一种山核桃树干腐病的预测方法与流程

本发明涉及山核桃种植
技术领域：
，具体涉及一种山核桃树干腐病的预测方法。
背景技术：
：山核桃是中国特有的经济树种，其果实不仅营养价值高，而且是一种药食同源的滋补品。山核桃树受病害影响较大，尤其是山核桃干腐病，其潜伏期长，发病周期短，病情发展迅速，难以及时治疗，严重影响山核桃产量，一直是果农们关注的问题。干腐病，又称溃疡病、墨汁病、墨水病，由弱寄生菌引起，对植物(尤其是木本植物)存在普遍危害，每年在世界范围内造成大量的经济损失。干腐病的严重程度与很多因素有关，比如managementofcitruscankerinargentina，asuccessstory[j].plantpathologyjournal，2017，33(5)：441-449记载了柑橘溃疡病的严重程度受环境和厄尔尼诺现象(enso)的影响；‘冰糖橙’溃疡病发生因子分析及预测模型的建立[j].果树学报，2015，(5)：977-984.记载了气候因素能显著影响冰糖橙溃疡病田间发病规律。目前山核桃种植区林分结构趋向单一化，人工纯林占比较高，使得山核桃林地植被多样性降低，导致山核桃林抗干腐病害能力显著降低。此外，集约型经营方式下化肥和除草剂的大量施用导致种植区土壤ph快速降低，对山核桃树形成酸胁迫，严重影响树体抗病能力。据调查，浙江省近90％的山核桃树已受到该病害的影响，该现象已经严重影响到山核桃产业的经济效益以及可持续发展。然而，目前山核桃干腐病防治的方法主要为发病后处理，如何快速预测山核桃干腐病的发生并提前防治成为重要的突破口。近20年来，数学模型在生物学上的应用越来越广泛，这种趋势得益于不同算法和计算软件的开发。数学模型与生物学领域的结合大大促进了生物学研究的发展，其中偏最小二乘支持向量机(ls-svm)作为svm的一种改进，由于其实现简单，得到了广泛应用。然而山核桃干腐病的致病机理未有明确定论，且对于山核桃干腐病发病的预测还未见文献报道。技术实现要素：本研究以干腐病感病前的山核桃树皮为材料，并于次年发病期间对所采样树的感病情况进行确认。通过化学计量法探究不同方位、不同高度山核桃树皮的化学成分含量对其抗干腐病能力的影响；利用石蜡切片和组织化学定位结合rgb颜色空间确认山核桃树干最易感病的方位和树干高度；基于偏最小二乘支持向量机(ls-svm)建立山核桃干腐病预测模型。本发明解决技术问题的技术方案为：一种山核桃树干腐病的预测方法，包括如下步骤：s1、采集山核桃树干树皮并进行组织化学定位法染色制得切片；s2、提取切片的rgb数据；s3、以rgb数据作为山核桃干腐病预测模型的输入参数，感病与否作为输出参数；s4、对感病病株进行防治，避免山核桃干腐病大范围发病。本发明有益效果为：本发明基于山核桃树干不同方位和不同高度的周皮+皮层和韧皮部碳水化合物和蛋白质组织化学定位和rgb颜色空间的偏最小二乘支持向量机模型可以准确预测山核桃干腐病的发生。说明书附图图1为1号山核桃树不同方位和不同高度周皮+皮层中总可溶性糖(a)、可溶性蛋白质(b)、总类黄酮(c)、总酚(d)含量和dpph自由基清除能力(e)比较。图2为1号山核桃树不同方位和不同高度韧皮部中总可溶性糖(a)、可溶性蛋白质(b)、总类黄酮(c)、总酚(d)含量和dpph自由基清除能力(e)比较。图3为山核桃健康株西南方向0.5m处树皮碳水化合物组织化学定位细胞图，标尺＝100μm。：a代表周皮及皮层横切面(100×)；b代表周皮横切面(400×)；c代表皮层横切面(400×)；d代表韧皮部横切面(100×)；e代表韧皮部横切面(400×)；f代表韧皮部横切面(400×)。