一种乳酸残留量的检测方法与流程

[0001]
本申请涉及透明质酸的检测领域，且更为具体地涉及一种乳酸残留的检测方法。


背景技术：

[0002]
透明质酸(hyaluronic acid，简称ha)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-d-葡萄糖(1-4)-d-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于ha具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品、医药和临床治疗等行业领域。
[0003]
ha最初是从鸡冠、眼球等动物组织中提取的，由于这些原料来源有限，且成本高，用提取法生产已不能满足日益增加的ha在医药和化妆品生产方面的需要。为了扩大生产规模，降低生产成本，发酵法生产ha的工艺迅速发展起来。ha发酵使用的菌种为链球菌，其在发酵过程中产生小分子有机酸的总量远大于ha。在现有生产工艺条件下，发酵液中ha的产量达到6～10g/l，而乳酸的含量则为30～40g/l。发酵结束后，一般使用乙醇将ha沉淀并进一步纯化，乳酸做为发酵液中含量最高的有机酸，对成品ha中的乳酸残留量进行检测可反映纯化工艺效果及产品杂质控制程度。
[0004]
目前，小分子有机酸的检测分析一般采用rp-c18色谱柱，流动相以ph为2～3的甲醇/乙腈-稀酸溶液为主，色谱填料长期在低ph环境下使用易造成键合相的水解，导致柱效不断下降。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述问题，本申请的申请人在日常分析工作中偶然发现一种阳离子交换色谱柱，在较高柱温下对乳酸的分析效果好，柱效高，且耐用性强，流动相中不需要添加有机相，由此建立了上述方法，用于透明质酸相关产品中乳酸残留的检测。
[0006]
为了解决上述技术问题，本申请专利采用的技术方案是：
[0007]
1、一种乳酸残留量的检测方法，其特征在于，包括：
[0008]
利用无水乙醇提取待测样品中的乳酸，制备待测溶液；
[0009]
使用高效液相色谱对待测溶液进行检测；
[0010]
基于检测结果计算所述待测样品中乳酸的残留量。
[0011]
2、根据项1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中包含有透明质酸。
[0012]
3、根据项1所述的方法，其特征在于，所述待测溶液的制备中，向每10g所述待测样品中加入40～100ml的所述无水乙醇。
[0013]
4、根据项1所述的方法，其特征在于，所述待测溶液的制备中，将所述待测样品加
入到所述无水乙醇中，混合均匀，形成混合溶液，然后将混合溶液密封，并进行超声处理，之后将混合溶液转移到容量瓶中，并用无水乙醇定容，然后取上清液挥干，得到固体混合物，之后用弱酸溶液溶解所述固体混合物，并定容，然后过滤，得到的滤液为待测溶液。
[0014]
5、根据项4所述的方法，其特征在于，所述超声处理时间为15～40min。
[0015]
6、根据项4所述的方法，其特征在于，所述弱酸溶液为磷酸溶液，所述磷酸溶液的浓度为0.5wt％～1.2wt％。
[0016]
7、根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱为阳离子交换色谱柱。
[0017]
8、根据项7所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换色谱柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子h
+
型交换色谱柱。
[0018]
9、根据项7-8任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换色谱柱为mci gel ck08eh色谱柱。
[0019]
10、根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流动相为弱酸溶液。
[0020]
11、根据项10所述的方法，其特征在于，所述流动相为磷酸溶液，所述磷酸溶液的浓度为0.5wt％～1.2wt％，优选为0.8wt％～1.0wt％。
[0021]
12、根据项10-11中任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.4～0.8ml/min。
[0022]
13、根据项1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱中使用的色谱柱的柱温为70℃～95℃，优选为75℃～90℃。
[0023]
14、根据项1所述的方法，其特征在于，在高效液相色谱中的检测波长为190～220nm，进样量为5～100μl。
[0024]
15、根据项1～14中任一项所述的方法，使用外标法来计算所述待测样品中的乳酸的残留量。
[0025]
16、根据项1～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述乳酸残留量的检测限为5～8ppm。
[0026]
本申请使用无水乙醇对待测样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到杂质残留量，方法灵敏度高。因采用阳离子交换色谱柱做为分析柱，在较高柱温下对乳酸的分析效果好，柱效高，且耐用性强，流动相仅采用稀酸溶液，不需要使用一定比例的有机相如甲醇乙腈等，可以增加色谱柱的使用寿命，且实验过程安全性更高。运用该色谱条件，所得检测物峰形较好，能提高乳酸的检测灵敏度，可以对极低含量的乳酸含量进行检测。
