一种单细胞温度检测传感器的制作方法

[0001]
本实用新型涉及细胞检测与传感器技术领域，具体涉及一种单细胞温度检测传感器。


背景技术：

[0002]
在生物学领域，温度是生命科学领域研究生物体生命进程不可或缺的重要指标之一。在生命科学研究中，一方面，活细胞内不断进行着各式各样的生理、化学反应，与这些反应密切相关的能量变化的外在表现即为温度的改变。另一方面，受到外界刺激的情况下，细胞会迅速调整其代谢活动以应对环境变化，同样也会伴随着明显的温度变化。因此，实现单个细胞温度的实时检测，无论是对于细胞生理功能及异质性研究，还是从细胞对外界环境的适应性和应激反应的角度出发，都具有重要意义。
[0003]
传统的细胞温度测量方法，主要有基于荧光材料和纳米探针测量细胞温度。而荧光材料与细胞温度之间的线性度不够高，进而影响细胞温度的准确性；纳米探针的方法会破坏细胞结构，不适合检测细胞分裂增殖过程中温度的变化。单细胞自身温度变化微小，容易受到细胞外环境温度的影响，所以单细胞温度检测方法需要精度高、响应速度快，才能准确检测到细胞的温度波动。目前还没有形成成熟有效的检测手段。
[0004]
随着微流控和微机械加工技术的不断完善和发展，微全分析系统（micro total analysis system，μ-tas）在细胞水平上的生物学研究和临床实验诊断等领域里的优势日趋显著。微流控芯片因功能单元尺寸与细胞大小相当、精度高和检测快速方便等优点，在细胞分析方面表现出了明显的优势。该技术可以将现行所有的细胞分析步骤和过程（如细胞操纵、细胞捕捉/筛选、细胞培养以及在线实时动态监测分析等）整合于一块微芯片上，实现分析操作的一体化，可以减少操作过程中对细胞样本的损伤和污染，非常适合少量细胞特征参数的快速高灵敏检测。本实用新型单细胞温度检测传感器就是此种微流控传感器，也叫作微流控芯片。
[0005]
目前，针对单细胞检测发展了一系列新型的微流控芯片及装置，主要可以分为以下几类：（1）利用乳液滴单元，包裹单个细胞，为细胞检测提供独立的空间。再利用微结构操纵液滴融合，实现单细胞的裂解和核酸扩增，如专利文献cn109988821a。（2）利用微腔结构单元，捕获单个细胞，再通过微阀结构控制特定通道开闭，通入裂解液裂解细胞并驱动裂解产物流入微反应腔内扩增，如专利文献cn106065391a。（3）利用介电电泳原理，在微芯片内集成电极，捕获单细胞，然后施加高电压裂解细胞，如专利文献cn107267382a。而微流控芯片内细胞基因检测方法主要有：（1）在核酸扩增试剂中加入特异性taqman探针，根据荧光信号分析基因表达。（2）回收核酸扩增产物，采用二代测序技术检测目标核酸。（3）采用原位核酸杂交技术，无需裂解细胞即可分析基因。
[0006]
以上这些应用于单细胞基因检测的微流控装置，仍旧存在以下几点问题：1）能够实现单细胞检测一体化的芯片，结构复杂，需要外接的进样或者操控设备。2）结构简单的芯片只是实现了单细胞捕获和裂解，没有将所有检测步骤集成化。
[0007]
聚二甲基硅氧烷，英文名称polydimethylsiloxane，简称pdms。是一种高分子有机聚合物，具有光学透明与内部细微结构的多孔性，而且生物兼容性很好。pdms的应用包括在生物微机电中的微流道系统、填缝剂、润滑剂、隐形眼镜。液态时的二甲基硅氧烷为一黏稠液体，称做硅油，是一种具有不同聚合度链状结构的有机硅氧烷混合物，其端基和侧基全为烃基（如甲基、乙基、苯基等）。


技术实现要素：

[0008]
本实用新型所要解决的技术问题是提供一种单细胞温度检测传感器，将单细胞捕获、裂解、温度检测功能集成于一体，解决现有技术存在的芯片结构复杂和步骤繁琐等问题。
[0009]
为了解决上述技术问题，本实用新型单细胞温度检测传感器所采用的技术方案为：
[0010]
