本发明涉及临床输血技术及疑难血型鉴定领域，特别涉及一种红细胞热放散洗脱试剂盒及其在abo血型鉴定中的应用。
背景技术：
放散实验也称作洗脱实验、也有称作释放实验，就是通过一定的方法条件把红细胞上结合的抗体洗脱下来，运用放散后的红细胞或抗体鉴定血型或做输血相容性检测，可以分为物理方法(如热放散)及化学方法(如甘氨酸-hcl/edta放散)。
甘氨酸-hcl/edta放散法(后简称酸放散法)可以使igg抗体从红细胞膜上分离下来，可用于放散自身或同种igg类抗体、收集放散后的红细胞用于后续鉴定等情况，此方法一般不用于放散abo血型系统的igm类抗体。
热放散实验是目前最常用的放散方法，可再细分为45℃热放散法和56℃热放散法，45℃热放散法可用于去除红细胞表面结合的igm/igg抗体，处理后的红细胞溶血程度低、细胞膜完整，可用于血型鉴定正定型。56℃放散法用于把红细胞表面结合的igm/igg抗体放散下来用于鉴定，推导受检红细胞的抗原种类，此方法主要用于收集放散液中的抗体，对红细胞的损伤较大，溶血程度高。经典56℃热放散实验是使用生理盐水或6％小牛血清作为放散溶液。生理盐水放散会使红细胞明显溶血而使放散液颜色过深不利于观察结果，且红细胞因明显破裂、溶血而不能再用于血型鉴定。6％小牛血清放散红细胞溶血程度较低，但放散液中抗体含量不高，6％小牛血清稳定性较差，一般需要现配现用。
因此，提供一种能高效洗脱并收集abo血型抗体、保护红细胞膜的完整性且性质稳定的红细胞热放散洗脱溶液具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种红细胞热放散洗脱溶液。
本发明的另一目的在于提供一种红细胞热放散洗脱试剂盒。
本发明的再一目的在于提供所述红细胞热放散洗脱试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种红细胞热放散洗脱溶液配方，包括如下组分：甘氨酸(gly)7.0～8.0g/l，氯化钠4.0～6.0g/l，甘油50.0～60.0g/l。
所述的红细胞热放散洗脱溶液配方，优选为包括如下组分：甘氨酸(gly)7.5g/l，氯化钠5.0g/l，甘油55.0g/l。
所述的红细胞热放散洗脱溶液的ph值为6.0～6.2。
所述的红细胞热放散洗脱溶液的保存条件为：保存于4±2℃的环境中。
所述的红细胞热放散洗脱溶液中还可以含有一种或者是至少两种药学或生理学上可以接受的载体(或辅料)。
所述的辅料包括稳定剂、防腐剂、缓冲剂、缓释剂、润湿剂、吸收剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂等。
所述的红细胞热放散洗脱溶液通过如下方法制备得到：称取甘氨酸，氯化钠和甘油，然后加水定容，得到所述的红细胞热放散洗脱溶液；具体为：称取0.70～0.80g甘氨酸，0.4～0.6g氯化钠，5.0～6.0g甘油，加水定容至100ml。
所述的水为灭菌用注射用水、去离子水或纯水中的一种。
所述的红细胞热放散洗脱溶液在制备红细胞热放散洗脱试剂或试剂盒，abo血型鉴定试剂或试剂盒，以及abo血型系统新生儿溶血病和亚型的检测试剂或试剂盒中的应用。
一种红细胞热放散洗脱试剂盒，包括上述红细胞热放散洗脱溶液。
一种abo血型鉴定试剂盒，包括上述红细胞热放散洗脱溶液。
所述的abo血型鉴定试剂盒，还可以包括标准抗血清、试剂红细胞和抗人球蛋白微柱凝胶卡中的至少一种。
所述的标准抗血清为抗-a抗体血清、抗-b抗体血清和抗-h抗体血清中的至少一种。
所述的试剂红细胞为a型试剂红细胞、b型试剂红细胞和o型试剂红细胞中的至少一种。