图4为山核桃易感病株西南方向0.5m处树皮碳水化合物组织化学定位细胞图，标尺＝100μm，其中，a代表周皮及皮层横切面(100×)；b代表周皮横切面(400×)；c代表皮层横切面(400×)；d代表韧皮部横切面(100×)；e代表韧皮部横切面(400×)；f代表韧皮部横切面(400×)。图5为山核桃健康株树皮蛋白质组织化学定位细胞图，标尺＝50μm；其中，e代表西南方向0.5m处周皮+皮层横切面(400×)；f代表西南方向0.5m处韧皮部横切面(400×)。图6为山核桃易感病株树皮蛋白质组织化学定位细胞图，标尺＝50μm，其中，e代表西南方向0.5m处周皮+皮层横切面(400×)；f代表西南方向0.5m处韧皮部横切面(400×)。图3～6中，phe代表木栓层；pel代表木栓形成层；pe代表栓内层；cp代表皮层薄壁细胞；pp代表韧皮部薄壁细胞；pr代表韧皮射线；pf代表韧皮部纤维细胞。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一种山核桃树干腐病的预测方法，具体包括如下步骤：s1、采集山核桃树干树皮并进行组织化学定位法染色制得切片。首先根据7株山核桃树不同方位和不同高度周皮+皮层和韧皮部中总可溶性糖(ss)含量、可溶性蛋白质(sp)含量、总类黄酮(tf)含量、总酚(tp)含量、dpph自由基清除能力(dpph)与感病等级，确定最易感病的山核桃树干方位和高度。供试植株均采自浙江省杭州市临安区昌化镇西谷坪。采样方法：选取树龄相近、生长状况类似的植株，于2017年11月23日(干腐病发病前)分别取7株山核桃树干西南方向0.5m处和1.5m处、东北方向0.5m处和1.5m处等4个位置的树皮。处理方法：采集的树皮带回实验室后立即分为周皮+皮层和韧皮部两部分，因周皮和皮层较难分开，且有的山核桃树周皮很薄，达不到成分测定所需的量，所以周皮和皮层合并分析，分别放入烘箱中于60℃烘干至恒重，并用磨粉机磨粉后过筛，置于-20℃备用，第二天测定化学成分含量。(1)总可溶性糖含量的测定，参考蒽酮-硫酸比色法，进行优化，具体步骤如下：分别称取周皮+皮层和韧皮部粉术各0.5g，按1∶40比例加水超声浸提1h后将提取液稀释40倍。分别取周皮+皮层和韧皮部提取稀释液1ml加入硫酸蒽酮试剂(称取0.5g蒽酮溶于500ml80％硫酸溶液中)5ml，立即沸水浴10min后自然冷却至室温，使用分光光度计(北京普析通用，t6新悦)在620nm处测定吸光值，每个处理测定重复三次。标准曲线用0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的标准葡萄糖溶液测定得到。将分光光度计测得的od值代入上述标准曲线，分别计算山核桃树干各位置周皮+皮层和韧皮部中总可溶性糖含量，结果用每克干燥山核桃树周皮+皮层和韧皮部中含有的总可溶性糖含量表示。(2)可溶性蛋白质含量的测定，参考考马斯亮蓝g-250法，进行优化，具体步骤如下：分别称取周皮+皮层和韧皮部粉末各0.5g，按1∶40比例加水超声浸提1h。分别取周皮+皮层和韧皮部提取液0.1ml加入4.9ml考马斯亮蓝g-250溶液，室温放置5min，使用分光光度计(北京普析通用，t6新悦)在595nm处测定吸光值，每个处理测定重复三次。标准曲线用0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的标准蛋白质溶液测定得到。将分光光度计测得的od值代入上述标准曲线，分别计算山核桃树干各位置周皮+皮层和韧皮部中可溶性蛋白质含量，结果用每克干燥山核桃树周皮+皮层和韧皮部中含有的可溶性蛋白质含量表示。(3)总类黄酮含量的测定，参考alcl3比色法，进行优化，具体步骤如下：分别称取周皮+皮层和韧皮部粉术各0.5g，按1∶40比例加水超声浸提1h后将提取液稀释100倍。