一种单细胞温度检测传感器，包括相互贴合的玻璃基片(1)与pdms片(2)，所述玻璃基片(1)的贴合面上溅射有用于导电和温度传感的pt电极块(3)及其引出线(4)，所述pdms片(2)的贴合面为开槽结构面，所述pdms片(2)的贴合面开设流槽(7)，与所述玻璃基片(1)贴合后在玻璃基片(1)上面形成检测时供单细胞溶液流经的流道，流槽(7)的两端分别开设打穿pdms片(2)的通孔，形成进样孔(5)与出样孔(6)；其特征在于，所述流槽(7)中设置供单细胞流入并留置的开口围坝，所述开口围坝的开口朝向进样注入方向；所述开口围坝位于所述玻璃基片(1)的上的pt电极块(3)上方，开口围坝与玻璃基片(1)之间保留检测时供试样流体与空气流过的高度间隙，所述高度间隙小于待测单细胞的外径。
[0011]
以下为本实用新型单细胞温度检测传感器进一步的方案：
[0012]
所述开口围坝为设有开口的呈c字形圆环的c型坝(8)，c型坝(8)的开口宽度大于c型坝(8)的坝内半径；或者，所述开口围坝为一边开口的呈口字形方环的方型坝，方型坝的开口宽度大于c型坝(8)的开口边内侧边长的一半。
[0013]
所述开口围坝的坝高度为50um，所述开口围坝与玻璃基片(1)之间的高度间隙为5um；所述c型坝(8)的坝内直径为150um，或者，方型坝的内侧边长为150um。
[0014]
所述流槽(7)包括进样段(7a)、出样段(7b)和分为对称分布的2路检测段(7c)，所述检测段(7c)流槽(7)围成矩形，矩形的下边流槽(7)经进样段(7a)流槽(7)连接进样孔(5)，矩形的上边流槽(7)经出样段(7b)流槽(7)连接出样孔(6)；矩形的2侧边流槽(7)中分别设置所述开口围坝。
[0015]
所述pt电极块(3)包括先溅射在玻璃基片(1)上面的一层厚度为500a的ti层作为粘附层，与溅射厚度为1500a的pt层，共同形成一层厚度为500/1500a的ti/pt工作层，并在ti/pt工作层上面沉积一层厚度为5000a的si3n4层(12)，作为绝缘层。
[0016]
所述pt电极块(3)呈pt丝来回迂回折返的形状，pt电极块(3)的两端分别连接其2侧引出线(4)，2侧引出线(4)搭成人字形，pt电极块(3)位于人字形的顶端，2侧引出线(4)的底端位于玻璃基片(1)的侧边缘。
[0017]
本实用新型单细胞温度测量微流控传感器包含两个主要功能模块：单细胞捕获和原位培养模块，高精度温度测量传感模块。温度测量传感模块包含由pt制备的pt电极块(3)和si3n4的隔离层；单细胞捕获及培养模块由pdms制备而成的微流控通道组成。采用微纳加
工工艺，以玻璃为衬底制备基于pt1000的微电极体系，以图形化的硅片为模具制备单细胞捕获及培养芯片，两个模块通过对准键合形成完整的微流控传感器。该芯片可检测单细胞生命活动过程中（生长、增殖及受药物刺激等）微小的温度波动，并能实现对温度指标的在线连续监测。
[0018]
本实用新型单细胞温度测量微流控传感器是一款基于mems工艺制备的单细胞温度高精度检测芯片，利用金属材料pt温度—电阻的线性度＞0.999这一物理特性，还可以在不影响细胞正常生理功能的前提下，实时在线连续监测单细胞温度变化，可实时在线连续监测细胞在行使正常生理功能过程中的温度变化。主要由两部分器件键合而成，分别是玻璃片上的电极层和具有特定通道的pdms层。前者利用光刻、溅射、和湿法去胶工艺，后者则是利用光刻、深反应离子刻蚀（drie）、su8胶光刻工艺。虽然同为光刻工艺，但两者处理上却有明显不同。为方便在显微镜下观察细胞形态，电极部分溅射在玻璃片上，并在pt电极上做一层si3n4，防止电极与水接触后导电。以上完成后将玻璃片划片。在硅片上光刻出需要的结构后，通过环氧胶倒模工艺，将硅片模具上的图案结构转移到pdms上，此时在pdms薄膜上会出现所需要的微流控芯片通道，用切割刀将固化好pdms薄膜切割好并打孔。最后将处理好的pdms芯片和划片好的电极芯片进行等离子体清洗，清洗后快速在显微镜下对准键合，然后置于105℃热板上加热2h，使两者键合牢固。
