一种磁微粒电化学发光试剂盒的制作方法

1.本发明属于医学检测领域，具体涉及一种磁微粒电化学发光试剂盒。


背景技术：

2.降钙素原(procalcitonin，pct)是人降钙素(calcitonin，ct)的前体物质，是由116个氨基酸组成的激素原，分子量大约为12.7kd。它由神经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的c细胞)表达，经酶切分解为(未成熟)降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的pct，感染细菌或细菌性脓毒血症后pct会明显升高，尤其是重症脓毒血症和感染性休克。pct与白细胞、白细胞介素
‑
6(il
‑
6)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)和c反应蛋白(crp)这些炎症因子相比，其灵敏度和特异性更高。因此，pct可作为脓毒血症的预后指标、抗生素选择以及疗效判断的指标，同时也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标。
3.目前临床上用于pct检测的有多种方法，包括胶体金免疫层析法(gica)、乳胶增强免疫比浊法(letia)、免疫放射分析法(irma)、酶联免疫荧光法(elfa)以及化学发光免疫分析法(clia)。这些方法都有其各自的优点，也有各自的短处，如灵敏度不够，检测耗时长，线性范围不够宽，试剂稳定性差等。
4.鉴于上述不足之处，人们开发出一种新的检测技术一电化学发光免疫分析法。它是磁分离技术、电化学发光技术，免疫测定技术相结合的产物，能对各种物质进行快速分析，是目前最为先进的标记免疫测定技术。其原理包括电化学和化学发光两个过程，以电化学发光剂三联吡啶钌([ru(bpy)3]
2+
)标记抗原或抗体，以三丙胺(tripropylamine，tpa)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。电化学发光免疫分析法灵敏度高、试剂稳定，可以用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸和药物等的检测分析。
[0005]
在申请号为cn111044719a的中国专利申请中公开了一种检测肌联蛋白抗体的电化学发光试剂盒及其制法，该试剂盒包含链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的titin抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液。该方法提供了一种接近均相的反应体系，具有较高的灵敏度和特异性。但在该技术中，抗体偶联和纯化的方法繁多、操作步骤耗时较长，在这个过程中抗体的结构和性质极易发生改变而引起特异性和抗干扰能力下降。在申请号为cn102721804a的中国专利申请中，虽然提供了一种通用、便捷的基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法，但仍无法有效缓解由于蛋白质结构和性质的改变而导致抗体稳定性和重复性变差的缺陷。
[0006]
因此，现有的电化学发光试剂盒仍存在稳定性差、灵敏度不高且抗干扰能力弱等问题。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种磁微粒电化学发光试剂盒，解决现有技术中电化学发光试剂盒稳定性差、灵敏度不高以及抗干扰能力弱等问题。
[0008]
为实现上述目的，本发明提供一种磁微粒电化学发光试剂盒，包括：m试剂：链霉亲
和素包被的磁珠工作液；r1试剂：包含生物素标记的抗体；r2试剂：包含电化学发光剂标记的抗体；电化学发光底物液和清洗液。所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素
‑
生物素信号放大系统，能有效提高检测的灵敏度与线性范围。将一对抗体分别与生物素和电化学发光剂相结合，生物素和电化学发光剂与抗体相比，分子量极小，其与抗体的结合不会改变抗体的结构和性质，不会影响抗体
‑
抗原的亲和力，从而使本发明所制备的试剂盒具有较高的灵敏度。将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗、检测等步骤均可由仪器自动化实现，避免人为操作误差、大大提高工作效率、节省人力物力。
[0009]
所述抗体包括抗降钙素原抗体，所述电化学发光剂包括三联吡啶钌，所述电化学发光底物包括三丙胺。
[0010]
