl化学发光试剂盒)显色后进行检测，

实施案例4分离得到的4种糖基化外泌体的westernblot检测结果分别为：

(1)外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测均为阳性，说明具有外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81；详见图4：外泌体特异性膜蛋白cd9、cd63、cd81抗体westernblot检测结果图；

(2)外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测均为阳性，说明具有外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101；详见图5：外泌体特异性非膜蛋白alix和tsg101抗体的westernblot检测结果图；

(3)外泌体样本中calnexin抗体的westernblot检测均为阴性。详见图6：外泌体calnexin抗体的westernblot检测结果图。calnexin存在于细胞内质网上，不存在于外泌体中，本实施例分离样本得到糖基化外泌体的calnexin抗体的westernblot检测均为阴性，说明分离后的糖基化外泌体样本中没有细胞碎片存在。

实施案例8

本实施案例主要是针对不同清洗液，尤其是包含金属盐离子的常见清洗液、不包含金属盐离子的常见清洗液、和纯化水对糖基化外泌体分离过程中的清洗效果及分离效果做进一步对比验证，以确定本发明中所选择清洗液的适宜性。

将实施案例2和3中的糖基化外泌体分离组合物中的无金属盐离子缓冲液清洗液(tris-hcl)替换为纯化水、以及常见的含金属盐离子的清洗液。常见的含金属盐离子的清洗液包括：磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)、tris-triton-nacl缓冲液、tbst缓冲液，由于常见含金属盐离子的清洗液大都含有表面活性剂，如tween-20、tritonx-100等，表面活性剂会对外泌体囊泡的外膜造成破坏，因此，在配置常见的含金属盐离子的清洗液时均不含表面活性剂成分。

在本实施案例中常见的含金属盐离子的清洗液选择为磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)、无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液、无tween-20的tbst缓冲液。

上述pbs缓冲液的组成成分为：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.24g/l，磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.44g/l，氯化钠(nacl)：8g/l，氯化钾(kcl)：0.2g/l，ph值为7.4±0.2。

上述无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液组成成分为：50mmtris-hcl、0.6mnacl，ph值为7.6±0.2。

上述无tween-20的tbst缓冲液组成成分为：10mmtris-hcl、0.15mnacl、ph值为7.6±0.2。

本实施案例中的5种清洗缓冲液分别为纯化水、tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、无tritonx-100的tris-triton-nacl缓冲液、无tween-20的tbst缓冲液，按照上述顺序依次标记为1号清洗液、2号清洗液、3号清洗液、4号清洗液、5号清洗液。按照实施案例3中的方法应用本实施案例中的5种清洗液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体，进行对比验证分析，除清洗液不同，其他组成及步骤均相同，其他详细过程参考实施案例1-4、以及实施案例7中的外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测和鉴定步骤。

本实施案例中5种不同清洗缓冲液清洗后，再洗脱分离得到的糖基化外泌体溶液的外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81抗体的westernblot检测结果详见图7。

本实施案例结果显示，不含金属盐离子缓冲液(1号清洗液和2号清洗液)对结合有糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物进行清洗后，再对其进行洗脱所得洗脱液的westernblot检测结果显示：外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81显示均为阳性，提示均能有效分离得到糖基化外泌体；而无表面活性剂的常见含有金属盐离子的常见清洗缓冲液(3号、4号、5号清洗液)对结合有糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物进行清洗后，再对其进行洗脱所得洗脱液的westernblot检测结果显示：外泌体特异性膜蛋白cd9/cd63/cd81显示均为阴性，说明溶液中金属盐离子的存在影响糖基化外泌体的分离效果，其对本发明中的糖基化外泌体具有明显的解离作用。

实施案例9

本实施案例主要针对不同的常见蛋白质洗脱液和本发明的硼酸盐-甘露糖缓冲液对糖基化外泌体的分离效果做进一步对比验证，以确定本发明中所选择洗脱液的适宜性。

将实施案例2和3中的糖基化外泌体分离组合物中的硼酸盐-甘露糖缓冲液替换为常用的蛋白质洗脱液和糖蛋白洗脱液，具体为蛋白质抗体洗脱缓冲液strippingbuffer和糖蛋白洗脱液glycoproteinelutingsolution(美国vectorlabs公司)。

上述strippingbuffer组成成分为：62.5mmol/ltris·hcl、2％sds、100mmol/lβ-2-巯基乙醇，ph6.8±0.2。

应用本实施案例中的3种洗脱液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体，进行对比验证分析，除洗脱液不同，其他组成及步骤均相同，详细过程参考实施案例1-5，观察3种洗脱液分别分离血浆样本中的糖基化外泌体在电镜下的外泌体形态及完整性。

本实施案例中3种不同洗脱液分离得到的糖基化外泌体溶液的外泌体电镜检测结果详见图8。

本实施案例结果显示，本发明的洗脱液能有效分离样本中的糖基化外泌体，且外泌体形态完整、无破损，粒径均在30-150nm之间；strippingbuffer作为洗脱液未观察到外泌体，可能为strippingbuffer做为洗脱液在洗脱的过程中对外泌体的外膜造成破坏，无法得到完整的外泌体；而糖蛋白洗脱液glycoproteinelutingsolution观察不到典型的外泌体囊泡，仅能观察到疑似外泌体囊泡，但外泌体形态不完整，说明在分离过程中对外泌体造成一定的破坏，不利于后续的检测分析。

综上所述，应用本发明的内容对不同样本来源的糖基化外泌体的分离，均能达到同样的效果，且分离得到的外泌体均为糖基化外泌体，分离纯化后外泌体形态完整，无破损，可直接用于糖基化外泌体液体检测，外泌体免疫学检测，或核酸提取后基因检测分析等；还可以进一步通过后续纯化步骤获得纯度更高的外泌体。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。