维罗毒素的检测方法与流程

1.本发明涉及维罗毒素(verotoxin)的检测方法。


背景技术：

2.由肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic escherichia coli：ehec)引起的食物中毒的原因在于由ehec所产生的维罗毒素。维罗毒素存在1型和2型，二者通过血清学方式来区分，1型和2型各自存在多种亚型。维罗毒素的检测对于成为食物中毒原因的食品的鉴定、诊断或症状的预测等是重要的。
3.非专利文献1中，通过聚合酶链反应(pcr：polymerase chain reaction)扩增并检测了维罗毒素的基因。该方法中，能够判定在试样中包含的细菌中是否存在维罗毒素的基因，但并不能区分在该细菌中是否表达了维罗毒素。非专利文献2中，利用免疫色谱法检测了维罗毒素的1型和2型，但无法区分亚型。非专利文献3中，通过在质谱分析中在对应于维罗毒素的m/z附近是否存在峰来判定在试样中是否包含维罗毒素。然而，若对应于杂质的峰存在于对应于维罗毒素的m/z附近则呈假阳性。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：势户等其他2人＂腸管出血性大腸菌(ehec)検査
·
診断
マニュアル
(肠出血性大肠埃希氏菌(ehec)检测/诊断手册)＂、(日本)、国立感染症研究所、2019年9月25日
7.非专利文献2：nh foods ltd.、＂nh
イムノクロマト
vt 1/2＜＜取扱説明書＞＞第1版(nh免疫色谱法vt 1/2<<使用说明书>>第1版)＂、(日本)、nh foods ltd.、2009年12月
8.非专利文献3：fagerquist ck,zaragoza wj,sultan o,woo n,quinones b,cooley mb,mandrell re."top-down proteomic identification of shiga toxin 2 subtypes from shiga toxin-producing escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry"applied and environmental microbiology,(美国),american society for microbiology,2014年5月，volume 80,issue 9,pp.2928-2940


技术实现要素：

9.发明要解决的问题
10.优选使用质谱分析来更准确地进行维罗毒素的检测。
11.用于解决问题的方案
12.本发明的第1方式涉及一种维罗毒素的检测方法，其具备：准备试样和与维罗毒素结合的分子；进行利用前述分子与维罗毒素的结合来纯化前述试样中的维罗毒素的操作；以及，将通过前述操作得到的前述试样供于第1质谱分析。
13.发明的效果
14.根据本发明，能够使用质谱分析更准确地进行维罗毒素的检测。
附图说明
15.图1是示出一个实施方式的维罗毒素的检测方法的流程的流程图。
16.图2是示出维罗毒素的b亚单位的各亚型的氨基酸序列的表格。
17.图3是实施例1中使用抗维罗毒素2抗体进行纯化操作而得到的试样的质谱图。
18.图4是实施例1中使用抗维罗毒素1抗体进行纯化操作而得到的试样的质谱图。
19.图5是实施例2中使用抗维罗毒素2抗体进行纯化操作而得到的试样的质谱图。
20.图6是实施例2中使用抗维罗毒素1抗体进行纯化操作而得到的试样的质谱图。
具体实施方式
21.以下参照附图对用于实施本发明的方式进行说明。
22.－实施方式－
23.本实施方式的维罗毒素的检测方法中，在进行使用与维罗毒素结合的分子来纯化试样中的维罗毒素的操作后，进行质谱分析。
24.图1是示出本实施方式的维罗毒素的检测方法的流程的流程图。步骤s1001中，准备试样和与维罗毒素结合的分子。
25.(关于试样)