优选地，所述抗降钙素原抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体fab片段或多克隆抗体fab片段，所述抗降钙素原抗体来源于鼠、兔或羊。
[0011]
优选地，所述试剂盒还包括校准品工作液和质控品工作液。
[0012]
更优选地，所述校准品工作液和所述质控品工作液中含有人源或重组的降钙素原。校准品的目的在于绘制出一条校准曲线，质控品的目的在于回测验证校准结果的准确性。因此，任何可以覆盖检测范围的校准品/质控品浓度都可以使用，人源或重组降钙素原的浓度选自但不限于如下一个或更多：0ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。该试剂盒还包括校准品工作液和质控品工作液，工作液由ph为6.0～8.0，浓度为0.01～0.1mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液、小牛血清、人血清、马血清中的一种配制而成，所述工作液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1～2wt％的酪蛋白酸钠、0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮钠。
[0013]
所述m试剂包括：浓度为0.5～1.5mg/ml的链霉亲和素偶联的磁珠和ph为6.5～7.8的磁珠缓冲液；所述磁珠缓冲液中含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白、0.05～2wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、1～10％的聚乙二醇(mw＝800)和0.05～0.5wt％的proclin300或叠氮钠。磁珠缓冲液由浓度为0.01mol/l～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液、mopso缓冲液中的一种配制而成。
[0014]
优选地，所述链霉亲和素偶联的磁珠粒径为1um～4um，更优选地，所述链霉亲和素偶联的磁珠粒径为1.2um～1.8um。本领域的技术人员应当理解，本发明方法中所公开的磁微粒实际上不可能是单个的磁微粒，而是众多磁微粒。因此，磁微粒的粒径在统计学意义上应是一个粒径范围的分布。例如，当提及粒径为2.8um的磁微粒时，并不意味着每个单独微粒的粒径刚好是2.8um，而是允许在2.8um附近(例如
±
20％的误差)的范围之内。因此，在本发明的上下文中，均以一个具体的粒径来代表其范围。
[0015]
所述r1试剂包括：生物素标记的抗体和ph为6.5～7.8的生物素标记的抗体缓冲液，所述生物素标记的抗体缓冲液包括用于提高试剂盒抗干扰能力和稳定性的共反应剂。
[0016]
优选地，所述生物素标记的抗体缓冲液包括0.01～2wt％的牛血清白蛋白、0.01～2wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、1～100mg/l的异嗜性抗体阻断剂、0.01～0.5wt％的proclin300或叠氮钠、0.02～2wt％的共反应剂。
[0017]
优选地，所述的异嗜性抗体阻断剂为hbr
‑
1、hbr
‑
3、hbr
‑
6、hbr
‑
9、hbr
‑
plus中的一种或多种。
[0018]
更优选地，所述的异嗜性抗体阻断剂为浓度10mg/l的hbr
‑
plus。
[0019]
优选地，所述共反应剂包括酪蛋白酸钠和聚赖氨酸。生物素标记的抗体缓冲液由浓度为0.01mol/l～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液、hepes缓冲液、mopso缓冲液中的一种配制而成，在r1试剂中的酪蛋白酸钠和聚赖氨酸作为共反应物，可以显著提高试剂的稳定性，增强试剂的抗干扰能力。
[0020]
更优选地，所述反应共反应剂包括0.02～1wt％的酪蛋白酸钠和0.1～1wt％的聚赖氨酸。
[0021]
所述生物素标记的抗体的制备方法为：a.在交联缓冲液中，抗体与sata反应，除去未结合物质，获得混合物；b.混合物与生物素反应，除去未结合的生物素，得到生物素标记的抗体。目前市面上常用的生物素标记方法是直接标记法，即通过生物素n
‑
羟基琥珀酰亚胺活化酯或其他类型的活化酯标记抗体的氨基，而抗体的氨基往往呈随机分布，在标记过程中由于空间位阻作用或氨基恰好位于抗原抗体结合区域而导致抗原抗体的特异性识别受到抑制，从而影响诊断试剂的灵敏度。本发明通过间接标记法，先利用sata在抗体表面添加巯基，然后在对巯基进行标记，形成抗体
‑
巯基
‑
生物素结构，通过外接铰链臂的形式减弱了空间位阻的作用，外加的巯基不会改变抗体原本的结构，不同巯基基团空间距离更远，基团间的相互影响可以忽略不计，从而完整保留抗体特异性识别能力，具有更高的灵敏度。
