一种双层膜过滤杯及其应用的制作方法

本发明属于医学检测
技术领域：
，具体涉及一种双层膜过滤杯及其应用。
背景技术：
：对细菌进行涂片染色制片并镜检是医学检验中诊断细菌感染性疾病的常用手段，也是生物学研究中区分不同类型细菌的重要手段。传统的涂片染色方法是先使样本中的细菌通过火焰加热法、冷冻干燥法或化学法等粘附固定在玻片上，然后滴加染液对细菌进行着色，最后清洗染液滴加镜油于显微镜下镜检。由于该方法检出率低、操作复杂、受人为因素影响较大，因此近几年出现了一些先富集细菌再进行染色制片的方法，其中膜过滤富集能有效的把细菌截留在膜上，达到良好的富集效果。但痰液的成分十分复杂，粘度可大可小，很多痰液样本消化后其中的杂质容易堵住膜孔发生堵膜现象，样本过不了膜导致检测失效。技术实现要素：本发明的目的是提供一种双层膜过滤杯及其在检测待测样本中细菌中的应用。本发明首先保护一种双层膜过滤杯，所述双层膜过滤杯包括由上至下依次连接的过滤杯主体、环形结构和连接座；所述过滤杯主体底部中间设有圆孔；所述过滤杯主体与所述环形结构可拆卸连接，连接处设有用于托住大孔径滤膜的网状滤膜底托；所述环形结构与所述连接座可拆卸连接；所述连接座内设有用于托住小孔径滤膜的砂芯滤板；所述连接座底部设有空心圆柱结构；所述大孔径滤膜可通过将所述环形结构卸下取出；所述小孔径滤膜可通过将所述连接座卸下取出。上述双层膜过滤杯中，所述双层膜过滤杯还包括与所述过滤杯主体配套的杯封盖。进一步的，所述过滤杯主体底部围绕所述圆孔设有向下延伸的上夹层内套(上夹层内套采用中空结构)；所述环形结构的内侧壁设有第一l形台阶，所述上夹层内套通过所述第一l形台阶与所述环形结构紧配合；所述上夹层内套(上夹层内套中空结构)底部设有用于托住大孔径滤膜的网状滤膜底托，所述网状滤膜底托与所述环形结构的第一l形台阶固定连接，所述网状滤膜底托与所述上夹层内套之间设有密封垫；所述环形结构设有向下延伸的下夹层内套(下夹层内套采用中空结构)，所述连接座设有供所述下夹层内套插入的第二l形台阶，所述下夹层内套通过所述第二l形台阶与所述连接座紧配合；所述下夹层内套(下夹层内套中空结构)底部设有用于托住小孔径滤膜的砂芯滤板，所述连接座设有供所述砂芯滤板插入的第三l形台阶，所述砂芯滤板通过所述第三l形台阶与所述连接座紧配合；所述砂芯滤板与所述下夹层内套之间设有密封垫。更进一步的，所述过滤杯主体与所述环形结构通过螺纹连接；所述环形结构与所述连接座通过螺纹连接；所述网状滤膜底托边缘与所述环形结构的第一l形台阶通过粘贴作用连接。上述双层膜过滤杯中，所述滤膜可为pvdf膜、pc膜或不锈钢网。进一步的，所述大孔径滤膜可为pvdf膜；所述小孔径滤膜可为pc膜。更进一步的，所述大孔径滤膜的孔径可为5-12μm；所述小孔径滤膜的孔径可为0.2-0.8μm。在实际应用中，可根据检测对象的不同选择孔径大小合适的滤膜，如检测对象为痰液时，大孔径滤膜的孔径为5μm，小孔径滤膜的孔径为0.8μm。上述双层膜过滤杯中，所述砂芯滤板孔径可为5-10μm，具体可为10μm。上述双层膜过滤杯中，所述圆孔直径可为4-6mm，具体可为5mm。本发明还保护一种产品，所述产品包括上述双层膜过滤杯和抽滤装置。上述产品中，所述抽滤装置可为负压抽滤装置或自动过滤染色制片机。在本发明的一个具体实施例中，所述负压抽滤装置为agela负压spe装置。上述双层膜过滤杯或产品在富集待测样本中细菌或检测待测样本中细菌中的应用也均属于本发明的保护范围。本发明还保护利用上述双层膜过滤杯检测待测样本中细菌的方法，所述方法包括如下步骤：(1)拧开上述双层膜过滤杯的杯封盖，加入待测样本；(2)完成步骤(1)后，将上述双层膜过滤杯底部的空心圆柱结构放入抽虑装置中进行抽滤，使所述待测样本中的细菌截留在小孔径滤膜上；(3)完成步骤(2)后，采用染色法对截留在小孔径滤膜上的细菌进行染色；(4)完成步骤(3)后，将所述双层膜过滤杯的连接座卸下，取出小孔径滤膜并进行镜检，实现待测样本中细菌的检测。上述方法中，所述染色法可为抗酸染色法或荧光染色法或革兰氏染色法。上述应用或方法中，所述待测样本可为痰液、血液或髓液等。在本发明的一个具体实施例中，所述待测样本为痰液或菌液。本发明提供了一种双层膜过滤杯，该双层膜过滤杯在富集膜上加一层孔径较大的滤膜作为初滤，把痰液样本中较大颗粒的杂质先截留住，避免堵住孔径较小的富集膜。