一种铂纳米粒子/氮点纳米酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及模拟酶催化技术领域，具体涉及一种铂纳米粒子/氮点纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术：

纳米酶是一类具有天然酶活性的模拟酶，相比天然酶，纳米酶具有催化活性高、稳定性好、环境耐受性强以及制备简便和成本低等优点。纳米酶已成为分析化学及生命相关分析领域的一大研究热点。各种不同性质、结构的纳米酶特别是过氧化物模拟酶已被广泛应用于生化分析、肿瘤诊断与治疗和环境检测等领域。10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(amplexred)是一种过氧化物酶底物，可被不可逆地氧化为具有强烈红色荧光的试卤灵，该反应速率可以通过吸收光谱或者荧光光谱在分子级别的层面上检测到。近年来amplexred被广泛使用，这是因为在许多的氧化底物中，amplexred是过氧化氢生成最稳定和灵敏的信号报告者。尽管已有不少具有过氧化物模拟酶活性的纳米材料被合成，但是以amplexred为酶底物的相关报道尚不多见。此外，已报道的以amplexred为酶底物的纳米酶多存在合成过程复杂、催化活性低等缺点，因此进一步设计和制备具有更加优异性能的模拟酶材料具有重要意义。

糖尿病是一种世界范围的、以高血糖为特征的代谢性疾病，全球有数亿人深受其扰。体液中葡萄糖浓度的变化可为糖尿病的预防和检测提供重要信息，同时监测生理血糖水平是确认有效治疗的关键，因此开发有效可靠的葡萄糖传感器一直备受关注。尽管已有不少酶葡萄糖传感器被报道，但是这些传感器存在一些缺点，包括酶难固定、易失活、灵敏度低以及样品用量大等。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对天然酶活性和稳定性差、环境不耐受的缺点与不足，提供一种铂纳米粒子/氮点纳米酶及其制备方法和应用，所述铂纳米粒子/氮点纳米酶制备简单、催化活性高、底物选择性宽，可以结合微流控平台用于葡萄糖检测，具有灵敏度高、样品用量少、线性范围宽以及选择性好的优点。

本发明采取的技术方案为：一种铂纳米粒子/氮点纳米酶，其具有过氧化物模拟酶活性。

所述铂纳米粒子/氮点纳米酶的制备方法包括以下步骤：

(1)以2-叠氮咪唑作为前驱体、氨水作为溶剂来合成氮点，得到氮点溶液；

(2)在步骤(1)制得的氮点溶液中加入六水合氯铂酸和硼氢化钠，超声反应后制得到铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液。

与现有铂纳米酶制备技术相比，本发明以表面含有丰富的羟基、氨基及羰基等官能团的氮点代替传统的聚乙烯吡咯烷酮、聚4-苯乙烯磺酸钠等稳定剂，室温下通过超声法制备铂纳米粒子，合成过程简单、条件温和，制得的铂纳米粒子/氮点纳米酶表面基团丰富，催化活性高。

本发明还提供一种铂纳米粒子/氮点纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以2-叠氮咪唑作为前驱体、氨水作为溶剂来合成氮点，得到氮点溶液；

(2)在步骤(1)制得的氮点溶液中加入六水合氯铂酸和硼氢化钠溶液，进行超声反应，反应后离心，收集上清液，即得到铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液。

具体地，步骤(2)使用的氮点溶液中，氮点的浓度为1.3～33微克/毫升。

具体地，超声时间为10～180分钟，超声功率为144～356瓦。

本发明还提供上述铂纳米粒子/氮点纳米酶作为过氧化物模拟酶的应用。

本发明还提供上述铂纳米粒子/氮点纳米酶在葡萄糖检测中的应用。

进一步地，所述应用采用微流控芯片进行检测。

具体地，所述应用包括如下步骤：

s1.预处理：配制一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液；

s2.标准曲线的绘制：分别取步骤s1得到的不同浓度葡萄糖标准溶液，往其中加入铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液、葡萄糖氧化酶和酶底物混合均匀后，加入微流控芯片的微通道一端的样品池中，再将待测样品引入该微通道中进行反应，然后检测所产生的报告分子信号强度，再绘制报告分子信号强度-葡萄糖含量标准曲线；

s3.样品浓度的测定：取待测样品，重复步骤s2的检测过程和检测条件，得到待测样品报告分子信号强度，对照步骤s2得到的报告分子信号强度-葡萄糖含量标准曲线，得到待测样品中葡萄糖的含量。