分别取周皮+皮层和韧皮部提取稀释液0.5ml加入甲醇1.5ml，2％氯化铝溶液0.1ml，1m乙酸钾溶液0.1ml和蒸馏水2.8ml，混合均匀后于室温反应30min，反应液于分光光度计(北京普析通用，t6新悦)415nm下测定吸光值，每个处理测定重复三次。标准曲线用0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mg/ml的芦丁标准溶液测定得到。将分光光度计测得的od值代入上述标准曲线，分别计算山核桃树干各位置周皮+皮层和韧皮部中总类黄酮含量，结果用每克干燥山核桃树周皮+皮层和韧皮部中含有的黄酮量表示。(4)总酚含量的测定，参考福林-酚比色法，进行优化，具体步骤如下：分别称取周皮+皮层和韧皮部粉术各0.5g，按1∶40比例加水超声浸提1h后将提取液稀释60倍。分别取周皮+皮层和韧皮部提取稀释液0.5ml，加入福林酚试剂0.5ml，室温反应3min后加入20％na2co3溶液0.75ml，再加入蒸馏水8.25ml，于40℃水浴反应40min。反应液在分光光度计(北京普析通用，t6新悦)755nm波长下测定吸光值，测定重复三次。标准曲线用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/ml的没食子酸标准溶液测定得到。将分光光度计测得的od值代入上述标准曲线，分别计算山核桃树干各位置周皮+皮层和韧皮部中总酚含量，结果用每克干燥山核桃树周皮+皮层和韧皮部含有的总酚量表示。(5)dpph自由基清除能力的测定，对tuberoso等的方法进行优化，具体步骤如下：分别称取周皮+皮层和韧皮部粉末各0.5g，按1∶40比例加水超声浸提1h后将提取液稀释60倍。分别取周皮+皮层和韧皮部提取稀释液0.1ml，加入4.9mldpph溶液(配制方法：刚乙醇定容0.003gdpph至100ml)，混合均匀后置于暗处，于室温下反应30min，反应液于分光光度计(北京普析通用，t6新悦)517nm处测定吸光值at，dpph溶液作为对照吸光度ar。每个处理测定重复三次。dpph自由基清除能力＝100％×(1-at/ar)(公式1)标准曲线用0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mg/ml的抗坏血酸标准溶液测定得到。将公式1计算得到的结果代入上述标准曲线，分别计算山核桃树干各位置的周皮+皮层和韧皮部的dpph自由基清除能力，结果用每克干燥山核桃树周皮+皮层和韧皮部含有的抗坏血酸(ascorbicacid)当量表示。1～7号供试植株树干西南方向0.5m处和1.5m处、东北方向0.5m处和1.5m处等4个位置的周皮+皮层以及韧皮部中总可溶性糖、可溶性蛋白质、总类黄酮、总酚含量和dpph自由基清除能力比较以1号供试植株为例，如图1～2所示。于2018年5月(山核桃干腐病发生后)确认供试植株的感病情况并记录，如表1所示。将未感染干腐病的山核桃树标记为健康株，感病等级(diseaselevel)为0；感染干腐病的山核桃树标记为易感病株，感病等级(diseaselevel)为1，便于后续数据处理。表1分析山核桃树干不同方位和不同高度周皮+皮层以及韧皮部中总可溶性糖(ss)含量、可溶性蛋白质(sp)含量、总类黄酮(tf)含量、总酚(tp)含量、dpph自由基清除能力(dpph)与感病等级之间的相关性，具体如表2～9所示。