通过实验证明：基于本发明的双层膜过滤杯检测痰液中细菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明检测方法的灵敏度更高，且具有安全、自动化、操作简便和检出率高的优点，在细菌检测与诊断领域具有良好的应用前景。附图说明图1为双层膜过滤杯的结构图。1、杯封盖；2、过滤杯主体；3、环形结构；4、连接座；5、网状滤膜底托；6、砂芯滤板、7、上夹层内套；8、下夹层内套；9、第一l形台阶；10、第二l形台阶；11、第三l形台阶；12、圆孔；13、空心圆柱结构。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的砂芯滤板是石家庄瑞登塑料制品有限公司的产品，货号为vsp-666，孔径大小为10μm。实施例1、双层膜过滤杯及其使用方法一、双层膜过滤杯本发明的双层膜过滤杯由杯体和与所述杯体配套的杯封盖1组成，所述杯体周壁封闭，底部设有空心圆柱结构13；所述杯体包括由上至下依次连接的过滤杯主体2、环形结构3和连接座4；所述过滤杯主体2与所述环形结构3可拆卸连接；所述环形结构3与所述连接座4可拆卸连接。所述过滤杯主体2底部中间设有圆孔12(圆孔直径为5mm)。所述过滤杯主体2底部围绕所述圆孔12设有向下延伸的上夹层内套7，所述上夹层内套7采用中空结构；所述环形结构3的内侧壁设有第一l形台阶9，所述上夹层内套7通过所述第一l形台阶9与所述环形结构3紧配合。在所述上夹层内套7的中空结构底部设有用于托住大孔径滤膜(孔径为5μm的pvdf膜)的网状滤膜底托5，所述网状滤膜底托5边缘与所述环形结构的第一l形台阶9通过粘贴作用固定连接，所述网状滤膜底托5与所述上夹层内套7之间设有密封垫。所述环形结构3设有向下延伸的下夹层内套8，所述下夹层内套8采用中空结构；所述连接座4设有供所述下夹层内套8插入的第二l形台阶10，所述下夹层内套8通过所述第二l形台阶10与所述连接座4紧配合。所述下夹层内套8的中空结构底部设有用于托住小孔径滤膜(孔径为0.8μm的pc膜)的砂芯滤板6(孔径为10μm)，所述连接座4设有供所述砂芯滤板6插入的第三l形台阶11，所述砂芯滤板6通过所述第三l形台阶11与所述连接座4紧配合；所述砂芯滤板6与所述下夹层内套8之间设有密封垫。所述连接座底部设有空心圆柱结构13。所述小孔径滤膜可通过将所述环形结构3拧下取出。所述小孔径滤膜可通过将所述连接座4拧下取出。二、双层膜过滤杯的使用方法1、拧开双层膜过滤杯的杯封盖，加入待测样本。2、完成步骤1后，将双层膜过滤杯底部的空心圆柱结构放入负压抽虑装置或自动过滤染色制片机中进行负压抽滤，待测样本在压力差下先通过上层孔径较大的滤膜进行初滤，把待测样本中较大颗粒的杂质先截留住再通过下层孔径较小的滤膜进行细菌富集，最终细菌被截留在下层孔径较小的滤膜上。3、完成步骤2后，向双层膜过滤杯中加入染色液进行染色、脱色、复染、清洗。4、完成步骤3后，将连接座拧下，取出小孔径滤膜，并对滤膜进行镜检。实施例2、双层膜过滤杯在抗酸染色法镜检抗酸菌中的应用本实施例中的痰液样本来源于经诊断为结核病患者的痰液。分别采用本发明的双层膜过滤杯进行抗酸染色法镜检抗酸菌和直接涂片法检测痰液样本中的抗酸菌。一、实验组1、样本的消化处理将痰液样本和痰碱性消化液等体积混匀，室温消化30min，得到消化后的痰液样本。2、消化产物的过滤(1)将实施例1中的双层膜过滤杯底部的空心圆柱结构放入负压抽虑装置(agela负压spe装置)中，拧开双层膜过滤杯的杯封盖，加入消化后的痰液样本，进行负压抽滤。(2)痰液在压力差下先通过上层大孔径滤膜，再通过下层小孔径滤膜。3、抗酸染色法镜检抗酸菌(1)向双层膜过滤杯中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，浸泡滤膜1-20min，负压抽滤干净。(2)向双层膜过滤杯中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。(3)向双层膜过滤杯中加入复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。