[0019]
因细胞的直径大于c型坝结构下的通道高度，因此可将细胞截留在c型坝结构内，而结构内的基底层覆盖了pt电极，因此该微流控芯片可以精确的测量粘附细胞生长、增殖过程中的温度变化情况。将已进样细胞的芯片放在恒温水箱中，使用电化学工作站的恒电流法进行测量，得到细胞温度的变化情况。通过这种保持环境温度稳定的措施和高性能pt微电极阵列器件，实现系统的热稳定性，实时检测细胞在正常生理活动中（代谢、分裂、凋亡等）以及药物刺激下的温度变化情况。此外，本实用新型，并且可批量化制造，成本低，检测灵敏度高等特点，具有重要的实际应用价值。
附图说明
[0020]
图1为本实用新型单细胞温度检测传感器外观立体示意图。
[0021]
图2为本实用新型单细胞温度检测传感器pdms片与玻璃基片分离状态立体示意图。
[0022]
图3为pdms片立体示意图。
[0023]
图4为玻璃基片立体示意图。
[0024]
图5为c型坝俯视示意图。
[0025]
图6为方型坝俯视示意图。
[0026]
图7为pdms片制作过程中各工序截面形状变化示意图。
[0027]
图8为玻璃基片制作过程中各工序截面形状变化示意图。
[0028]
图9为单细胞温度检测系统示意图。
[0029]
图10为图4中局部a放大示意图。
[0030]
图7、图8是示意性的，并不与pdms片或玻璃基片的实际剖面形状相对应。
具体实施方式
[0031]
以下结合附图实施例对本实用新型作进一步详细描述。
[0032]
本实用新型单细胞温度检测传感器，如图1所示，包括相互贴合的玻璃基片1与pdms片2，玻璃基片1的贴合面上溅射有用于导电和温度传感的pt电极块3及其引出线4。如图2所示，pdms片2的贴合面为开槽结构面，pdms片2的贴合面开设流槽7，与玻璃基片1贴合后在玻璃基片1上面形成检测时供单细胞溶液流经的流道。流槽7的两端分别开设打穿pdms片2的通孔，形成进样孔5与出样孔6。如图3所示，流槽7中设置供单细胞流入并留置的开口围坝，开口围坝的开口朝向进样注入方向。开口围坝位于玻璃基片1的上的pt电极块3上方，开口围坝与玻璃基片1之间保留检测时供试样流体与空气流过的高度间隙，此高度间隙小于待测单细胞的外径。
[0033]
如图3、图5所示，开口围坝为设有开口的呈c字形圆环的c型坝8，c型坝8的开口宽度大于c型坝8的坝内半径；开口围坝的坝高度为50um。因为大部分细胞直径为10-20um，所以将开口围坝与玻璃基片1之间的高度间隙设置为5um。c型坝8的坝内直径为150um。或者，如图6所示，开口围坝为一边开口的呈口字形方环的方型坝，方型坝的开口宽度大于c型坝8的开口边内侧边长的一半，方型坝的内侧边长为150um。因为大部分单细胞直径10-20um，所以被测单细胞不能通过缝隙而被限制在c型环内，因此特殊的c型结构可将细胞固定在微电极上，同时由于开口围坝与玻璃基片1之间5um的高度间隙的存在，不影响空气和液体的流通，所以也就不影响被测单细胞存活。采用方型坝也是同样道理。如图3所示，流槽7的宽度应至少略大于开口围坝的外径，流槽7在开口围坝所在处可开设圆弧形凹口16，以利于待测细胞溶液继续向前流动。
[0034]
如图3所示，流槽7包括进样段7a、出样段7b和分为对称分布的2路检测段7c，检测段7c流槽7围成矩形，矩形的下边流槽7经进样段7a流槽7连接进样孔5，矩形的上边流槽7经出样段7b流槽7连接出样孔6；矩形的2侧边流槽7中分别设置开口围坝。
[0035]
如图4所示，pt电极块3包括先溅射在玻璃基片1上面的一层厚度为500a的ti层作为粘附层，与溅射厚度为1500a的pt层，共同形成一层厚度为500/1500a的ti/pt工作层，并在ti/pt工作层上面沉积一层厚度为5000a的si3n4层12，作为绝缘层。如图10所示，pt电极块3呈pt丝来回迂回折返的形状。如图4所示，pt电极块3的两端分别连接其2侧引出线4，2侧引出线4搭成人字形，pt电极块3位于人字形的顶端，2侧引出线4的底端位于玻璃基片1的侧边缘。