表2、山核桃树干西南方向0.5m处周皮+皮层中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.616**-0.534*-0.0460.520*0.154ss0.658**-0.069-0.157-0.114sp-0.321-0.0370.122tf0.2650.234tp0.659**表3、山核桃树干西南方向1.5m处周皮+皮层中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.433-0.3500.699**0.844**0.687**ss0.485*-0.227-0.378-0.539*sp0.1770.0330.121tf0.884**0.672**tp0.751**表4、山核桃树干东北方向0.5m处周皮+皮层中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.040-0.3800.0030.572**0.082ss0.3750.327-0.077-0.441*sp0.4150.3470.309tf0.433*0.381tp0.529*表5、山核桃树干东北方向1.5m处周皮+皮层中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.274-0.3360.458*0.567**0.548*ss0.1670.104-0.190-0.436*sp0.529*0.468*0.177tf0.880**0.413tp0.568**表6、山核桃树干西南方向0.5m处韧皮部中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.581**-0.477*-0.3890.465*0.242ss0.525*0.387-0.143-0.471*sp0.578**0.3700.023tf0.3520.332tp0.454*表7、山核桃树干西南方向1.5m处韧皮部中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.301-0.490*-0.0700.435*0.502*ss0.4080.279-0.021-0.229sp0.433*0.2160.155tf0.660**0.426tp0.759**表8、山核桃树干东北方向0.5m处韧皮部中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数表9、山核桃树干东北方向1.5m处韧皮部中各化学成分含量和感病等级之间的皮尔森相关系数sssptftpdpph感病等级-0.329-0.468*0.4130.510*0.373ss0.651**0.2760.0130.137sp-0.0520.007-0.008tf0.699**0.672**tp0.649***p＜0.05；**p＜0.01。为进一步说明不同方位和不同高度周皮+皮层和韧皮部之间总可溶性糖含量差异及与干腐病感病之间的关系，分别做了各株山核桃树干不同方位和不同高度周皮+皮层和韧皮部之间总可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量比值的比较，结果如表10～13所示。表10各株山核桃树不同方位和不同高度周皮+皮层之间总可溶性糖含量的比值由表10可知，在周皮+皮层中，健康山核桃树(1号、3号、5号)两南方向1.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值均小于1，且东北方向0.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值也都小于1，证明健康山核桃树西南方向0.5m处周皮+皮层中总可溶性糖含量处于较高水平；而易感病山核桃树(2号、4号、6号、7号)东北方向0.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值都大于1，且2号和6号、山核桃树两南方向1.5m与两南方向0.5m处总可溶性糖含量比值也大于1，证明易感病山核桃树西南方向0.5m处周皮+皮层中总可溶性糖含量处于较低水平。