饲料中脂溶性维生素的检测方法与流程

本发明属于维生素检测技术领域，具体涉及饲料中脂溶性维生素的检测方法。

背景技术：

脂溶性维生素a、d3、e主要存在于脂溶性溶剂中，分子结构只含有碳、氢、氧三种元素，在饲料中常与脂质共存，在消化道内也随脂肪一同吸收。当维生素吸收不足时，会引起相应的缺乏症状；当吸收过量时，又会对机体产生毒害作用。

现有的饲料检测中对浓缩饲料的维生素a、维生素d3和维生素e的检测方法是将待测样品经过皂化处理后，分别按照下列的国家标准进行检测：标准gbt17817-2010《饲料中维生素a的测定高效液相色谱法》、标准gbt17818-2010《饲料中维生素d3的测定高效液相色谱法》、gbt17812-2008《饲料中维生素e的测定高效液相色谱法》。公开(公告)号：cn105891384a涉及一种脂溶性维生素含量的检测方法，该检测方法采用经典的皂化反应的前处理方式，但用超声萃取替代传统的液液萃取，通过前处理得到待测溶液和标准溶液，然后将标准溶液和待测夜利用液相色谱进行检测，得到脂溶性维生素标准品及待测饲料中各组分的保留时间及峰面积，并绘制脂溶性维生素标准品的浓度为峰面积的对应曲线，将待测饲料各组分的保留时间及峰面积与标准曲线进行比较，计算得到待测饲料中脂溶性维生素的含量。与现有技术相比，该发明前处理过程简单，减少了有毒有害的石油醚的使用量，更加环保安全，并且其检测结果的精度高，效果好，实现了在短时间内对维生素a、维生素d3、维生素e的同时分离和检测。

但这些方法主要是将样品皂化后，直接用液相色谱分析，方法复杂、干扰大、且回收率低。

畜牧业使用的配合饲料/原料多具有成分复配、组方复杂的特点，及包括了基础原料中所含有的分散于原料内的维生素成分，又包括了人为主动添加的混合维生素成分。加之复合饲料中各种成分之间的相互作用影响，使得配合饲料中的脂溶性维生素成分的精确检测分析变得十分困难。现有的针对于食品、肉类中所含有的多种脂溶性维生素检测方法难以适用于这类复杂的情况，因而不得不采用一一检测、单独分析的方法对配合饲料进行检测分析，导致配合饲料的检测分析工作十分繁琐复杂，耗时长，工作效率较低，不利于饲料生产企业以及饲料应用企业对于饲料的品质控制。

公开(公告)号：cn106770769a公开了一种检测饲料中多种脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：（1）根据检测需要，制备多种维生素标准溶液，包括以下维生素中的至少两种以上：维生素a醋酸酯、维生素d3、维生素e乙酸酯；采用hplc-ms/ms检测标准溶液，得到标准曲线方程；（2）称取样品，到棕色容量瓶中，加入提取溶液超声提取10-30min，冷却定容，离心，用0.22μm有机相滤膜，过滤上机，采用与步骤1相同的色谱参数和质谱检测参数进行分析测试；（3）根据步骤1和步骤2的检测结果计算得出样品中的多种维生素的含量。该发明的同时检测配合饲料中的多种脂溶性维生素的方法，在一次检测分析过程中完成多种不同的维生素的检测分析。

公开(公告)号：cn108088925a涉及一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，属于化学成分的检测技术领域。该方法包括以下步骤：于溶于溶剂的浓缩饲料样品加入叔丁基对苯二酚，超声，过滤，浓缩，得待测液；用脂溶性维生素标准品代替浓缩饲料样品，经相同处理，得标准溶液。采用高效液相色谱法对待测液和标准溶液分别进行检测，根据所得的高效液相图谱计算浓缩饲料样品中脂溶性维生素的含量。脂溶性维生素包括维生素a、维生素d3和维生素e。该测定方法一方面过程简单易操作，样品制备时间短，有效避免了前处理过程中脂溶性维生素被氧化，取消了有毒有害的乙醚的使用，安全环保，另一方面其检测精度高，效果好，实现了短时间内对上述维生素同时分离和检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种饲料中脂溶性维生素的检测方法，回收率高，精确度好。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：饲料中脂溶性维生素的检测方法，包括以下步骤：

s1：将待测饲料与抗氧剂混合均匀，加入氢氧化钾乙醇溶液中，暗处静置反应，反应结束后，加入正己烷溶液，超声处理，离心取上清液，将所述上清液过滤，过凝胶色谱柱，流出液经减压浓缩挥发正己烷后，甲醇稀释，得到待测液；

s2：将步骤s1中的待测饲料替换为脂溶性维生素标准品，重复步骤s1的方法，得到标准溶液；

s3：采用高效液相色谱法分别对所述待测液和标准溶液进行检测，根据所得高效液相图谱计算所述待测饲料中脂溶性维生素的含量；

所述脂溶性维生素包括维生素a、维生素d3和维生素e。

优选地，所述抗氧剂为2,6-二叔丁基对甲酚或焦性没食子酸。

优选地，所述氢氧化钾乙醇溶液由体积分数75%乙醇与50%氢氧化钾溶液以3：1的体积比混合而成。

优选地，所述暗处静置反应的时间为12-18小时，温度为0-2℃。

优选地，所述步骤s1中的过滤是采用0.22μm有机滤膜过滤。

优选地，所述过凝胶色谱柱的条件为：bio-beadss-x3色谱柱，流动相为环己烷-乙醚溶液，流速为4ml/min，进样量为5ml，洗脱时间为0~20min、收集流出液时间为12~25min，清洗时间为40-60min。