所述的抗人球蛋白微柱凝胶卡包括低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡。
所述的红细胞热放散洗脱溶液、红细胞热放散洗脱试剂盒和abo血型鉴定试剂盒中的至少一种在abo血型鉴定中的应用。
所述的红细胞热放散洗脱溶液可用于解离红细胞膜上结合的abo血型系统的igm类抗体和/或igg类抗体，获得放散液，再通过检测放散液中的抗体确定受检者abo血型。
一种abo血型鉴定方法，包括如下步骤：
(1)①将待检红细胞(已知abo血型抗原)用生理盐水洗涤，分别加入等体积的抗-a抗体血清或抗-b抗体血清(根据受检者正定型结果选择相应标准抗血清)，混合均匀，然后放置于4±2℃冰箱中至少30min(15min时可将其混匀一次)，使细胞充分吸收；
或：
②将待检红细胞(abo血型抗原未知)用生理盐水洗涤后分成两份，一份加入等体积的抗-a抗体血清，另一份加入等体积的抗-b抗体血清，混合均匀，然后放置于4±2℃冰箱中至少30min(15min时可将其混匀一次)，使细胞充分吸收；
或：
③将待检红细胞用生理盐水洗涤后，加入等体积的抗-h抗体血清，混合均匀，然后放置于4±2℃冰箱中至少30min(15min时可将其混匀一次)，使细胞充分吸收；
(2)将步骤(1)中吸收完成的红细胞悬液离心，取上清，得到吸收后的抗血清；然后再用标准试剂红细胞(a、b、o)检测吸收前后抗血清效价：若加入抗-a抗体血清吸收后的抗血清效价下降，则表示受检者红细胞具有a抗原，否则表示不具有a抗原；同理，若加入抗-b抗体血清吸收后的抗血清效价下降，则表示受检者红细胞具有b抗原，否则表示不具有b抗原；若加入抗-h抗体血清吸收后的抗血清效价下降(用市售标准试剂o细胞检测)，则表示受检者红细胞具有h抗原，否则表示不具有h抗原；确定存在a、b或h抗原后进行下一步操作；
(3)将步骤(1)中吸收完成的细胞用冰的生理盐水离心洗涤6次以上，然后按等体积加入上述红细胞热放散洗脱溶液，56℃水浴9～10min，期间周期轻摇细胞使抗体充分放散；
(4)放散结束后离心，取上清，得到放散液；
(5)对放散液进行检测，得到受检红细胞血型。
步骤(1)中所述的待检红细胞的用量为至少300μl；优选为至少500μl。
步骤(1)中所述的洗涤的次数为3次以上。
步骤(2)中所述的试剂红细胞为a型试剂红细胞、b型试剂红细胞和o型试剂红细胞中的至少一种。
步骤(2)中所述的离心的条件为：1000×g(相对离心力)离心5min。
所述的abo血型鉴定方法，在步骤(2)和(3)之间还包括如下步骤：将步骤(1)中吸收完成的细胞用冰的生理盐水洗涤6次以上，保留最后一次洗涤后的上清液，然后用相应的试剂红细胞(a或b)检测其是否还存在吸收时所加入的抗体(抗-a或抗-b)，如果还能检出抗体，则需继续洗涤直到上清液不能检出抗体为止。
步骤(3)中所述的离心的条件为：3000rpm离心1s。
步骤(3)中所述的洗涤的总时间为不超过15min。
步骤(4)中所述的离心的条件为：1000×g(相对离心力)离心3min。
步骤(5)中所述的检测为采用a型、b型、o型试剂红细胞，和/或低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡进行检测。
所述的abo血型鉴定方法，还包括设立阳性对照及阴性对照的步骤；具体为：选取3例相应抗原阳性的红细胞及3例o型红细胞，步骤(4)中得到的放散液与所有抗原阳性的红细胞都有反应，与o型红细胞均不反应。