微流控平台上实现的葡萄糖检测可以克服传统葡萄糖传感器的一些限制，并在基于葡萄糖分析的现场即时诊断工具开发方面显示了巨大的潜力。而所述铂纳米粒子/氮点纳米酶能够克服自然酶易失活、储存条件要求高以及价格昂贵等缺点，因此将铂纳米粒子/氮点纳米酶与微流控平台结合能够获得灵敏度高、操作简单、样品需求量少的新型葡萄糖分析方法。

与现有传统方法相比，本发明建立的葡萄糖检测方法结合了铂纳米粒子/氮点纳米酶催化活性强、环境耐受性好和微流控芯片微型化、便携化、耗样量少的优势，适用于多种复杂样品中的葡萄糖检测。

具体地，所述酶底物为10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及邻苯二胺中的任意一种。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明的铂纳米粒子/氮点纳米酶的合成示意图；

图2为本发明采用的微流控芯片的构造图；

图3为实施例1中铂纳米粒子/氮点纳米酶的透射电镜图；

图4为实施例1中铂纳米粒子/氮点纳米酶的x射线光电子能谱全谱图；

图5为实施例1中铂纳米粒子/氮点纳米酶和铂纳米粒子的电子顺磁共振波谱图；

图6为实施例2中铂纳米粒子/氮点纳米酶和铂纳米粒子分别催化过氧化氢与amplexred反应，生成的试卤灵的荧光光谱图；

图7为实施例2中考察ph值对铂纳米粒子/氮点纳米酶催化活性影响的实验结果图；

图8为实施例3中铂纳米粒子/氮点纳米酶结合微流控芯片用于葡萄糖检测得到的荧光强度随葡萄糖浓度变化趋势图以及对应的标准曲线。

附图标记说明：

1、微流控芯片；11、微通道；111、样品池；112、出样口；113、检测区。

具体实施方式

请参阅图1，其为本发明所述铂纳米粒子/氮点纳米酶的合成路线图。

本发明在超声波辅助的条件下，使六水合氯铂酸(h2ptcl6·6h2o)、硼氢化钠(nabh4)与表面带有丰富含氧氮基团的氮点(nds)相互作用，形成具有酶催化活性的铂纳米粒子/氮点复合物(ptnps/nds)，即铂纳米粒子/氮点纳米酶。

具体地，该铂纳米粒子/氮点复合物具有过氧化物模拟酶活性，酶底物可以是10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(amplexred)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)和邻苯二胺(opd)等等。

该铂纳米粒子/氮点复合物的制备方法包括以下步骤：

(1)以2-叠氮咪唑作为前驱体、氨水作为溶剂来合成氮点，得到氮点溶液；

(2)在步骤(1)制得的氮点溶液中加入六水合氯铂酸和硼氢化钠溶液，进行超声反应，反应后离心，收集上清液，即得到铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液。

具体地，步骤(2)中，使用的氮点溶液中氮点的浓度为1.3～33μg/ml；超声时间为10～180min，超声功率为144～356w。

所述铂纳米粒子/氮点纳米酶可以作为过氧化物模拟酶的应用，例如是在葡萄糖检测中的应用，优选地，可以将amplexred作为酶底物，用于葡萄糖的高灵敏荧光检测，而且可以进一步结合微流控芯片进行检测。

具体请参阅图2，图2为本发明采用的微流控芯片1的构造图，所述微流控芯片1具有至少一条微通道11，所述微通道11的一端设有用于加入反应物的样品池111，另一端设有出样口112，其中间部分为检测区113。

优选地，所述微流控芯片1具有10条平行排列且上下对齐的微通道11，可以用于10个样品的同时测定。从图2所示方向来看，每条微通道11在微流控芯片1上呈“一”字型设置。

具体地，所述微通道11的宽度为50～400μm，长度为10～50mm，深度为10～100μm。优选地，所述微通道11的宽度为200μm，长度为20mm，深度为40μm。

所述样品池111的直径为1～5mm，出样口112的直径为0.6～1.8mm。优选地，样品池111的直径为2mm，出样口112的直径为1mm。为了方便检测使用，所述10条微通道11的样品池111和出样口112上下交替分布，如图2所示。