[0036]
本实用新型单细胞温度检测传感器的制作方法，包括可不分先后各自进行的pdms片2的制作与玻璃基片1的制作，及其二者的键合， pdms片2的制作首先包括作为其模具的硅基片9的制备与pdms片2的制作。
[0037]
如图7所示， pdms片2的制作具体包括以下步骤：
[0038]
步骤1、硅基片9的预处理：由98% h2so4、30% h2o2，以7:3比例混合配制成 piranha溶液，将硅基片9在120℃piranha溶液中持续浸泡30min，随后取出硅基片9并用去离子水反复清洗，将硅基片9放在甩干机内，甩干其表面水分备用；参见图7-1。
[0039]
步骤2、涂胶：使用涂胶机将lc100a光刻胶10均匀的涂覆在硅基片9表面；参见图7-2。
[0040]
步骤3、光刻：曝光15s后显影，得到需要的图案；参见图7-3。
[0041]
步骤4、刻蚀：用深反应离子刻蚀法，将硅基片9向下刻蚀5um的深度；参见图7-4。
[0042]
步骤5、去胶：使用 piranha溶液去掉lc100a光刻胶10；参见图7-5。
[0043]
步骤6、涂胶：在清洗干净的硅基片9基底上甩凃su8-3050光刻胶11，厚度为50um，水平静置2h；参见图7-6。
[0044]
步骤7、光刻：曝光10s后，显影、硬烘后得到需要的硅基片9；参见图7-7。
[0045]
步骤8：在硅基片9上浇筑已经抽好真空的pdms，参见图7-8，静置半小时后，放在90℃烘箱内烘1h。
[0046]
步骤9、脱模：用切割刀切成单个pdms片2，参见图7-9。
[0047]
如图8所示，玻璃基片1的制作具体包括以下步骤：
[0048]
步骤10、溅射：在整块玻璃基板上溅射一层厚度为500/1500a的ti/pt层；参见图8-2。
[0049]
步骤11、涂胶：使用涂胶机将lc100a光刻胶10均匀的涂覆在金属表面；参见图8-3。
[0050]
步骤12、光刻：曝光15s后显影，得到需要的图案；参见图8-4。
[0051]
步骤13、刻蚀：使用深反应离子刻蚀法，在玻璃基板上向下刻蚀2000a，去除多余金属，只保留pt电极块(3)和电极引线；参见图8-5。
[0052]
步骤14、去胶：使用丙酮去胶，将电极表面的光刻胶去掉；参见图8-6。
[0053]
步骤15、pecvd：用气相沉积法沉积一层厚度为5000a的si3n4层12，作为绝缘层；参见图8-7。
[0054]
步骤16、涂胶：使用涂胶机将lc100a光刻胶10均匀的涂覆在si3n4层12表面；参见图8-8。
[0055]
步骤17、光刻：曝光15s后显影，得到需要的图案；参见图8-9。
[0056]
步骤18、刻蚀：使用深反应离子刻蚀法，向下刻蚀5000a，去除多余si3n4层12，即去掉引出线4的pt层上面的si3n4层12；参见图8-10。
[0057]
步骤19去胶：使用干法去胶去掉多余的lc100a光刻胶10，得到玻璃基片1备用。参见图8-11。
[0058]
步骤20、键合：将处理过的pdms片2和玻璃基底一起清洗，取出后以结构面相迎合的方式迅速在显微镜下对准键合，然后置于105℃热板上加热2h，使两者键合牢固。
[0059]
本实用新型单细胞温度检测方法，如图9所示，使用高精度恒温水箱13、电化学工作站14、电脑15、2个相同的如以上任一种传感器，其中1个作为进样检测传感器，另1个作为参比传感器，高精度恒温水箱13内水温波动范围在
±
0.002℃，检测具体包括以下步骤：
[0060]
步骤（1）、利用pt电极块3电阻与温度之间良好而稳定的线性关系，当芯片温度变化时，电阻会产生相应的变化，其线性关系式可表示为：r=xt+y，调节恒温水箱13所装的水的温度t，分别为t1、t2、t3
…