26.试样只要是包含维罗毒素或可能包含维罗毒素的液体或固体等就没有特别限定。例如，试样包括含有肠出血性大肠埃希氏菌或可能含有肠出血性大肠埃希氏菌的液体或固体等。作为可能包含维罗毒素的试样，例如，可包括有食物中毒症状的人类等生物所摄取过或接触过的食品或饮料、以及该生物的呕吐物。进而，由这些试样培养菌而得到的菌液或菌的群落、以及将菌液或菌的群落溶菌而得到的溶菌液也是适合作为本实施方式的方法的对象的试样。通过对可能包含维罗毒素的试样应用本实施方式的方法，并进行维罗毒素的检测或者类型或亚型的识别，从而能够进行成为食物中毒原因的食品或饮料的鉴定、诊断或症状的预测等。还可以对检测出维罗毒素的试样进行本实施方式的方法。例如，利用本实施方式的方法，可以进行如下操作：在检测到的维罗毒素的类型或亚型未知的情况下进行类型或亚型的识别、或对于维罗毒素的研究有用、或对利用其它方法得到的维罗毒素检测结果进行确认。
27.试样包含多种微生物等的情况，在判定1种微生物是否产生维罗毒素时，优选：用平板培养基等培养微生物，回收通过培养而得到的菌落，由此来提取单一种类的微生物。在此情况下，如上所述可以将包含菌落的菌液或使菌落溶菌而得到的溶菌液作为试样。
28.(关于与维罗毒素结合的分子)
29.以下，将与维罗毒素结合的分子称为维罗毒素结合分子。对于维罗毒素结合分子，只要在试样包含维罗毒素的情况下能利用维罗毒素结合分子与维罗毒素的结合来进行试样的纯化就没有特别限定。此处，试样的纯化是指：试样中的除维罗毒素以外的至少一部分分子的浓度与维罗毒素的浓度相比相对降低。
30.维罗毒素结合分子优选为抗体或作为细胞中的维罗毒素的受体的神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide)。以下的实施方式中，“抗体”除了包括igg等免疫球蛋白之
外、还包括虽然不是免疫球蛋白但含有在免疫球蛋白中承担抗原特异性的可变区的免疫球蛋白样分子。
31.可以将能与希望检测的维罗毒素的类型或亚型结合的分子用作维罗毒素结合分子。维罗毒素以包含1个a亚单位和5个b亚单位的方式构成。a亚单位以包含a1亚单位和a2亚单位的方式构成。维罗毒素结合分子可以是与a1亚单位结合的分子，可以是与a2亚单位结合的分子，还可以是与b亚单位结合的分子。
32.图2是示出维罗毒素的类型和亚型、及各类型和亚型的维罗毒素的b亚单位的氨基酸序列的图。维罗毒素1型存在stx1a、stx1c和stx1d的亚型。stx1a的b亚单位具有“tpdcvtgkveytkyndddtftvkvgdkelftnrwnlqslllsaqitgmtvtiktnachngggfsevifr”(序列号1)的氨基酸序列。stx1c的b亚单位具有“apdcvtgkveytkyndddtftvkvgdkelftnrwnlqslllsaqitgmtvtiktnachngggfsevifr”(序列号2)的氨基酸序列。stx1d的b亚单位具有“apdcvtgkveytkyndddtftvkvadkelftnrwnlqslllsaqitgmtvtikttachngggfsevifr”(序列号3)的氨基酸序列。
33.维罗毒素2型存在stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2g的亚型。stx2a的b亚单位具有“adcakgkiefskyneddtftvkvdgkeywtsrwnlqpllqsaqltgmtvtiksstcesgsgfaevqfnnd”(序列号4)的氨基酸序列。stx2b的b亚单位具有“adcakgkiefskynendtftvkvagkeywtnrwnlqpllqsaqltgmtvtiksntcasgsgfaevqfn”(序列号5)的氨基酸序列。stx2c的b亚单位具有“adcakgkiefskynendtftvkvagkeywtsrwnlqpllqsaqltgmtvtiksstcesgsgfaevqfnnd”(序列号6)的氨基酸序列。stx2d的b亚单位具有“adcakgkiefskynendtftvkvagkeywtsrwnlqpllqsaqltgmtvtiksstcasgsgfaevqfnnd”(序列号7)的氨基酸序列。stx2e的b亚单位具有“adcakgkiefskynedntftvkvsgreywtnrwnlqpllqsaqltgmtvtiisntcssgsgfaqvkfn”(序列号8)的氨基酸序列。stx2f的b亚单位具有“adcavgkiefskyneddtftvkvsgreywtnrwnlqpllqsaqltgmtvtiisntcssgsgfaqvkfn”(序列号9)的氨基酸序列。stx2g的b亚单位具有“adcakgkiefskyngdntftvkvdgkeywtnrwnlqpllqsaqltgmtvtiksntcesgsgfaevqfnnd”(序列号10)的氨基酸序列。