具体地，所述微流控芯片1的材料为聚二甲基硅氧烷，还可以为玻璃、环烯烃共聚物(coc)或聚甲基丙烯酸甲酯等。

所述铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液用于葡萄糖检测，包括如下步骤：

s1.预处理：配制一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液；

s2.标准曲线的绘制：分别取步骤s1得到的不同浓度葡萄糖标准溶液，往其中加入铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液、葡萄糖氧化酶和酶底物混合均匀后，加入微流控芯片1的微通道11一端的样品池111中，再将待测样品引入该微通道11中进行反应，然后检测所产生的报告分子信号强度，再绘制报告分子信号强度-葡萄糖含量标准曲线；

s3.样品浓度的测定：取待测样品，重复步骤s2的检测过程和检测条件，得到待测样品报告分子信号强度，对照步骤s2得到的报告分子信号强度-葡萄糖含量标准曲线，得到待测样品中葡萄糖的含量。

所述酶底物选自10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及邻苯二胺中的任意一种。

下面再通过几个实施例来具体说明所述铂纳米粒子/氮点纳米酶的制备、表征、催化活性和应用。

实施例1：铂纳米粒子/氮点纳米酶的制备与表征

铂纳米粒子/氮点纳米酶的制备方法，具体步骤如下：

以2-叠氮咪唑作为前驱体、氨水作为溶剂来合成氮点，得到氮点溶液，将氮点溶液利用超纯水稀释至20μg/ml备用。利用新制王水(浓盐酸和浓硝酸体积比3:1)将50ml圆底烧瓶浸泡12h，之后先用自来水将圆底烧瓶冲洗干净，再用超纯水清洗两次后烘干。将8ml20μg/ml氮点溶液以及17.5ml超纯水加入上述圆底烧瓶中，随后，加入2ml7.9mmol/l六水合氯铂酸，超声10min，再将2.5ml0.1mol/l硼氢化钠溶液逐滴加入上述混合溶液中，继续超声2h，得到铂纳米粒子/氮点粗产物。粗产物在5000rpm的转速下离心10min，收集上清液，即可得到暗橙色的铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液。整个合成过程中超声频率为25khz，超声功率为288w。

采用透射电镜对制得的铂纳米粒子/氮点纳米酶进行表征，其透射电镜图如图3所示，从该图可知上述合成方法制备得到的铂纳米粒子/氮点纳米酶具有很好的分散性和接近球形的形状，其粒径则分布在15-30nm的范围内。

采用x射线光电子能谱对铂纳米粒子/氮点纳米酶进行表征，其x射线光电子能谱全谱图如图4所示，70.31ev、284.79ev、399.94ev以及532.5ev处的峰分别归属于pt4f、c1s、n1s以及o1s谱，说明上述合成方法制备得到的铂纳米粒子/氮点纳米酶表面富含铂、碳、氮和氧元素，进一步证明铂纳米粒子/氮点纳米复合材料合成成功。

采用电子顺磁共振波谱仪验证在铂纳米粒子/氮点纳米酶和铂纳米粒子催化体系中有无羟基自由基产生，得到的电子顺磁共振波谱如图5所示，在铂纳米粒子/氮点纳米酶催化体系中检测到很强的羟基自由基信号(对应图5中的曲线a)，而在铂纳米粒子催化体系中并没有检测到很强的羟基自由基信号(对应图5中的曲线b)，说明氮点的引入显著改善了铂纳米材料的催化性能。

实施例2：铂纳米粒子/氮点纳米酶的催化活性验证

以amplexred为酶底物验证铂纳米粒子/氮点纳米酶的过氧化物模拟酶活性，步骤如下：

取10μl实施例1制得的铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液或10μl铂纳米粒子溶液，与100μl5μmol/lh2o2、100μl5μmol/lamplexred以及200μl磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，10mm)混合，室温下反应15min，之后利用rf-5301pc荧光分光光度计(日本岛津公司)，在550nm激发波长下扫描荧光光谱，得到图6。

从图6可以看出铂纳米粒子/氮点纳米酶可以催化过氧化氢与amplexred反应，生成具有强烈红色荧光的试卤灵(对应图6中的曲线a)，其产物的荧光强度远比对照实验(无纳米酶，对应图6中的曲线c)要高很多，证明了铂纳米粒子/氮点纳米酶对amplexred具有催化活性，且生成的试卤灵激发波长为550nm，发射波长为583nm。从图6中还可以看出铂纳米粒子对过氧化氢与amplexred之间的反应没有表现出催化活性(对应图6中的曲线b，曲线b与曲线c基本重合)，由此证明了氮点的引入提高了铂纳米材料的底物选择性。