因此，西南方向0.5m处周皮+皮层中总可溶性糖含量可能是影响山核桃树抗干腐病能力的因素之一。表11、各株山核桃树不同方位和不同高度韧皮部之间总可溶性糖含量的比值由表11可知，在韧皮部中，各株山核桃树西南方向1.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值均大于1，说明在西南方向山核桃较高位置树干韧皮部的总可溶性糖含量较高；此外，健康山核桃树(1号、3号、5号)和弱感病山核桃树no.7东北方向0.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值都小于1，而易感病山核桃树(2号、4号、6号)东北方向0.5m与西南方向0.5m处总可溶性糖含量比值都大于1，说明西南方向0.5m处韧皮部中总可溶性糖含量可能是影响山核桃树抗干腐病能力的因素之一。表12、各株山核桃树不同方位和不同高度周皮+皮层之间可溶性蛋白质含量的比值由表12可知，在周皮+皮层中，健康山核桃树no.1和no.3以及弱感病山核桃树no.7西南方向1.5m与西南方向0.5m处可溶性蛋白质含量比值小于1，且东北方向0.5m与西南方向0.5m处可溶性蛋白质含量比值也小于1，证明健康山核桃树和弱感病山核桃树西南方向0.5m处周皮+皮层中可溶性蛋白质含量处于较高水平；而易感病山核桃树(no.2、no.4、no.6)东北方向0.5m与西南方向0.5m处可溶性蛋白质含量比值大于1，且西南方向1.5m与西南方向0.5m处可溶性蛋白质含量比值也大于1，证明易感病山核桃树西南方向0.5m处周皮+皮层中可溶性蛋白质含量处于较低水平。因此，西南方向0.5m处周皮+皮层中可溶性蛋白质含量可能是影响山核桃树抗干腐病能力的因素之一。表13各株山核桃树不同方位和不同高度韧皮部之间可溶性蛋白质含量的比值由表13可知，在韧皮部中，山核桃树西南方向0.5m处可溶性蛋白质含量整体高于西南方向1.5m处，东北方向0.5m处可溶性蛋白质含量整体高于西南方向0.5m处，健康山核桃树和易感病山核桃树之间可溶性蛋白质含量差异无明显规律。由7株山核桃树不同方位和不同高度周皮+皮层和韧皮部中总可溶性糖含量总体差异来看，总可溶性糖含量呈现东北方向高于西南方向的趋势，且树干高处(1.5m处)总可溶性糖含量高于树干基部(0.5m处)(5号树因本身树势原因不作为参考)，可能是因为西南方向处阳面，受太阳光照时间较长，树液流动速率较快，有机物质积累较少，同时在天气较冷时(采样时间在11月底)，树木光合作用减弱，光合产物由树冠向下运输时易在高处积累。而在西南方向0.5m处周皮+皮层和韧皮部中总可溶性糖含量与感病等级之间均呈极显著负相关(p＜0.01)，其余方位呈负相关但无显著性，该结果与山核桃干腐病发生规律一致，证明西南方向0.5m处周皮+皮层和韧皮部中总可溶性糖含量可能是关键感病因子之一。从感病情况进行分析，发现在西南方向0.5m处7株样树周皮+皮层和韧皮部中可溶性蛋白质含量与感病等级之间均呈显著负相关(p＜0.05)，且可溶性蛋白质含量与总可溶性糖含量呈显著正相关。因此两南方向0.5m处周皮+皮层和韧皮部中可溶性蛋白质含量可能也是关键感病因子之一。其他成分含量与山核桃树干方位、高度和感病情况之间的规律不明显，后续实验不做考虑。分别取7株山核桃树干西南方向0.5m处树皮，立即用单面刀切成1-2mm3的小块，并放入装有faa固定液的青霉素小瓶进行固定，用作成分测定的树皮带回实验室后立即放入烘箱中于60℃烘干。i、石蜡切片法：(1)取材取健康、标准的材料，切成1-2mm3的小块；(2)固定把采下的材料立即固定在faa固定液中，放置24小时以上，以防止细胞收缩变形，之后用真空泵抽气至无气泡产生；(3)脱水固定完以后，依次经过70％、85％、95％、100％酒精脱水，前两级酒精脱水时应用真空泵抽气至无气泡。