本发明的原理是，利用热力使原本双凹盘形的红细胞短时间内膨胀成球形，使红细胞膜上结合的抗体脱落下来。并且，加入的放散溶液(主要成分甘氨酸)使得反应环境呈酸性，红细胞抗原和与之结合的抗体产生质子化，带有相同的正电荷，形成了排斥，使原本正反电荷相互吸引的抗原抗体得以解离。其中，溶液中的甘油可穿透红细胞膜，增大细胞的表面张力，阻碍膜的小泡化，减少溶血；而氯化钠有助于调节溶液的晶体渗透压，保持红细胞内外液体环境的平衡。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供一种检测效能高、使用方便且性质稳定的红细胞热放散洗脱溶液，综合了45℃和56℃热放散法的优点，适用于56℃热放散法，主要用于收集红细胞表面脱落的abo系统igm类抗体或igg类抗体再进行血型鉴定，针对abo系统新生儿溶血病和亚型的检测。
(2)本发明中的红细胞热放散洗脱溶液可以用于热放散试验中解离红细胞膜上结合的abo血型系统抗体(igm、igg)，抗体脱落后，可通过检测放散液中的抗体(含有抗体的放散液可与标准试剂红细胞反应)以确定受检者abo血型，可广泛应用于红细胞弱表达抗原的检测，且放散后的红细胞仍可以用于血型鉴定正定型。
(3)本发明中的红细胞热放散洗脱溶液能高效洗脱并收集abo血型抗体的同时，保护红细胞膜的完整性，使得放散液中的抗体含量(效价)较高，且放散后的红细胞溶血程度较低，可再用于血型正定型检测。
(4)利用本发明方法放散红细胞表面上结合抗体的效率更高，阳性检出率高于传统放散溶液(生理盐水、6％小牛血清)，暂无发现假阴性案例。
(5)本发明红细胞热放散洗脱液需要更少的红细胞样本(300μl～500μl)即可完成热放散试验，而传统的盐水、6％小牛血清热放散法需要至少1ml红细胞样本。
(6)本发明中的红细胞热放散洗脱溶液的使用方法缩短了热放散实验的时长，且溶液性质稳定，配制方便，无需添加防腐剂就能长期保存，无需现配现用，使用前无需复温，使用更加方便，可有效提高热放散实验的成功率。
(7)使用本发明红细胞热放散洗脱液所收集到的放散液，颜色浅而不浑浊，抗体检测时使用试管法或微柱卡均可清晰观察凝集。
(8)使用本发明红细胞热放散洗脱液所收集到的放散液，更利于抗体保存，实验后24h内抗体效价基本不减弱，48h内抗体依然能检测出来，优于传统盐水、6％小牛血清对抗体的保存效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
1、本发明中的红细胞热放散洗脱溶液的制备方法，包括如下步骤：
称取甘氨酸(gly)0.75±0.05g，氯化钠0.5±0.1g，甘油5.5±0.5g，溶于灭菌用注射用水、去离子水或纯水，定容至100ml；
实施例中所使用的红细胞热放散洗脱溶液的配制方法为：
(1)称取甘氨酸(gly)0.75g，氯化钠0.5g，甘油5.5g，溶于灭菌用注射用水、去离子水或纯水，定容至100ml。
(2)将上述溶液充分混匀，密封保存在4±2℃的环境中。实验时取出摇匀后直接使用。
2、本发明红细胞热放散洗脱溶液的使用方法(吸收放散实验全过程)
2.1吸收试验
(1)将受检者的抗凝血液标本离心去除血浆，得到压积红细胞，用生理盐水洗涤受检者压积红细胞3次，末次洗涤盐水弃尽。取压积红细胞与相应抗血清(商品化的标准抗a/b/h血清或选取5～6人已知相同abo血型的献血员混合血清)等体积混合。
(2)4±2℃冰箱中放置至少30min，15min时将试管混匀一次，使红细胞充分吸收抗体。
(3)吸收完成后1000×g(相对离心力)离心5min，取上层清液即为吸收后抗血清。
