一种胸水脱落细胞制片染色方法与流程

本发明涉及细胞学制片染色技术领域，尤其涉及一种胸水脱落细胞制片染色方法。

背景技术：

嗜酸性粒细胞胸腔积液(eosinophilicpleuraleffusion，epe)是指胸腔积液中嗜酸性粒细胞占有核细胞至少10％以上。最常见的病因是胸膜间隙中存在空气或血液，或两者同时存在。但传染性疾病、炎性或肺部恶性肿瘤性病变、肺栓塞、石棉以及某些药物反应也可能引起嗜酸性胸膜积液。此外，在epe患者中，也有部分患者即使是彻底检查后仍不能明确病因的被诊断为特发性epe(iepe)。这类病患在治疗上可能受益于糖皮质激素的应用。因此胸腔积液脱落细胞特别是嗜酸性粒细胞形态学分析计数的准确性是保障临床诊疗能力进程的基础，具有重要指导意义。

目前临床上常规胸水脱落细胞处理方法有2种：一、标本制片及he染色法，步骤如下：胸水标本加95％乙醇(以1：2配比液量)，放置10min，离心，细胞沉淀物推片，95％乙醇中固定30min以上，全自动染片机进行he染色(如图1-2)。(手工法：涂片固定，水洗3min，苏木素2min，水洗2-3次，1％盐酸酒精3s，流水冲洗2-3次，碳酸锂液1min，95％乙醇i、ii各1min，伊红液1min，95％乙醇i、ii、iii、iv各30s，无水乙醇i、ii各30s，二甲苯i、ii各30s，中性树胶封固，镜检。二、胸水体液制片及瑞士-姬姆萨染色法，步骤如下：镜下如果细胞总数≥10则需要制备涂片及染色分类计数。取100-200ul胸水细胞悬液加到甩片槽中，离心5min，全自动染片机进行瑞士-姬姆萨染色(如图3-4)。手工操作法：制好片后滴加瑞士-姬姆萨a液700μl涂片上，染液覆盖整个标本涂片染色2min，再将瑞士-姬姆萨b液1000ul滴加于a液上面，以洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状使两种液体充分混合，染色13min，水洗，37℃电热板上空气干燥，中性树脂封片，镜检。

但以上两种方法操作复杂，费时长，成本较为昂贵，增加经济负担；此外，对于血性胸腔积液镜下红细胞背景较主，增加嗜酸性细胞区分难度及细胞计数时长，影响诊疗进程。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种胸水脱落细胞制片染色方法，改善细胞形态特别是嗜酸性粒细胞区分阈值。

本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

本发明提供了一种胸水脱落细胞制片染色方法，包括如下步骤：

步骤一，将胸水积液和消化液混匀，静置10-20min；然后过滤，离心；

步骤二，离心完成后，弃掉上清液，轻轻吹打细胞沉淀使其充分混匀；

步骤三，取细胞沉淀进行涂片，然后采用10％中性甲醛固定；

步骤四，涂片固定制成标本片后，水洗；

步骤五，将水洗后的标本片置于苏木素中染1-2min，水洗直至苏木素被清洗掉；标本片置于1％盐酸酒精中数秒钟，水洗3-5min；再将标本片置于伊红染液中数秒，然后水洗；

步骤六，烤片，封片最后进行镜检。

进一步地，步骤一中胸水积液和消化液的比例为1：(0.5-2)；优选为1：1。

进一步地，消化液的配制方法如下：将细胞清洗液和70％硫代乙醇酸铵按照30：(0.9-1)的比例混匀。

进一步地，步骤一中的离心条件为：温度为4℃；转速为3000r/min，离心5min。

进一步地，步骤四中的水洗时间为3-5min。

进一步地，步骤五中标本从伊红染液中拿出后水洗3-5min。

进一步地，步骤六中烤片的温度为65℃，时间为15-35min。

进一步地，步骤六中封片采用的是中性树脂。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本发明提供的胸水脱落细胞制片染色方法操作简单容易掌握，很大程度上节约耗材成本，耗时成本低；特别是针对血性胸腔积液，镜下背景清洁，杂质成分较少，细胞均匀平铺，很少细胞重叠聚堆，细胞结构清晰(尤其是嗜酸性粒细胞)，便于观察及计数。