脱水酒精的用量约为材料体积的3-5倍，每级酒精停留时间为1-2小时(视材料而定，脱水困难的材料可适当延长时间，但每级不超过4h)，为了使材料彻底脱水，最后需再更换一次纯酒精；(4)透明经两次纯酒精脱水以后，依次经2/3酒精+1/3二甲苯(体积占比)、1/2酒精+1/2二甲苯、1/3酒精+2/3二甲苯、二甲苯，对材料进行透明化处理，每级2小时(视材料而定，透明较困难的材料可适当延长时间，但每级不超过4h)。在酒精与二甲苯体积各半的步骤时，加入少许番红干粉，使材料着色，以便于材料包埋在石蜡中后容易看见，便于切片时掌握材料的方向；(5)浸蜡先用单面刀片将过炉过的石蜡切成小块，然后在盛有材料及透明剂(二甲苯)的青霉素小瓶内放入一条纸带(宽度略小于青霉素小瓶)，将石蜡小块放在纸带上(避免石蜡与材料直接接触引起收缩)，石蜡的量约与透明剂相同，盖上瓶塞，放入35℃烘箱过夜。过夜后打开瓶塞放入60℃烘箱中让透明剂慢慢挥发，等透明剂完全挥发完后将原溶液倾去，更换两次熔融状态的纯蜡(温度不宜太高)，每次间隔4小时，之后即可包埋；(6)包埋包埋之前先准备包埋用的纸盒，纸盒用较硬而光滑的纸折成。之后准备镊子、一桶冷水、酒精灯及火柴。包埋时将融化的石蜡连同材料一起倒入纸盒内，然后将镊子在酒精灯上烧热，迅速把材料按需要的切面排列整齐。等石蜡表面出现一层蜡膜后平平放入冷水中，使其很快凝固；(7)修块已经包埋好的材料，用刀片切成每一小块蜡块包含一个材料，并将小块修成六面体，用熔融状态的石蜡固定在长方形硬木块(其中一面锯出纵横沟纹)上，待石蜡冷凝后用单面刀片将材料四周多余的蜡修去；(8)切片使用转轮式切片机(yd-1508a，金华市益迪医疗设备有限公司)进行切片，厚度为8-10μm；(9)粘片用迈耶粘贴剂(meyeraffixative)(配方：新鲜的鸡蛋白25ml、甘油25ml、麝香草酚0.5g)粘片，粘片完成后先在烘片机(kd-h，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)上将表面水分烘干，再放入37℃恒温箱中，烘大约一周。ii、糖的组织化学定位(pas法)，高碘酸-席夫反应法(pas法)步骤如下：在酒精灯上烤烘干的石蜡切片至石蜡熔化——二甲苯i15min(40℃恒温箱中)——二甲苯ii15min——1/2二甲苯+1/2酒精2min——100％酒精i5min——100％酒精ii5min——95％酒精5min——85％酒精5min——70％酒精5min——蒸馏水5min——自来水冲洗5min——0.5％高碘酸水溶液5min——蒸馏水洗涤3s——席夫试剂15min——漂洗液3min，3次——自来水冲洗3min——蒸馏水2min——70％酒精10s——85％酒精10s——95％酒精10s——100％酒精i5s——100％酒精ii5s——二甲苯i2min——二甲苯ii2min——中性树胶封片。经pas染色后，山核桃树皮(包括周皮、皮层和韧皮部)各部位均被染成红色，碳水化合物含量高的部位呈紫红色。由图3～4可见，山核桃健康株和易感病株树皮组织切片经pas染色后颜色深浅有差异，山核桃易感病株西南方向0.5m处树皮碳水化合物含量较高，但低于健康株西南方向0.5m处，pas染色颜色较健康株西南方向0.5m处浅。iii、蛋白质的组织化学定位(萘酚黄s染色法)，步骤如下：染色液配制：萘酚黄s1g；1％醋酸100ml。上液作为基液，用时用1％醋酸稀释基液比例为2∶100。