34.以下，将与特定的类型或亚型的维罗毒素结合、不与其它类型或亚型结合的情况称为“选择性结合”。维罗毒素结合分子可以是如下抗体：与维罗毒素1型选择性结合的抗体、与维罗毒素2型选择性结合的抗体、或能与维罗毒素1型和2型结合的抗体。维罗毒素结合分子可以是能与stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2g中的至少一者结合的抗体。期望维罗毒素结合分子以与维罗毒素的各类型或各亚型共有的位点作为表位，但不特别限定于此。
35.维罗毒素结合分子可以是单克隆抗体或多克隆抗体。另外，本实施方式中，作为维罗毒素结合分子，可以使用多种分子。维罗毒素结合分子可以包含抗原特异性或结构不同的多种抗体，在此情况下，在后述的纯化操作中，试样将会接触到多种抗体。
36.返回至图1，步骤s1001结束后开始进行步骤s1003。步骤s1003中，进行用于纯化维罗毒素的操作。以下，将该操作称为纯化操作。通过纯化操作，在试样中包含维罗毒素的情况下，维罗毒素将被纯化。
37.对于通过纯化操作进行的维罗毒素的纯化，只要利用维罗毒素结合分子与维罗毒素的结合来进行纯化，其方法就没有特别限定。在纯化操作中，进行使维罗毒素结合分子与
维罗毒素结合的反应。例如，使试样与包含维罗毒素结合分子的溶液接触。通过纯化操作进行的维罗毒素的纯化优选通过利用超滤来分离维罗毒素结合分子与维罗毒素结合而得到的复合物而进行。以下，若简记为复合物则是指维罗毒素结合分子与维罗毒素的复合物。通过纯化操作进行的维罗毒素的纯化可以通过使用维罗毒素结合分子的亲和纯化来进行。亲和纯化的例子可以包括：免疫沉淀法、牵出实验(pull down assay)、以及使用了柱、吸管端部、微型流路或离心柱(spin column)等的亲和色谱法。在使维罗毒素结合分子与维罗毒素结合时，维罗毒素可以是分离成亚单位的状态，还可以是未分离的状态。在进行使维罗毒素结合分子与维罗毒素结合的操作之前，还可以进行使维罗毒素分离成各亚单位的操作。
38.在超滤中，可以通过多孔超滤膜上的细孔使溶解于水中的蛋白质等高分子与微粒分离。出于孔径的偏差、测定的难度的原因，不使用孔径、而是使用截留分子量来作为表示膜的分离性能的指标。超滤膜的各制造商根据各自不同的基准定义了标称截留分子量(nominal molecular weight limit：nmwl)。分子量与截留分子量相同程度的分子有时会透过超滤膜，有时不会透过超滤膜。以下，在将分子量不同的多种标准物质导入超滤膜而得到的截留曲线中，将拦截率为90％的分子量作为截留分子量。
39.使用超滤的方法中，使维罗毒素结合分子与维罗毒素接触并结合后，通过超滤将得到的复合物分离。维罗毒素的a1亚单位的分子量约为28kda，a2亚单位的分子量约为4kda，每个b亚单位的分子量为7500～8000da左右，抗体的igg的分子量约为150kda。因此，复合物的分子量约为150～230kda。因此，纯化操作中的超滤的截留分子量优选10kda～200kda，更优选40kda～150kda，进一步优选70kda～120kda。由此，能够边将复合物保留在超滤膜上，边将质量与维罗毒素的a亚单位或b亚单位的分子量接近的杂质分离在滤液中。其结果，在对残留于超滤膜上的成分进行质谱分析时，能够减少位于源自维罗毒素的a亚单位或b亚单位的离子的m/z附近的对应于杂质的峰。以下使用了m/z作为质荷比，但只要能表示离子的质量与电荷之比就没有特别限定。
40.使用超滤的方法中，优选以使游离的维罗毒素结合分子与游离的维罗毒素在溶液中结合的方式进行反应。由此，与使固定于载体的抗体与维罗毒素结合的情况相比，能够缩短反应时间、迅速地进行维罗毒素的纯化。维罗毒素的快速纯化由于在较短时间内实现维罗毒素的检测，因此在临床方面尤其优选。另外，在进行使维罗毒素与维罗毒素结合分子结合的操作之前还可以进行以下操作：通过微孔过滤或超滤等，去除分子量与抗体为同等程度或更大的分子，或者去除质量大于维罗毒素的分子量的分子。
41.纯化操作中，将复合物分离后，还可以进行将维罗毒素与维罗毒素结合分子分离的操作、以及将维罗毒素分离成各亚单位的操作。这些操作例如可以通过在复合物中加入有机溶剂、或加入硫酸或三氟乙酸(trifluoroacetic acid；tfa)等酸来进行。然而，如下所述在制备maldi用的质谱分析用试样时，维罗毒素会由于基质溶液而与抗体等维罗毒素结合分子分离，而且会分离成各亚单位，因此无需进行这些操作。