tn，使用电化学工作站14依次测量出对应温度的电阻r1、r2、r3、rn，得出该温度传感器pt电极块3的电阻与温度之间的线性关系式中的x、y数值。可将恒温水箱中的水温t1、t2、t3
…
tn分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃这5个温度，并使用电化学工作站依次测量出对应温度的电阻，则可以得出得出该温度传感器pt电极块3的电阻与温度之间的线性关系式中的x、y数值。比如r=4.13757t+2239.66932。
[0061]
步骤（2）、采用负压进样模式将待测细胞溶液导入进样检测传感器内，在其进样孔5处插上充满培养液的枪头，为芯片内细胞提供源源不断的营养物质，放入细胞培养箱中培
养至细胞贴壁生长后，将传感器放在恒温水箱13中，同时在相同环境下放置无细胞的参比传感器进行对比检测，2个传感器的pt电极块3分别经其引出线4各自连接电化学工作站14及电脑15，通过电化学工作站14分别检测进样检测传感器与参比传感器的pt电极块3的电压值与恒电流值，计算出相应的pt电极块3电阻值，再根据该温度传感器的电阻与温度之间的线性关系式及其x、y数值，计算得到检测进样检测传感器与参比传感器的pt电极块3的的温度值，二者的差值及其一段时间内的波动情况即为细胞温度值及一段时间内细胞温度的波动情况。
[0062]
本实用新型还可检测单细胞受到刺激后发生某些生命现象时所引起温度变化情况，使用高精度恒温水箱13、电化学工作站14、电脑15、2个相同的如以上任一种传感器，其中1个作为进样检测传感器，另1个作为参比传感器，具体包括以下步骤：
[0063]
步骤（1）、利用pt材料电阻与温度之间良好而稳定的线性关系，其线性关系式可表示为：r=xt+y，调节恒温水箱13所装的水的温度t，分别为t1、t2、t3
…
tn，使用电化学工作站14依次测量出对应温度的电阻r1、r2、r3、rn，得出该温度传感器的电阻与温度之间的线性关系式中的x、y数值。
[0064]
步骤（2）、维持恒温水箱13温度为37℃，采用负压进样模式将待测细胞溶液分别导入2个传感器内，在进样孔5处分别插上充满培养液的枪头，为芯片内细胞提供源源不断的营养物质，放入具有37℃、5%co2的湿润箱内环境的细胞培养箱中培养至细胞贴壁生长后，进样检测传感器进样pbs冲洗，再进样用于刺激单细胞的药物，然后将2个传感器进样孔5与出样孔6封闭后放在恒温水箱13的水中，2个传感器的pt电极块3分别经其引线各自连接电化学工作站14及电脑15；待传感器温度稳定后，通过电化学工作站14检测得到的2个传感器的电压值与恒电流值，计算出相应的pt电极块3电阻值，再根据该温度传感器的电阻与温度之间的线性关系式及其x、y数值，计算得到检测进样检测传感器与参比传感器的pt电极块3的的温度值，二者的差值及其一段时间内的波动情况即为单细胞在药物刺激下温度变化值及一段时间内单细胞在药物刺激下的温度波动情况。
[0065]
例如，利用本实用新型可用于检测hela细胞在药物cisplatin刺激下凋亡过程中温度的变化情况：将恒温水箱温度设置为37℃。将hela细胞进样到已消毒杀菌的传感器内，将细胞置于培养箱（37℃、5%co2的湿润环境）中培养24h。观察细胞，若已贴壁生长，则准备一个只有hela细胞和培养基的传感器用于对比，另一个传感器进样pbs冲洗，再进样药物cisplatin，药物cisplatin能杀死hela细胞。对hela细胞进行药物刺激，将2片芯片在同一环境下进行测量与对比，排除外界环境干扰因素对细胞温度变化的影响。将2片芯片的进/出样口密封放进恒温水箱中。待芯片温度稳定后，使用电化学工作站的恒电流法，测出电压的波动情况，根据恒电流值计算电阻，再根据已知的校准结果计算温度波动情况，因cisplatin会使hela细胞逐渐死亡，则可以测量hela细胞在cisplatin药物刺激下，凋亡过程中温度的变化情况。