染色步骤：烘干的石蜡切片用酒精灯熔化石蜡——二甲苯i15min(40℃恒温箱中)——二甲苯ii15min——1/2二甲苯+1/2酒精2min——100％酒精i5min——100％酒精ii5min——95％酒精5min——85％酒精5min——70％酒精5min——蒸馏水5min——萘酚黄s染色液2min——蒸馏水2min——70％酒精10s——85％酒精10s——95％酒精10s——100％酒精i5s——100％酒精ii5s——二甲苯i2min——二甲苯ii2min——中性树胶封片。经萘酚黄s法染色后，山核桃树皮中含蛋白质部位被染成淡黄色。由图5～6可见，山核桃健康株和易感病株树皮切片颜色深浅有差异，健康株树皮切片颜色略深，差别不明显。s2、提取切片的rgb数据。s21、将用中性树胶封固完的切片置于光学显微镜(nikoneclipsee100)下，分别以100倍和400倍放大倍数进行观察；s22、100倍下挑选典型切片，分别对周皮+皮层和韧皮部进行拍照，每个样本重复拍三次，采集的图像利用imagej软件提取rgb颜色特征值、平均灰度值和加权灰度值，读取范围：1cm×1cm；s23、400倍下挑选典型切片，分别对周皮、皮层和韧皮部各类细胞拍照，每个样本重复拍三次，采集的图像利用imagej软件提取各类细胞rgb颜色特征值、平均灰度值和加权灰度值，读取范围：单个细胞；rgb颜色空间中平均灰度值(meangrayvalue)＝(r+g+b)/3加权灰度值(weightedgrayvalue)＝0.299r+0.587g+0.114b根据rgb颜色空间特性，颜色特征值越小代表该颜色分量越深。山核桃健康株和易感病株西南方向0.5m处树皮各类细胞碳水化合物组织化学定位颜色特征值的比值(易感病株/健康株)如表14所示。表14如表14所示，山核桃健康株和易感病株各类细胞碳水化合物组织化学定位颜色特征值的比值不同，韧皮射线、栓内层和皮层薄壁细胞的r值、b值和平均灰度值的比值均高于其他细胞，表明健康株和易感病株之间这三类细胞的碳水化合物含量差异较大。s3、以rgb数据作为山核桃干腐病预测模型的输入参数，感病与否作为输出参数。所述的山核桃干腐病预测模型建立步骤如下所示：于2018年5月确认7株山核桃干腐病的感病情况并记录。未感染干腐病的山核桃树标记为健康株，感染干腐病的山核桃树标记为易感病株，便于后续数据处理。样本信息同表1。使用excel365软件将所得的rgb数据和样本位置一一对应绘制成表格，导入matlab软件后用xlsread函数读取；以r值、g值、b值作为预测模型的输入参数，感病与否作为输出参数，选用径向基核函数(rbf)作为支持向量机(svm)预测模型的核函数，rbf用以下公式表示：k(||x-xc||)＝exp{-||x-xc||2/(2σ2)}其中xc为核函数中心，σ2为核函数参数。基于山核桃西南方向0.5m处树皮各类细胞碳水化合物组织化学定位颜色特征值的偏最小二乘支持向量机模型拟合。分别提取健康和易感病山核桃西南方向0.5m处木栓层细胞、栓内层细胞、皮层薄壁细胞、韧皮射线细胞、韧皮薄壁细胞和韧皮纤维细胞碳水化合物组织化学定位颜色特征值和rgb颜色空间，进行偏最小二乘支持向量机模型拟合和主成分分析，结果如表15所示。表15γ.规整化参数；δ2.核函数参数；r.相关系数；rmse.均方根误差；c.惩罚因子；g.核函数rbf中的gamma函数设置。如表15所示，基于山核桃健康株和易感病株西南方向0.5m处树皮各类细胞(木栓层、栓内层、皮层薄壁细胞、韧皮射线细胞、韧皮薄壁细胞、韧皮纤维)碳水化合物组织化学定位颜色特征值和rgb颜色空间的偏最小二乘支持向量机模型预测正确率都为100％，模型拟合很好。本研究确证了西南方向0.5m为山核桃干腐病最易发生方位和高度，与野外山核桃干腐病发生的方位和高度完全一致。s4、对感病病株进行防治，避免山核桃干腐病大范围发病。对感病病株周围土壤分别施用生石灰+钙镁磷肥或者海藻酸+硫酸钾镁，避免山核桃干腐病大范围发病。当前第1页12