(4)用相应的市售标准试剂红细胞(a或b)检测吸收前后抗血清效价变化(1000×g离心15s)，血清效价用倍比稀释法计算，即用能检测出凝集的最高稀释倍数作为该血清抗体效价。若吸收后抗血清效价下降(至少下降一个效价级，如16倍下降到8倍)，则表示受检者红细胞具有相应的抗原，否则表示不具有相应的抗原。
2.2放散试验
(1)吸收完成后离心去除抗血清，得到受检者压积红细胞，将红细胞尽快用冰的(0～4℃)生理盐水至少洗涤6次，每次3000rpm离心1s即可停止。
(2)保留最后一次洗涤后的上清液，加入相应的市售试剂红细胞(a或b)检测其是否还存在吸收时所加入的抗体(抗-a或抗-b)(商品化的标准抗a/b/h血清或选取5～6人已知相同abo血型的献血员混合血清)，如果还能检出抗体，则需继续洗涤直到上清液不能检出抗体为止。
(3)弃净洗涤液后压积红细胞按等体积加入本发明的红细胞热放散洗脱溶液。56℃水浴9～10min，期间定期轻摇试管使吸附红细胞上的抗体充分放散。
(4)放散结束后立即取出试管，1000×g离心3min，上清液即为放散液，为淡黄色清液，有时56℃放散时间＞10min的放散液可呈淡红色。
(5)将放散液用市售标准a型或b型试剂红细胞(体积分数为1～5％)鉴定抗体，1000×g离心15s观察，也可使用低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡检测，间接判断受检红细胞abo血型。
放散液只与a型试剂红细胞凝集考虑为待检红细胞有a抗原；放散液只与b型试剂红细胞凝集考虑为待检红细胞有b抗原；放散液与a、b型试剂红细胞均凝集考虑为待检红细胞有a、b抗原；放散液不与试剂红细胞凝集考虑为待检红细胞无a、b抗原。
注意事项：
(1)吸收试验后洗脱时要使用冰盐水洗涤，且洗涤过程要快速，洗涤6次的时间尽量控制在15min内，末次洗涤液需保留待最后结果验证。
(2)检测放散液中的抗体时需要设立阳性标本对照及阴性标本对照，具体方法为：选取3例相应抗原阳性的红细胞及3例o型红细胞，放散液与3例相应抗原阳性的红细胞都有反应，与3例o型红细胞均不反应，最后一次的洗涤液与上述6例细胞均不反应，最终结果才能成立。
实施例1：制备用于检测抗体的放散液(1例微柱凝胶法a、b抗原阴性但有抗-a1抗体的正反定型不符受检者的血液标本)
(1)将受检者的抗凝血液标本离心去除血浆，得到压积红细胞；然后将受检者的压积红细胞用生理盐水洗涤3次，末次洗涤盐水弃尽。取1体积(至少300μl～500μl)红细胞与1体积的单克隆抗-b抗体血清(或自制4～6人混合抗-b抗体血清)等体积混合。
(2)4℃冰箱中放置30min，15min时将试管混匀一次，使红细胞充分吸收抗体。
(3)吸收完成后1000×g离心5min，取上层血清即为吸收后抗血清。
(4)用市售标准试剂b细胞检测吸收前后抗血清效价变化，可用试管法1000×g离心15s观察凝集强度及效价，若吸收后抗-b血清效价无变化，则表示受检者红细胞没有b抗原。如吸收后抗-b血清效价下降，则表示受检者红细胞有b抗原，继续进行下一步操作。
(5)吸收完成后离心去除抗血清，得到受检者压积红细胞，尽快用冰的(0～4℃)生理盐水至少洗涤6次，每次3000rpm离心1s即可停止(洗涤全过程控制在15min内)。
(6)保留最后一次洗涤后的上清液，加入市售标准试剂b细胞看是否有凝集，如果还能检出抗体，则需继续洗涤直到上清液不能检出抗-b抗体为止，进入下一步操作。
(7)弃净洗涤液后立即往1体积受检者的红细胞中加入1体积本发明红细胞热放散洗脱溶液。56℃水浴9～10min，期间定期轻摇试管使吸附红细胞上的抗体充分放散。
(8)放散结束后立即取出试管1000×g离心3min，上清液即为放散液(淡黄色清液)。尽快把放散液转移到干净试管内待检。