附图说明

图1为血性胸腔积液通过现有技术中一常规胸水脱落细胞处理方法(上机he染色法)处理后在10倍镜下的图片；

图2为血性胸腔积液通过现有技术中一常规胸水脱落细胞处理方法(上机he染色法)处理后在40倍镜下的图片；

图3为血性胸腔积液通过现有技术中一常规胸水脱落细胞处理方法(上机瑞士-姬姆萨法)处理后在10倍镜下的图片；

图4为血性胸腔积液通过现有技术中一常规胸水脱落细胞处理方法(上机瑞士-姬姆萨法)处理后在40倍镜下的图片；

图5为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在10倍镜下的图片；

图6为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在40倍镜下的图片；

图7为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在10倍镜下的图片；

图8为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在40倍镜下的图片；

图9为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在10倍镜下的图片；

图10为本发明一实施例中血性胸腔积液处理后在40倍镜下的图片。

具体实施方式

本发明针对现有技术中胸水脱落细胞处理方法处理复杂、耗时长、成本高、背景差等问题，提供了一种胸水脱落细胞制片染色方法。

上述胸水脱落细胞制片染色方法包括如下步骤：

步骤一，将胸水积液和消化液混匀，静置10-20min；然后过滤，离心；

步骤二，离心完成后，弃掉上清液，轻轻吹打细胞沉淀使其充分混匀；

步骤三，取细胞沉淀进行涂片，然后采用10％中性甲醛固定；

步骤四，涂片固定制成标本片后，水洗；

步骤五，将水洗后的标本片置于苏木素中染1-2min，水洗直至苏木素被清洗掉；标本片置于1％盐酸酒精中数秒钟，水洗3-5min；再将标本片置于伊红染液中数秒，然后水洗；

步骤六，烤片，封片进行镜检。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中胸水积液和消化液的比例为1：(0.5-2)；更优选为1：1。

在本发明一优选的实施方式中，消化液的配制方法如下：将细胞清洗液和70％硫代乙醇酸铵按照30：(0.9-1)的比例混匀。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中的离心条件为：温度为4℃；转速为3000r/min，离心5min。

在本发明一优选的实施方式中，步骤四中的水洗时间为3-5min。

在本发明一优选的实施方式中，步骤五中标本从伊红染液中拿出后水洗3-5min。

在本发明一优选的实施方式中，步骤六中烤片的温度为65℃，时间为15min-35min。

在本发明一优选的实施方式中，步骤六中封片采用的是中性树脂。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种胸水脱落细胞制片染色方法，包括如下步骤：

(1)胸水样本处理及制片：

1)消化液配置：30ml细胞清洗液加0.9ml的70％硫代乙醇酸铵混匀，常温避光保存3-5天。

2)胸腔积液3ml置离心管中，以1：1配比液量加入已配好的消化液，轻轻混匀，静置15min。

3)滤网过滤，离心3000r，5min。

4)弃液，移液枪轻轻吹打细胞沉淀充分混匀。

5)取100μl细胞沉淀涂片。

6)10％中性甲醛固定制备成标本片。

(2)染色处理：

1)涂片固定，水洗3min。

2)将标本片置于苏木素液中2min，水洗掉染液。

3)将标本片置于1％盐酸酒精中数秒钟，水洗3min。

4)将标本片置于伊红染液中秒钟，水洗3min。

5)65℃进行烤片20分钟。

6)用中性树脂封片，镜检，在10倍镜和40倍镜下的图片如图5-6。

实施例2

本实施例提供一种胸水脱落细胞制片染色方法，包括如下步骤：

(1)胸水样本处理及制片：

1)消化液配置：30ml细胞清洗液加1ml的70％硫代乙醇酸铵混匀，常温避光保存3-5天。

2)胸腔积液5ml置离心管中，以1：0.5配比液量加入已配好的消化液，轻轻混匀，静置10min。

3)滤网过滤，离心3000r，5min。

4)弃液，移液枪轻轻吹打细胞沉淀充分混匀。

5)取200μl细胞沉淀涂片。

6)10％中性甲醛固定制备成标本片。

(2)染色处理：

1)涂片固定，水洗5min。

2)将标本片置于苏木素液中2min，水洗掉染液。

3)将标本片置于1％盐酸酒精中数秒钟，水洗5min。

4)将标本片置于伊红染液中秒钟，水洗5min。

5)65℃进行烤片15分钟。

6)用中性树脂封片，镜检，在10倍镜和40倍镜下的图片如图7-8。

实施例3

本实施例提供一种胸水脱落细胞制片染色方法，包括如下步骤：

(1)胸水样本处理及制片：

1)消化液配置：30ml细胞清洗液加0.95ml的70％硫代乙醇酸铵混匀，常温避光保存3-5天。

2)胸腔积液4ml置离心管中，以1：2配比液量加入已配好的消化液，轻轻混匀，静置20min。

3)滤网过滤，离心3000r，5min。

4)弃液，移液枪轻轻吹打细胞沉淀充分混匀。

5)取150μl细胞沉淀涂片。

6)10％中性甲醛固定制备成标本片。

(2)染色处理：

1)涂片固定，水洗4min。

2)将标本片置于苏木素液中1.5min，水洗掉染液。

3)将标本片置于1％盐酸酒精中数秒钟，水洗4min。

4)将标本片置于伊红染液中秒钟，水洗4min。

5)65℃进行烤片25分钟。

6)用中性树脂封片，镜检，在10倍镜和40倍镜下的图片如图9-10。

通过比较图1-4和图6-10可知，针对血性胸腔积液，本发明提供的方法镜下背景清洁，杂质成分较少，细胞均匀平铺，很少细胞重叠聚堆，细胞结构清晰(尤其是嗜酸性粒细胞)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。