42.需要说明的是，步骤s1003中，还可以作为超滤的替代或者除了超滤之外还使用对所透过的分子的分子量具有同等特性的微孔过滤膜来进行微孔过滤。
43.步骤s1003结束后开始进行步骤s1005。步骤s1005中，制备质谱分析用试样。
44.(关于质谱分析用试样的制备)
45.质谱分析用试样的制备只要利用与后述的质谱分析(步骤s1007)中的电离的种类
对应的方法来进行，其方法就没有特别限定。
46.以下，对质谱分析中进行基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption/ionization；maldi)时的例子进行说明。准备通过纯化操作而得到的、包含维罗毒素或可能包含维罗毒素的溶液。使用固相萃取芯片等将该经纯化的溶液脱盐，加入包含基质的溶液(以下称为基质溶液)并滴加至maldi用样品板上使其干燥，由此得到包含试样和基质的晶体。将该晶体作为质谱分析用试样。也可以将通过纯化操作而得到的上述溶液配置于maldi用样品板上后再加入基质溶液。基质的种类没有特别限定，可以适宜使用chca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)、芥子酸或dhb(2,5-二羟基苯甲酸)等。基质溶液的溶剂可以使用在包含数十体积％的乙腈等有机溶剂的水溶液中添加0～3体积％的三氟乙酸(tfa)而得到的溶剂等。
47.需要说明的是，还可以适宜使用用于提高灵敏度等的添加剂来制备质谱分析用试样。
48.步骤s1005结束后开始进行步骤s1007。步骤s1007中，进行纯化操作中得到的试样的质谱分析。将纯化操作中得到的、试样包含维罗毒素时包含维罗毒素的纯化后的级分供于质谱分析。
49.质谱分析的方法只要能对具有与要检测的维罗毒素的亚单位相对应的m/z的离子进行质量分离、检测就没有特别限定。质谱分析可以进行四极杆型、离子阱型或飞行时间型等任意类型的质谱分析。检测1价的离子时，从精度良好地检测数kda以上的高质量的维罗毒素的各亚单位的观点出发，优选飞行时间型质谱分析。本实施方式中，可以通过一个阶段的质谱分析来检测维罗毒素。质谱分析可以通过包括四极杆型、离子阱型或飞行时间型等任意的质谱分析器中的1种以上的质谱仪来进行。在质谱分析之前还可以进行液相色谱法等色谱法。
50.质谱分析中的电离的方法没有特别限定，可以进行maldi或电喷雾电离法(electrospray ionization；esi)等。从容易生成1价的离子且能够获得容易解析的数据的观点出发，优选maldi。maldi的情况，对如上所述而制得的质谱分析用试样照射激光束，使试样电离。
51.质谱分析中，优选通过对要质量分离的离子的m/z进行扫描来获得用于得到质谱图的数据。将质谱分析中得到的数据称为质谱分析数据。质谱分析数据存储于能由电子计算机等处理装置参照的存储介质中。
52.步骤s1007结束后开始进行步骤s1009。步骤s1009中，对质谱分析数据进行解析。质谱分析数据的解析可通过电子计算机等处理装置来进行。优选基于质谱分析数据来制作对应于质谱图的质谱数据。例如，飞行时间型质谱分析的情况下，质谱分析数据中飞行时间与在各飞行时间处检测出的离子的检测信号的强度相互关联。可以基于预先得到的校准数据将飞行时间转换为m/z，获得m/z与强度相互关联的质谱数据。
53.基于源自维罗毒素的各类型或各亚型的a1亚单位、a2亚单位或b亚单位的离子的m/z，可判定是否检测出了具有处于基于质谱分析的精度的允许范围内的m/z的离子。在检测出了在该允许范围内具有m/z的离子时，可认为检测出了对应的类型或亚型的维罗毒素。源自各类型或亚型的各亚单位的离子的m/z可以使用过去的实测值或基于各类型或亚型的分子量(参照图2)而计算出的值。例如，maldi的情况下，对于检测在各亚单位上添加了质子
的1价离子而言，可以使用在各亚单位的分子量上加上质子的分子量而得到的值。还可以添加除质子以外的阳离子或阴离子等。如此，基于检测出的维罗毒素的质荷比，可识别维罗毒素的类型或亚型中的至少一者。特别是检测1价的离子时，能够精度良好地检测分子量小的b亚单位，因此优选。