附图说明
[0027]
图1为实施例1的液相色谱图。
[0028]
图2为对比例1的液相色谱图。
具体实施方式
[0029]
在本说明书的上下文中，色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合
物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
[0030]
高效液相色谱法(hplc)是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9
×
107pa)；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。
[0031]
无水乙醇为无色澄清液体，有特殊香味，易流动，极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。能与水形成共沸混合物(含水4.43％)，共沸点78.15℃，熔点-114.1℃，沸点78.5℃。
[0032]
乳酸学名：2-羟基丙酸，是一种化合物，它在多种生物化学过程中起作用。它是一种羧酸，分子式是c3h6o3。它是一个含有羟基的羧酸，因此是一个α-羟酸(aha)。在水溶液中它的羧基释放出一个质子，而产生乳酸根离子ch3chohcoo-。在发酵过程中乳酸脱氢酶将丙酮酸转换为左旋乳酸。在一般的新陈代谢和运动中乳酸不断被产生，但是其浓度一般不会上升。
[0033]
外标法是仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
[0034]
以下将对本申请做以详细说明。
[0035]
根据本申请提供一种乳酸残留量的测定方法，其包括：首先利用无水乙醇对透明质酸样品中的乳酸进行提取浓缩，得到待测液体，待测液体中不含透明质酸；然后使用用于分析有机酸的离子交换色谱柱，利用不含有机相的流动相，检测待测液体中的乳酸含量。同时制备乳酸的对照品溶液(对照品溶液的制备方法：精密称取乳酸对照品约50mg于50ml容量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，混匀，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液)；然后再使用高效液相色谱检测所得到的待测溶液和对照品溶液，最后基于色谱检测结果使用外标法确定所述待测样品中的乳酸的残留量。
[0036]
本申请的方法，使用用于分析有机酸的离子交换色谱柱，对由无水乙醇提取的透明质酸中的乳酸进行检测，避免了透明质酸的溶解对后续检测的不利影响，延长了色谱柱的使用寿命，并避免了分析过程中甲醇等有害试剂的使用。
[0037]
本申请使用无水乙醇对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高。
[0038]
在本申请中，所述待测样品中包含有透明质酸。所述待测样品主要成分为透明质酸，本发明的目的是在于检测透明质酸中乳酸的残余量。
[0039]
在本申请中，所述待测溶液的制备中，向每10g所述待测样品中加入40～100ml的所述无水乙醇。其中，“无水乙醇”是指乙醇(酒精)含有为99.5％以上的乙醇。通过使用无水
乙醇而不是其他有机溶剂来提取透明质酸中的乳酸，能够将透明质酸样品中的乳酸更充分地提取出来，使得检测更加准确。而且避免对透明质酸本身的影响。
[0040]
在本申请中，所述待测溶液的制备中，将所述待测样品加入到所述无水乙醇中，混合均匀，形成混合溶液，然后将混合溶液密封，并进行超声处理，之后将混合溶液转移到容量瓶中，并用无水乙醇定容，然后取上清液挥干，得到固体混合物，之后用弱酸溶液溶解所述固体混合物，并定容，然后过滤，得到的滤液为待测溶液。
[0041]
超声处理的时间例如为15～40min，优选为20～35min，特别优选为30min。
[0042]
本申请中超声处理为超声波萃取，超声波萃取利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。
[0043]
所述超声处理的时间会影响乳酸的提取效果，当超声处理时间较短时，会导致乳酸的提取不完全。超声时间的确定：通过进行5min、10min、30min、60min超声处理的对比试验，得出结论：在超声处理前10min乳酸浓度上升明显，超声时间在10min～60min时乳酸浓度变化不大，在30min左右时达到峰值。
[0044]
在本申请中，所述弱酸溶液为磷酸溶液，优选浓度为0.5wt％～1.2wt％的磷酸溶液。所述磷酸溶液的浓度可以为0.5wt％、0.55wt％、0.6wt％、0.65wt％、0.7wt％、0.75wt％、0.8wt％、0.85wt％、0.9wt％、0.95wt％、1wt％、1.05wt％、1.1wt％、1.15wt％、1.2wt％。
[0045]
在本申请中，上述用于分析有机酸的离子交换色谱柱可以为阳离子交换色谱柱，特别可以为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型交换色谱柱。例如为mci gel ck08eh色谱柱(8
×