优选地，所述环己烷-乙醚溶液的体积比为1：1。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：c18色谱柱5μm4.6mmi.d.×250mm，流动相为甲醇：水=98：2（v/v），流速为0.5ml/min，柱温：25-30℃，波长为280nm，进样体积为10μl。

采用液相色谱法测定含脂溶性微生物样品中各种成分的含量的过程中，样品预处理是样品分析中至关重要的一环，它的好坏，是保证测定结果是否准确的一个重要指标。萃取与净化技术主要用于样品制备过程中，对样品进行预富集并除去分析物的干扰物质，使得到的样品上机液与所用的hplc方法相兼容。目前用于维生素分析的净化技术主要有液液萃取、固相萃取技术、超临界流体萃取技术、免疫亲和固相萃取技术。液液萃取应用比较普遍，其不足之处也比较明显：在萃取过程中，乳化现象的形成造成待测物的损失，共萃取物的干扰，限制了检测方法的选择；整个萃取过程繁琐，消耗大量时间，并造成结果不稳定。而固相萃取技术由于较液液萃取技术在上述不足方面具有优势而得到发展，但同时固相萃取技术也存在固有的弊端，例如萃取柱批次间的差异，会导致结果偏差，而且饲料基质成分较为复杂，溶剂的选择也尤为重要。经发明人研究发现，单一采用固相萃取技术进行饲料中脂溶性维生素的提取和净化，综合效果一般，虽然检测效率上具有优势，但是检测回收率并不高。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

应用高效液相色谱法测定饲料中脂溶性维生素，包括维生素a、维生素d3和维生素e，具有样品用量少、灵敏度高的优点，且用c18色谱柱可在20分钟内将维生素a、维生素d3和维生素e三种脂溶性维生素完成分离。经实验结果证明：本方法分离保留时间稳定，回收率高，精确度好，是快速分离测定饲料等样品中脂溶性维生素的有效方法。三种脂溶性维生素线性相关系数r均大于0.9995，相对标准偏差均小于2%。该方法简便、快速，用于实际样品测定，获得了满意的结果。

附图说明

图1：维生素混合标准溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

为了更详细地进一步阐明而不是限制本发明，给出下列实施例。

本发明所用材料：

2,6-二叔丁基对甲酚、焦性没食子酸、氢氧化钾、乙醇、正己烷、甲醇、乙醚（购自国药集团化学试剂有限公司）、维生素a标准品、维生素d3标准品、维生素e标准品（购自北京谱析科技有限公司）。

本发明所用仪器设备：

电子天平（精准至0.1mg）、圆底烧瓶、超声波提取器、离心机、0.22μm有机滤膜、色谱柱bio-beadss-x3（填料质量50g）、带紫外检测器的高效液相色谱、旋转蒸发仪。

实施例1

饲料中脂溶性维生素的检测方法，包括以下步骤：

准确称取1g待测饲料，置于250ml圆底烧瓶中，加入0.1g抗氧剂混合均匀，加入50ml氢氧化钾乙醇溶液中，暗处静置反应，反应结束后，加入正己烷溶液30ml，超声处理50分钟，离心取上清液，将上清液过滤，过凝胶色谱柱，流出液经减压浓缩挥发正己烷后，加入甲醇稀释定容至100ml，得到待测液；

采用高效液相色谱法对待测液进行检测，得到待测饲料脂溶性维生素的高效液相色谱图。

其中，抗氧剂为2,6-二叔丁基对甲酚。抗氧剂与待测饲料的重量比为0.1：1。抗氧剂的加入可以保护脂溶性维生素不被氧化。

氢氧化钾乙醇溶液由体积分数75%乙醇与50%氢氧化钾溶液以3：1的体积比混合而成。氢氧化钾乙醇溶液的体积与待测饲料的质量比为50ml：1g。

暗处静置反应的时间为15小时，温度为0℃。本发明采用避光冷处理方式，较之热皂化方式虽然时间较长，但是可以完全避免因较高的温度而引起维生素的损失和异构化。

步骤s1中的过滤是采用0.22μm有机滤膜过滤，以除去杂质，避免对色谱柱产生影响。

减压浓缩采用旋转蒸发仪处理。

过凝胶色谱柱的条件为：bio-beadss-x3色谱柱，流动相为环己烷-乙醚溶液，流速为4ml/min，进样量为5ml，洗脱时间为0~20min、收集流出液时间为12~25min，清洗时间为40-60min。