(4)从双层膜过滤杯中取出小孔径滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，显微镜下观察染色细菌。二、对照组1、挑取适量痰液样本置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为石碳酸复红)，盖满痰膜，染色20min。3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。4、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，布满痰膜，脱色1min。5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水。6、滴加复染液(购自珠海贝索，主要成分为亚甲基蓝)，盖满痰膜，复染1min。7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。8、向菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。三、检测结果基于本发明的双层膜过滤杯进行抗酸染色法镜检抗酸菌和对照组的检测结果如表1所示。结果表明：基于本发明的双层膜过滤杯进行抗酸染色法镜检抗酸菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明检测方法的灵敏度更高。表1、抗酸染色法镜检抗酸菌的结果抗酸菌浓度/ml3×106条3×105条3×104条3×103条3×102条0条本发明方法++++++++++--直接涂片法++----注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个抗酸菌/300视野；“++”代表1～9个抗酸菌/10视野；“+++”代表1～9个抗酸菌/1视野；“++++”代表≥10个抗酸菌/1视野。实施例3、双层膜过滤杯在荧光染色法镜检抗酸菌中的应用本实施例中的痰液样本来源于经诊断为结核病患者的痰液。分别采用本发明的双层膜过滤杯进行荧光染色法镜检抗酸菌和直接涂片法检测痰液样本中的抗酸菌。一、实验组1、样本的消化处理将痰液样本和痰碱性消化液等体积混匀，室温消化30min，得到消化后的痰液样本。2、消化产物的过滤(1)将实施例1中的双层膜过滤杯底部的空心圆柱结构放入负压抽虑装置(agela负压spe装置)中，拧开双层膜过滤杯的杯封盖，加入消化后的痰液样本，进行负压抽滤。(2)痰液在压力差下先通过大孔径滤膜，再通过小孔径滤膜。3、荧光染色法镜检抗酸菌(1)向双层膜过滤杯中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为金胺o)，浸泡滤膜1-20min，负压抽滤干净。(2)向双层膜过滤杯中加入洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。(3)向双层膜过滤杯中加入复染液(购自珠海贝索，主要成分为高锰酸钾)，浸泡滤膜1-5min，负压抽滤干净。(4)从双层膜过滤杯中取出小孔径滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，荧光显微镜下观察染色细菌。二、对照组1、挑取适量痰液置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为金胺o)，盖满痰膜，染色20min。3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。4、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为酸性酒精)，布满痰膜，脱色1min。5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去标本上剩余的水。6、滴加复染液(购自珠海贝索，主要成分为高锰酸钾)，盖满痰膜，复染1min。7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。8、向菌膜中间滴加镜油，置于荧光显微镜下观察染色细菌。三、检测结果基于本发明的双层膜过滤杯进行荧光染色法镜检抗酸菌和对照组的检测结果如表2所示。