本实施例还考察了ph值对铂纳米粒子/氮点纳米酶催化活性的影响，实验结果参见图7。从该图中可以看出当ph为7.4时，荧光强度最高。在酸性条件下铂纳米粒子/氮点纳米酶催化活性较弱，而在高ph值的条件下，amplexred不稳定，容易发生脱n-乙酰化，导致不稳定的二羟基苯氧嗪生成。

实施例3：铂纳米粒子/氮点纳米酶在检测唾液中葡萄糖的应用

本实施例采用实施例1中制备的铂纳米粒子/氮点纳米酶作为过氧化物模拟酶检测唾液样品中的葡萄糖浓度，步骤如下：

s1.样品预处理：取唾液样品；配制一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液。

s2.标准曲线的绘制：取2μl不同浓度葡萄糖溶液于0.5ml离心管中，加入2μl100μg/ml葡萄糖氧化酶、2μl实施例1中制备的铂纳米粒子/氮点纳米酶溶液以及2μl100μmol/lamplexred溶液，混匀后，取6μl混合物加入微流控芯片的微通道一端的样品池中；开启注射泵，采用抽取模式以20μl/min的流速将样品引入微通道；进样完毕后，用胶带封住样品池和出样口，之后利用荧光显微镜(axioobserverz1,德国蔡司)拍照记录报告分子试卤灵的荧光信号。根据荧光强度与葡萄糖浓度之间的变化关系绘制得到标准曲线。

s3.样品浓度的测定：取2μl唾液样品进行检测，检测条件与步骤s2相同，读取荧光强度，对照荧光强度-葡萄糖浓度标准曲线，得到唾液样品中葡萄糖的含量。

s4.加标测试：将不同浓度的葡萄糖标准溶液加入到唾液样品中进行加标测试。

荧光强度随葡萄糖浓度变化的趋势请参阅图8。本实施例中选取的葡萄糖浓度分别为0.1μmol/l，0.3μmol/l，1μmol/l，3μmol/l，6μmol/l，10μmol/l，30μmol/l，100μmol/l，300μmol/l以及1000μmol/l，同时选取葡萄糖浓度为0时的实验结果作为空白对照。测定结果显示随着目标分析物葡萄糖浓度增大，催化氧化葡萄糖生成的过氧化氢浓度增加，因此荧光信号增强。葡萄糖浓度在0.1～1000μmol/l的浓度范围内，其浓度的对数值与荧光强度差值(标准品测试荧光信号减去空白对照实验得到的信号)成线性关系，且分为两段线性。如图8内插图所示，其横坐标为葡萄糖浓度的对数值，纵坐标为荧光强度差值，该线性关系即荧光强度差值与葡萄糖浓度取对数后的标准曲线。两段线性范围分别为0.1～6μmol/l和6～1000μmol/l，对应线性回归方程为y＝4.01x+4.01(r＝0.981)以及y＝68.8x-47.9(r＝0.998)。将检测唾液样品中葡萄糖含量得到的荧光强度差值代入上述线性回归方程，得到样品中葡萄糖的浓度值，所得结果与葡萄糖定量检测试剂盒分析结果一致。利用三个水平浓度葡萄糖标准品(5μmol/l,40μmol/l和200μmol/l)进行加标回收率实验，回收率范围80.5～105％，rsd范围为1.7～9.9％。

实施例4：铂纳米粒子/氮点纳米酶在检测血清中葡萄糖的应用

本实施例采用实施例1中制备的铂纳米粒子/氮点纳米酶作为过氧化物模拟酶检测血清样品中的葡萄糖浓度，步骤如下：

s1.样品预处理：取血清样品，并稀释一定倍数；配制一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液。

s2.标准曲线的绘制：本实施例中标准曲线的建立与实施例3完全相同。

s3.样品浓度的测定：取2μl血清样品，经稀释处理进行检测，检测条件与步骤s2相同，读取荧光强度，对照荧光强度-葡萄糖浓度标准曲线，得到血清样品中葡萄糖的含量。

s4.加标测试：将不同浓度的葡萄糖标准溶液加入到血清样品中进行加标测试。

采用实施例1中制备的铂纳米粒子/氮点纳米酶结合微流控芯片分别对六个实际血清样品中的葡萄糖进行测试，所得结果和葡萄糖定量检测试剂盒分析结果一致。利用三个水平浓度标准品(5μmol/l,40μmol/l和200μmol/l)进行加标回收率实验，回收率范围为82.3％～108％，rsd范围1.4％～8.8％。

实施例3和实施例4的检测结果均表明，基于铂纳米粒子/氮点纳米酶的荧光检测方法显示了在实际样品中直接检测葡萄糖的潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。