环己烷-乙醚溶液中环己烷与乙醚的体积比为1：1。

本发明采用冷皂化与固相萃取配合对待测饲料进行提取净化，较之传统皂化液液萃取或固相萃取方法能够达到更好的提取、净化效果，而且也能够降低有机溶剂的用量。

高效液相色谱法的色谱条件为：c18色谱柱5μm4.6mmi.d.×250mm，流动相为甲醇：水=98：2（v/v），流速为0.5ml/min，柱温：25-30℃，波长为280nm，进样体积为10μl。

维生素a标准储备液：准确称取0.1g维生素a乙酸酯标准品，于250ml圆底烧瓶中，加入0.1g抗氧剂混合均匀，加入50ml氢氧化钾乙醇溶液中，暗处静置反应，反应结束后，加入正己烷溶液30ml，超声处理50分钟，离心取上清液，将上清液过滤，过凝胶色谱柱，流出液经减压浓缩挥发正己烷后，加入甲醇稀释定容至100ml，得到维生素a标准储备液。

维生素d3标准储备液：准确称取0.01g维生素d3标准品按照维生素a标准储备液的制备方法制备，得到维生素d3标准储备液。

维生素e标准储备液：准确称取0.01g维生素e标准品按照维生素a标准储备液的制备方法制备，得到维生素e标准储备液。

维生素a、维生素d3、维生素e混合标准工作液的配置：分别准确吸取5ml的维生素a标准储备液、5ml维生素d3标准储备液和5ml维生素e标准储备液于50ml的棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度，得到维生素混合溶液。

将制备好的维生素混合标准溶液在上述的液相条件下进行液相色谱测定，分别进样0.1μl，0.5μl，1μl，5μl，20μl，记录各维生素的保留时间和色谱峰面积，得到的色谱图，参阅图1，并以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线和标准曲线方程。维生素a乙酸酯的标准曲线方程：y=（2.15x+6.20）×10⁴，r=0.9999；维生素d3的标准曲线方程：y=（5.82x-3.96）×10⁴，r=0.9996；维生素e乙酸酯的标准曲线方程：y=(7.89x-4.03)×10³，r=0.9998。5次进样三种脂溶性维生素相对标准偏差均小于3%，重复性良好。结果显示，维生素a、维生素d3、维生素e在上述浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r在0.9995以上。按3倍信噪比计算得到维生素a、维生素d3、维生素e的检出限分别为2.38μg/kg、2.05μg/kg和10.12μg/kg。

实施例2

本实施例与实施例1不同的是：

抗氧剂为焦性没食子酸；抗氧剂与待测饲料的重量比为0.05：1。

超声处理45分钟；

暗处静置反应的时间为12小时，温度为0℃。

实施例3

本实施例与实施例1不同的是：

抗氧剂为焦性没食子酸；抗氧剂与待测饲料的重量比为0.15：1。

超声处理55分钟；

暗处静置反应的时间为18小时，温度为0℃。

实施例4

本实施例与实施例1不同的是：

抗氧剂为2,6-二叔丁基对甲酚；抗氧剂与待测饲料的重量比为0.2：1。

超声处理60分钟；

暗处静置反应的时间为13小时，温度为2℃。

结果与分析：

1）回收率

在不含脂溶性维生素的饲料中添加脂溶性维生素混合标准样品溶液，使饲料中各脂溶性维生素含量为10.0、30.0、60.0、100.0μg/kg。按实施例1给出的方法进行处理，表1为各脂溶性维生素回收率结果。结果表明：维生素a的回收率在98.3%~100.6%；维生素d3的回收率在97.1%~101.2%；维生素e的回收率在97.8%~99.6%。

表1各脂溶性维生素回收率结果

2)精密度

在不含脂溶性维生素的饲料中添加脂溶性维生素混合标准样品溶液，使饲料中各脂溶性维生素含量为30.0μg/kg。按实施例1给出的方法进行处理，表2为各脂溶性维生素精密度结果。结果表明：维生素a、维生素d3和维生素e的标准偏差分别为1.05%、1.54%、1.47%。

表2脂溶性维生素精密度测试结果

3）样品测定

应用实施例1的方法对某品牌鸡饲料进行检测，检测结果如表3所示。

表3样品检测结果

综上所述，本发明饲料中脂溶性维生素的检测方法有效避免了脂溶性维生素的氧化、以及可能存在的损失及异构化，提纯净化效果好，回收率高，精准度高，有效实现了对饲料中维生素的同时分离和检测。

综上所述，本发明饲料中脂溶性维生素的检测方法所述及的各项权利要求及技术支撑已经明确，凡依据本发明的技术支撑实质所作的任何修改与变化仍属于本发明技术支撑的范围内。