结果表明：基于本发明的双层膜过滤杯进行荧光染色法镜检抗酸菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明检测方法的灵敏度更高。表2、荧光染色法镜检抗酸菌的结果抗酸菌浓度/ml3×105条3×104条3×103条3×102条3×101条0条本发明方法++++++++++--直接涂片法+++----注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个抗酸菌/300视野；“++”代表1～9个抗酸菌/10视野；“+++”代表1～9个抗酸菌/1视野；“++++”代表≥10个抗酸菌/1视野。实施例4、双层膜过滤杯在革兰氏染色法镜检细菌中的应用本实施例中的痰液样本来源于经诊断为结核病患者的痰液。分别采用本发明的双层膜过滤杯进行革兰氏染色法镜检细菌和直接涂片法检测痰液样本中的细菌。一、实验组1、样本的消化处理将痰液样本和痰碱性消化液等体积混匀，室温消化30min，得到消化后的痰液样本。2、消化产物的过滤(1)将实施例1中的双层膜过滤杯底部的空心圆柱结构放入负压抽虑装置(agela负压spe装置)中，拧开双层膜过滤杯的杯封盖，加入消化后的痰液样本，进行负压抽滤。(2)痰液在压力差下先通过上层大孔径滤膜，再通过下层小孔径滤膜。3、革兰氏染色法镜检细菌(1)向双层膜过滤杯中加入初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫染)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。(2)向双层膜过滤杯中加入无菌水，负压抽滤干净。(3)向双层膜过滤杯中加入媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，浸泡滤膜1min，负压抽滤干净。(4)向双层膜过滤杯中加入脱色液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。(5)向双层膜过滤杯中加入复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，浸泡滤膜30s，负压抽滤干净。(6)从双层膜过滤杯中取出小孔径滤膜，截留细菌面向上置于玻片上，往中间滴加镜油，显微镜下观察染色细菌。二、对照组1、挑取适量痰液置于玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。2、待冷却后放置在染色架上，滴加初染液(购自珠海贝索，主要成分为草酸铵结晶紫)，盖满菌膜，染色1min。3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。4、滴加媒染染液(购自珠海贝索，主要成分为碘-碘化钾)，布满菌膜，浸泡玻片1min，负压抽滤干净。5、滴加洗脱液(购自珠海贝索，成分为乙醇(95％)或丙酮酸)，布满菌膜，脱色30s。6、滴加复染液(购自珠海贝索，成分为蕃红染液或者沙黄)，盖满菌膜，复染30s。7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水，自然干燥或烘箱烘干。8、向菌膜中间滴加镜油，置于显微镜下观察染色细菌。三、检测结果基于本发明的双层膜过滤杯进行革兰氏染色法镜检细菌和对照组的检测结果如表3所示。结果表明：基于本发明的双层膜过滤杯进行革兰氏染色法检测革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最低检测限比现有技术中的直接涂片法低，说明本发明检测方法的灵敏度更高。表3、革兰氏染色法镜检细菌的结果阳性菌浓度/ml3×106条3×105条3×104条3×103条3×102条0条本发明方法++++++++++--直接涂片法+-----阴性菌浓度/ml3×106条3×105条3×104条3×103条3×102条0条本发明方法++++++++++--直接涂片法+-----注：“-”代表阴性；“+”代表3～9个细菌/300视野；“++”代表1～9个细菌/10视野；“+++”代表1～9个细菌/1视野；“++++”代表≥10个细菌/1视野。当前第1页12