54.需要说明的是，还可以将在不使用与检测对象即维罗毒素结合的维罗毒素结合分子的情况下进行与纯化操作相同步骤的操作而得到的对照试样供于质谱分析。例如，可以在试样中加入不与维罗毒素结合的分子代替维罗毒素结合分子，并进行上述超滤，将残留于超滤膜的成分供于质谱分析。将上述的步骤s1007的质谱分析作为第1质谱分析，将对照试样的质谱分析作为第2质谱分析。基于第1质谱分析中得到的质谱分析数据与第2质谱分析中得到的质谱分析数据的比较，可以判定试样中是否包含维罗毒素。例如，对第1质谱分析中得到的质谱与第2质谱分析中得到的质谱进行比较，在前者存在对应于维罗毒素的峰且后者不存在对应于维罗毒素的峰时，可以认为试样中包含维罗毒素。由此，通过与对照试样的比较，能够进行更可靠的维罗毒素的检测。
55.(方式)
56.本领域技术人员可以理解，上述多种例示性实施方式或其变形是以下的方式的具体例。
57.(第1项)一个方式的维罗毒素的检测方法具备：准备试样和与维罗毒素结合的分子；进行利用前述分子与维罗毒素的结合来纯化前述试样中的维罗毒素的操作；将前述操作中得到的前述试样供于第1质谱分析。由此，能够使用质谱分析更准确地进行维罗毒素的检测。
58.(第2项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第1项的方式的维罗毒素的检测方法中具备：基于前述第1质谱分析中检测到的维罗毒素的质荷比，识别维罗毒素的类型和亚型中的至少一者。由此，能够更准确地进行维罗毒素的类型或亚型的检测。
59.(第3项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第1项或第2项的方式的维罗毒素的检测方法中，与前述维罗毒素结合的分子为抗体和神经酰胺三己糖苷中的至少一者。由此，能够充分利用抗原-抗体反应或配体-受体反应的特异性更可靠地进行维罗毒素的纯化。
60.(第4项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第3项的方式的维罗毒素的检测方法中，前述抗体为多克隆抗体。由此，与单克隆抗体相比，能够迅速且容易地制作。
61.(第5项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第3项或第4项的方式的维罗毒素的检测方法中，前述与维罗毒素结合的分子是能与维罗毒素1型和维罗毒素2型中的至少一者结合的抗体。由此，能够检测在试样中是否存在维罗毒素1型、维罗毒素2型或它们两者。
62.(第6项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第4项或第5项的方式的维罗毒素的检测方法中，前述纯化中，使多种抗体与前述试样接触。由此，能够进一步可靠地进行维罗毒素的检测。
63.(第7项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第1项至第6项中任一项的方式的维罗毒素的检测方法中，前述操作中，将包含前述分子与维罗毒素结合而成的结合分子的溶液供于超滤和微孔过滤中的至少一者。由此，利用维罗毒素的各亚单位的分子量与
复合物的分子量的差异，从试样中去除分子量在维罗毒素的各亚单位的分子量附近的分子，能够精度良好地进行质谱分析数据的解析。
64.(第8项)在另一个方式的维罗毒素的检测方法中，在第1项至第7项中任一项的方式的维罗毒素的检测方法中具备：将在不使用前述分子的情况下进行与前述操作同样的操作而得到的溶液供于第2质谱分析；基于前述第1质谱分析中得到的数据与前述第2质谱分析中得到的数据的比较，判定在前述试样中是否包含维罗毒素。由此，能够确认对应于源自维罗毒素的离子的m/z的峰是否为对应于维罗毒素的峰，能够更可靠地进行维罗毒素的检测。
65.本发明不限定于上述实施方式的内容。在本发明的技术构思的范围内考虑出的其它方式也包括在本发明的范围内。
66.[实施例]
[0067]
以下示出本实施方式的实施例，但并非意图使本发明限定于下述的实施例。
[0068]
(实施例1)
[0069]
实施例1中，分别使用抗维罗毒素1抗体和抗维罗毒素2抗体对未知的试样进行纯化操作，通过质谱分析检测了维罗毒素。按以下的1-5的顺序进行了各操作。
[0070]