[0022]
优选地，在所述步骤a中，所述sata和所述抗体的摩尔比为20～50∶1，反应时间为0.5～3h；在所述步骤b中，所述生物素和所述抗体的摩尔比为5～50∶1，反应时间为0.5～3h。
[0023]
更优选地，进行所述步骤b前，所述混合物还与羟胺盐酸反应进行脱乙酰化反应。
[0024]
所述r2试剂包括：电化学发光剂标记的抗体和ph为6.5～7.8的电化学发光剂标记的抗体缓冲液，所述电化学发光剂标记的抗体缓冲液包括用于提高试剂盒的灵敏度的反应增强剂。
[0025]
优选地，所述电化学发光剂标记的抗体缓冲液含有0.1～2wt％的牛血清白蛋白、0.01～2wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、0.01～5wt％的proclin 300或叠氮钠和0.01～1wt％的反应增强剂。
[0026]
优选地，所述反应增强剂包括氨基三乙酸。在r2试剂中的氨基三乙酸作为反应增强剂，由于氨基羧酸类物质对金属离子的配位络合作用，极大地提高了电化学发光剂在电化学发光过程中产生的信号值，从而增加反应的灵敏度和线性范围。
[0027]
优选地，所述反应增强剂包括0.2wt％的氨基三乙酸。
[0028]
所述电化学发光剂标记的抗体的制备方法为：将三联吡啶钌活化酯与所述抗体按5～50∶1的摩尔比反应0.5～3小时。
[0029]
所述三联吡啶钌活化酯的制备方法为：a.将edc和nhs加入到溶剂中，如dmso或dmf溶剂，获得第一混合物；b.将三钌羧酸加入第一混合物中，混匀并孵育，获得第二混合物；c.离心去除第二混合物中的不溶物质，得到三联吡啶钌活化酯：三联吡啶钌
‑
nhs。
[0030]
所述电化学发光底物液为ph值为6.0～7.2的磷酸盐缓冲液或tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.2mol/l的三丙胺、0.05～2wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯和0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮钠。
[0031]
所述清洗液为ph大于13的碱性溶液，如koh溶液，所述清洗液包括0.01～2wt％的表面活性剂。
[0032]
本发明的有益效果如下：(1)采用了链霉亲和素
‑
生物素结合系统，该系统具有高亲和力、专一性强的特点，不受试剂浓度、ph环境等因素的影响。且理论上每分子亲和素能结合4个分子的生物素，可以将信号放大，从而使本发明所制备的试剂盒具有较高的灵敏度。
[0033]
(2)将一对抗体分别与生物素和电化学发光剂结合，生物素和电化学发光剂与抗体相比，分子量极小，其与抗体的结合不会改变抗体的结构和性质，不会影响抗体
‑
抗原的亲和力，从而使本发明所制备的试剂盒具有较高的灵敏度和抗干扰能力。
[0034]
(3)目前市面上常用的生物素标记方法是直接标记法，即通过生物素n
‑
羟基琥珀酰亚胺活化酯或其他类型的活化酯标记抗体的氨基，而抗体的氨基往往呈随机分布，在标记过程中由于空间位阻作用或氨基恰好位于抗原抗体结合区域而导致抗原抗体的特异性识别受到抑制，从而影响诊断试剂的灵敏度。本发明所采用的间接标记法通过在抗体表面添加巯基，然后在对巯基进行标记，形成抗体
‑
巯基
‑
生物素结构，通过外接铰链臂的形式减弱了空间位阻的作用，外加的巯基不会改变抗体原本的结构，不同巯基基团空间距离更远，基团间的相互影响可以忽略不计，从而完整保留抗体特异性识别能力，具有更高的灵敏度。本发明采用间接标记法制备的试剂盒lob值为0.0049ng/ml，灵敏度高于采用直接标记法制备的试剂盒。
[0035]
(4)通过添加共反应物质和反应增强剂，使试剂盒具备更好的灵敏度、抗干扰能力、重复性和稳定性：在r1试剂中加入一定量的酪蛋白酸钠和聚赖氨酸，使试剂盒具有更好的重复性和稳定性，经过10次测定后，两个测试样本的cv值仅为4.2％和3.7％，37℃条件下经10天的稳定性测试后试剂基本无变化；添加共反应物的免疫诊断试剂盒与进口试剂盒相关性方程为y＝0.863x+0.5288(r2＝0.9779，n＝48)，具备更好的抗干扰性和相关性；在r2试剂中加入一定量的氨基三乙酸，不同浓度的氨基三乙酸具有不同的络合能力，合适浓度的氨基三乙酸可以作为反应增强剂，极大的提高反应的信号值，获得较宽线性范围。
[0036]
(5)所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素
‑