300mm，5μm)。mci gel ck08eh色谱柱是日本三菱化学生产的属于ck08e系列的阳离子交换色谱柱，是磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型交换色谱柱。
[0046]
在本申请中，高效液相色谱的流动相为弱酸溶液，所述磷酸的浓度为0.5wt％～1.2wt％，优选为0.8wt％～1.0wt％。
[0047]
所述磷酸的浓度可以为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.1wt％、1.2wt％。
[0048]
由于高效液相色谱的流动相中不添加任何有机相如甲醇和乙腈，由此能够有效地防止使用中有机试剂的挥发对实验人员的潜在危害。氢型阳离子交换色谱柱在与流动相中的待测物质进行离子交换时会损失表面结合的h
+
，因此一般离子交换色谱柱在使用一段时间后需要用酸溶液再生，而使用浓度较高的磷酸不需要增加再生步骤，且对于色谱柱具有一定的保护作用，高浓度磷酸做流动相的色谱柱寿命一般在3600h以上，比低浓度磷酸做流动相的色谱柱寿命提高近30倍。
[0049]
在本申请中，采用的色谱条件为：流动相的流速为0.3～1.0ml/min，进一步优选为0.4～0.8ml/min。高效液相色谱中使用的柱温为70℃～95℃，优选为75℃～90℃。柱温较高时，流动相中的离子热运动加快，单位时间内和树脂基团的交换频率增加，因此柱效得到提升，使得乳酸峰宽变窄，峰型更加对称，色谱峰面积计算更加准确。
[0050]
检测波长为190～220nm，例如为210nm，进样量为5～100μl，例如为20μl。在该条件
下能够更加准确地测定乳酸。
[0051]
通过在该色谱条件下检测透明质酸中的乳酸，能够更加准确，其检测精度可低至5ppm。由于透明质酸溶液特别粘稠，为凝胶状物质，即使1％的透明质酸溶液也会很粘稠，无法进行过滤和萃取，如果降低透明质酸浓度得到适当粘度溶液，会造成检测限大幅度提升，无法满足检测要求。本申请采用无水乙醇萃取透明质酸中乳酸并浓缩的制样方法可以解决以上问题并保证达到较低的检测限。
[0052]
在本发明的实施方式中，使用外标法来计算所述待测样品中的乳酸的残留量。
[0053]
利用本申请的测定透明质酸中乳酸残留量的方法，使用用于分析有机酸的离子交换色谱柱，在较高柱温下对乳酸的分析效果好，柱效高，且耐用性强，能够利用不含有机相的弱酸溶液将乳酸洗脱，减少有机试剂的使用量。利用本申请的方法，其中使用的色谱柱可以长期运行，不会出现柱效下降等情况。
[0054]
以下利用实施例对本申请做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。在本申请中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。
[0055]
色谱柱的寿命一般由理论塔板数和柱压决定：液相色谱柱一般柱效低于2000且再生后无法恢复柱效则判断报废；另外，色谱柱的柱压在相同使用条件下明显升高且再生后效果不明显时判断色谱柱报废。
[0056]
实施例
[0057]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
[0058]
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059]
实施例1
[0060]
1、试剂及材料
[0061]
无水乙醇(天津科密欧)、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)
[0062]
2、色谱条件
[0063]
色谱柱：mci gel ck08eh色谱柱(三菱化学，8
×
300mm，5μm)；
[0064]
流动相：1％磷酸溶液；
[0065]
流速：0.6ml/min；
[0066]
进样量：20μl；柱温：80℃；
[0067]
检测波长：210nm。
[0068]
3、溶液配制
[0069]
对照品溶液：精密称取乳酸对照品约50mg于50ml容量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，混匀，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。
[0070]
供试品(也可以称为待测样品)溶液：精密称取供试品10g至50ml容量瓶中，加入40ml无水乙醇，混匀密封，超声提取30min，无水乙醇定容至刻度。取上清液20ml挥干，用流动相溶解定容至2ml。0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
[0071]
4、测定
[0072]
分别取对照品、供试品溶液20μl进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面
积计算供试品中乳酸残留量。
[0073]
5、计算
[0074]
按以下公式计算供试品中的乳酸残留量：
[0075][0076]
式中，x—供试品中乳酸根残留，μg/g
[0077]
as—供试品溶液峰面积
[0078]
ar—对照品溶液峰面积
[0079]
wr—对照品称样量，μg
[0080]
z—对照品含量
[0081]
ws—供试品称样量，g
[0082]
6、结果
[0083]
供试品中乳酸含量检测结果如表1所示。另外，色谱图如图1所示。
[0084]
表1实施例1中供试品的色谱分析结果
[0085][0086]
注：检测限为信噪比(s/n)为3时的乳酸残留量。
[0087]