(9)用市售标准试剂b型红细胞(体积分数为1～5％)鉴定放散液中的抗体，1000×g离心15s观察(试管法)，也可使用低离子抗人球蛋白微柱凝胶卡检测，间接判断受检红细胞血型。此例如放散液能与标准试剂b细胞凝集，则考虑受检者红细胞上存在b抗原，需要进行下一步对照验证。
(10)选取3例b型红细胞及3例o型红细胞，放散液与3例b型红细胞都有反应，与3例o型红细胞均不反应，最后一次的洗涤液与上述6例细胞均不反应，证明吸收放散实验成功，受检者红细胞上存在b抗原，考虑受检者血型为b型(不排除b亚型)。
说明：上述操作方法同样适用于abo血型系统a抗原、h抗原的检测，具体试剂请自行转换。
实施例2：不同放散溶液的稳定性、效价积分、阳性检出率、假阳性率、24小时后抗体效价积分以及48小时后抗体检出率等试验
1、稳定性试验
本研究通过质量分数、渗透压及ph值三个指标来比较本发明红细胞热放散洗脱溶液与6％小牛血清(盐水配制，质量分数)的稳定性。首先配制好两种溶液，立即分装到若干支密封微量管中，留取一支微量管马上检测上述三个指标，其余装有溶液的微量管保存在4±2℃的冰箱中，间隔一周取出一支检测上述三个指标。
质量分数：采用紫外可见光分光光度计，检测配制溶液的吸光度，每次检测都以新开瓶的灭菌用注射用水作为空白值(6％小牛血清以新开瓶的生理盐水作为空白值)，每次检测的溶液的吸光值与新鲜(首次检测的样本)配制溶液的吸光值比较，得出每周检测的质量分数，计算公式如下：
每周溶液质量分数＝每周待检溶液吸光值×新鲜溶液质量分数(已知，起始第0天溶液的质量分数)÷新鲜溶液吸光值。
渗透压：采用冰点渗透压仪测定两种溶液的渗透压。
ph值：采用台式ph测量仪测定两种溶液的ph值。
连续监测两种溶液3个指标9周，计算数据的变异系数(cv值＝标准差/均值*100％)，结果如表1所示。表1结果显示：9周末本发明红细胞热放散洗脱溶液质量分数、渗透压及ph值的cv值分别为2.801、0.992、0.955；而6％小牛血清(盐水配制)质量分数、渗透压及ph值的cv值分别为7.123、2.674、2.128。可以看出，本发明红细胞热放散洗脱溶液的稳定性优于6％小牛血清(盐水配制)。
表1
2、效价积分、阳性检出率、假阳性率、24小时后抗体效价积分以及48小时后抗体检出率等试验(以下数据结果均使用spss20软件分析统计所得)
100例已知abo血型抗原的受试者血液标本，其中50例抗原阳性(部分抗原弱表达或不表达的标本已通过基因检测确定抗原的存在)的标本，50例抗原阴性的标本(o型标本与抗-a/b吸收或a/b型标本与抗-b/a吸收)，采用本发明中红细胞热放散洗脱溶液、生理盐水以及6％小牛血清进行热放散实验(实验方法参考实施例1)，结果如表2所示。
从表2中可以得出：采用本发明中红细胞热放散洗脱溶液的放散液抗体效价积分总数最高，且与生理盐水、6％小牛血清作配对t检验显示差异有统计学意义(p＜0.05)。三种放散溶液阳性检出率的结果：本发明中红细胞热放散洗脱溶液为100％，生理盐水为86.67％，6％小牛血清为84.44％，本发明中红细胞热放散洗脱溶液的阳性检出率与另外两种放散溶液比较有统计学差异(p＜0.05)。假阳性率的比较结果：三种溶液在检测50例阴性标本均无出现假阳性结果，所以三者假阳性率的比较无统计学差异。24小时后三种放散液的抗体效价与新鲜放散液比较无统计学差异。48小时后三种放散液抗体检出率的结果：本发明中的红细胞放散液的检出率与生理盐水、6％小牛血清比较均有统计学差异(p＜0.05)。
表2
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。