1.在脑心浸液(bhi：brain heart infusion)琼指培养基中培养源自肠出血性大肠埃希氏菌感染症的患者的大肠杆菌株。将通过培养而形成的菌落悬浮于多粘菌素b溶液中30分钟，然后供于离心分离，将其上清液作为试样溶液。
[0071]
2.将1.中得到的试样溶液以每管150μl的方式分注于2根管中，在各管中加入包含5mm的正辛基-β-d-葡萄糖苷的pbs缓冲溶液150μl。将得到的溶液用于超滤装置(nmwl：100k da，merck millipore、ufc510096)，将2根管同时供于离心分离(14000g、5分钟)。
[0072]
3.在2.的离心分离中得到的滤液的一者中加入0.5μg的抗维罗毒素1抗体(nacalai tesque、01770-74)，在另一者中加入0.5μg的抗维罗毒素2抗体(nacalai tesque、01771-64)，分别孵育30分钟。
[0073]
4.将3.的孵育后的溶液用于新的超滤装置(nmwl：100k da)，将2根管同时供于离心分离。离心分离后，在超滤的过滤器内的残渣液中加入100μl的包含2.5mm的正辛基-β-d-葡萄糖苷的pbs缓冲溶液并回收全部量。
[0074]
5.使用固相萃取芯片(agilent technologies、bond elut omix、a57009100)将4.中回收的溶液脱盐。将脱盐后的洗脱液滴加至不锈钢板上，通过质谱仪(岛津制作所、maldi-8020)供于质谱分析而得到质谱图。
[0075]
图3是使用抗维罗毒素2抗体进行纯化操作时的质谱分析中得到的质谱图，图4是使用抗维罗毒素1抗体进行纯化操作时的质谱分析中得到的质谱图。质谱图是横轴表示检测出的离子的m/z、纵轴表示该离子的检测信号的强度的图，在图3～图6的各图中同样。图3与图4的比较中，仅图4中以高强度观察到m/z 7692.1的峰p1，其它峰几乎为相同程度的强度。将该峰p1作为源自维罗毒素的峰的候补并与图2的表格进行比较，判断峰p1源自stx1a型的维罗毒素的b亚单位。即，得到如下结论：从该实施例1中使用的试样中检测出维罗毒素，其类型和亚型为stx1a。
[0076]
(实施例2)
[0077]
实施例2中，分别使用抗维罗毒素1抗体和抗维罗毒素2抗体对已知的试样进行纯
化操作，通过质谱分析检测了维罗毒素。按以下的1-5的顺序进行了各操作。
[0078]
1.在tsa(trypticase soy agar，胰胨大豆琼脂)平板培养基中培养通过基因检测而判断具有stx1c的基因的大肠杆菌株。将通过培养而形成的菌落悬浮于生理盐水中，使用超声波破碎装置进行溶菌，得到试样溶液。
[0079]
2.将1.中得到的试样溶液以每管150μl的方式分注于2根管中，在各管中加入包含5mm的正辛基-β-d-葡萄糖苷的pbs缓冲溶液150μl。将得到的溶液用于超滤装置(nmwl：100k da，merck millipore、ufc510096)，将2根管同时供于离心分离(14000g、5分钟)。
[0080]
3.在2.的离心分离中得到的滤液的一者中加入0.5μg的抗维罗毒素1抗体(nacalai tesque、01770-74)，在另一者中加入0.5μg的抗维罗毒素2抗体(nacalai tesque、01771-64)，分别孵育30分钟。
[0081]
4.将3.的孵育后的溶液用于新的超滤装置(nmwl：100k da)，将2根管同时供于离心分离。离心分离后，在超滤的过滤器内的残渣液中加入100μl的包含2.5mm的正辛基-β-d-葡萄糖苷的pbs缓冲溶液并回收全部量。
[0082]
5.使用固相萃取芯片(agilent technologies、bond elut omix、a57009100)将4.中回收的溶液脱盐。将脱盐后的洗脱液滴加至不锈钢板上，通过质谱仪(岛津制作所、maldi-8020)供于质谱分析而得到质谱图。
[0083]
图5是使用抗维罗毒素2抗体进行纯化操作时的质谱分析中得到的质谱图，图6是使用抗维罗毒素1抗体进行纯化操作时的质谱分析中得到的质谱图。图5与图6的比较中，仅图6中以高强度观察到m/z 7662.4的峰p2，其它峰几乎为相同程度的强度。将该峰p2作为源自维罗毒素的峰的候补并与图2的表格进行比较，判断峰p2源自stx1c型的维罗毒素的b亚单位。即，得到如下结论：从该实施例2中使用的试样中检测出stx1c的维罗毒素，表达了与基因检测的结果相同的类型和亚型的维罗毒素。