以上述条件持续对不同的待测样品进行检测，色谱柱合计运行时间超过3600小时，色谱柱仍然正常运行。
[0088]
实施例2(柱温70℃)
[0089]
将实施例1中的柱温设置为70℃，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0090]
表2实施例2中供试品的色谱分析结果
[0091][0092]
小结：由表2可知当柱温为70℃时，乳酸峰宽较实施例1稍宽，峰面积稍大，检测到供试品中乳酸的残留量为8.0，结果在检测偏差允许范围内。
[0093]
实施例3(柱温95℃)
[0094]
将实施例1中的柱温设置为95℃，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0095]
表3实施例3中供试品的色谱分析结果
[0096][0097]
小结：由表3可知当柱温为95℃时，与实施例1相比，乳酸峰形对称性稍差，检测到供试品中乳酸的残留量为8.0，检测结果在偏差允许范围内，但两个平行样的相对偏差接近2％，可能与柱温接近水沸点有关，导致进样体积精准度变差。
[0098]
实施例4(柱温90℃)
[0099]
将实施例1中的柱温设置为90℃，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0100]
表4实施例4中供试品的色谱分析结果
[0101][0102]
小结：由表4可知当柱温为90℃时，检测到供试品中乳酸的残留量为8.1，与实施例1检测结果相同。
[0103]
实施例5(柱温75℃)
[0104]
将实施例1中的柱温设置为75℃，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0105]
表5实施例5中供试品的色谱分析结果
[0106][0107]
实施例6(0.8％磷酸溶液)
[0108]
将实施例1中的磷酸浓度设置为0.8％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0109]
表6实施例6中供试品的色谱分析结果
[0110][0111]
实施例7(0.9％磷酸溶液)
[0112]
将实施例1中的磷酸浓度设置为0.9％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残
留量。
[0113]
表7实施例7中供试品的色谱分析结果
[0114][0115]
小结：由表7可知当流动相为0.9％磷酸溶液时，检测到供试品中乳酸的残留量为8.1，比实施例1检测到的结果相同。
[0116]
实施例8(1.2％磷酸溶液)
[0117]
将实施例1中的磷酸浓度设置为1.2％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0118]
表8实施例8中供试品的色谱分析结果
[0119][0120]
实施例9(0.5％磷酸溶液)
[0121]
将实施例1中的磷酸浓度设置为0.5％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0122]
表9实施例9中供试品的色谱分析结果
[0123][0124]
对比例1
[0125]
将实施例1中的柱温设置为40℃，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0126]
检测结果如表10以及图2所示。
[0127]
表10对比例1中供试品的色谱分析结果
[0128][0129]
小结：在温度低于70℃的色谱条件下乳酸色谱峰出现明显的拖尾和展宽，柱效下
降造成检测结果出现偏差。
[0130]
对比例2
[0131]
将实施例1中的流动相浓度设置为0.01％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0132]
表11对比例2中供试品的色谱分析结果
[0133][0134]
小结：在流动相浓度为0.01％的色谱条件下峰形较差，供试品乳酸残留量较低，没有明显色谱峰致无法积分。
[0135]
对比例3
[0136]
将实施例1中的柱温设置为40℃，流动相浓度设置为0.01％，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0137]
表12对比例3中供试品的色谱分析结果
[0138][0139]
小结：在流动相浓度为0.01％，柱温为40℃的色谱条件下，在检测时间内乳酸未出峰。
[0140]
对比例4
[0141]
将实施例1中的乳酸提取溶剂替换为甲醇(毒性较乙醇大)，其它条件同实施例1，检测供试品中乳酸残留量。
[0142]
表13对比例4中供试品的色谱分析结果
[0143][0144][0145]
表14各实施例的色谱条件以及运行效果比较
[0146][0147]
*指色谱柱使用120h后需要再生处理
[0148]
小结：由上表可知，采用柱温为70℃-95℃、流动相浓度为0.5％-1.2％范围内的色谱条件，检测供试品中的乳酸残留，检测灵敏度高，柱子寿命长，并且具有良好的峰型，尤其在柱温为75℃-90℃、流动相浓度为0.8％-1.0％的色谱条件下，具有极低的检测限和较高的柱效，即更高的灵敏度，同时流动相中一定浓度的磷酸可保持阳离子交换色谱柱的活性，不需要额外的色谱柱再生过程，提高连续检测的可行性，延长色谱柱使用寿命。因此通过本申请的乳酸残留量的检测方法，可以获得更低的检测限即更高的方法灵敏度，同时延长色谱柱的使用寿命。