生物素信号放大系统，能有效提高检测的灵敏度与线性范围。将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗、检测等步骤均可由仪器自动化实现，避免人为操作误差、有效提高工作效率、节省人力物力。
[0037]
(6)生物素和抗体、三联吡啶钌和抗体的交联工艺简单高效、反应条件温和且快速，交联过后的纯化过程回收率高，可以最大程度较少抗体的损失，节约材料成本，节省时间成本，从而使本发明所制备试剂盒重复性好，经济效益高，具有广阔的市场前景。
附图说明
[0038]
图1：本发明添加共反应物的试剂盒抗干扰能力和相关性结果。
[0039]
图2：本发明未添加共反应物的试剂盒抗干扰能力和相关性结果。
具体实施方式
[0040]
以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述。
[0041]
实施例1：磁微粒电化学发光试剂盒的制备m试剂的制备：将链霉亲和素偶联的磁微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用ph为7.4，浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液重悬至浓度为1mg/ml，所述缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、5％的聚乙二醇(mw＝800)、0.05wt％叠氮钠。
[0042]
r1试剂的制备：(1)事先称取适量n
‑
琥珀酰亚胺基
‑
s
‑
乙酰硫基乙酸酯(sata)，加入适量无水dmso配置成sata储备液，于
‑
20℃保存待用。
[0043]
(2)取1mg抗降钙素原抗体，加入20倍体积的碳酸钠缓冲液(0.1mol/l，ph＝9.0)，将sata储备液按摩尔比20∶1与抗降钙素原抗体混合，在室温混匀反应2小时，超滤除去未结合的物质，得到带有封闭巯基的抗降钙素原抗体溶液。除碳酸盐缓冲液外，此步骤使用的交联缓冲液还可选自ph为8.0～11.0，浓度为0.02～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液或mes缓冲液。
[0044]
(3)对封闭的巯基进行脱乙酰化处理，加入饱和羟胺盐酸溶液，室温孵育2小时，透析除去未反应物质，得到带有游离巯基的抗降钙素原抗体溶液。
[0045]
(4)向上述溶液中加入一定量的生物素马来酰胺，使生物素马来酰胺与抗降钙素原抗体的摩尔比为50∶1，室温条件下孵育2小时，超滤除去未结合的物质，得到生物素标记的抗降钙素原抗体溶液。
[0046]
(5)配制ph为7.4，浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、10mg/l的hbr
‑
plus、0.05wt％的叠氮钠、0.02wt％的酪蛋白酸钠、0.5wt％的聚赖氨酸(mw＝3000kd)。用该缓冲液重悬生物素标记的抗降钙素原溶液至3ug/ml，即可得r1试剂。
[0047]
r2试剂的制备：(1)取edc(1
‑
(3
‑
二甲胺基丙基)
‑
3乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)溶于无水dmso(二甲基亚砜)中，放置于冰上混匀，再加入一定量的三联吡啶钌羧酸，冰上混匀反应30分钟，随后在室温反应过夜。
[0048]
(2)过夜反应后，离心去除不溶物质，将已活化好的三联吡啶钌
‑
nhs酯制成储备液，
‑
20℃避光保存待用。
[0049]
(3)取1mg抗降钙素原抗体，加入20倍体积的碳酸钠缓冲液(0.1mol/l，ph＝9.0)，将三联吡啶钌
‑
nhs酯与之混合，使三联吡啶钌
‑
nhs酯与抗体按照摩尔比20∶1的比例在室温避光混匀反应2个小时，加入2mol/l的甘氨酸溶液，孵育30min以终止反应，得到三联吡啶钌标记的抗降钙素原抗体溶液。除碳酸盐缓冲液外，此步骤使用的交联缓冲液还可选自ph为8.0～11.0，浓度为0.02～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液或mes缓冲液。
[0050]
(4)将该溶液转移至超滤管中(mwco，30～100kd)进行超滤(超滤液为10mm pbs，ph7.4)，共超滤5次，超滤后收集三联吡啶钌标记的抗降钙素原抗体，4℃避光保存待用。
[0051]
(5)配制ph为7.4，浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯、0.05wt％的叠氮钠、0.2wt％的氨基三乙酸。用该缓冲液重悬三联吡啶钌标记的抗降钙素原抗体溶液至5ug/ml，即可得r2试剂。
[0052]
校准品和质控品工作液的配制：配制ph为7.4，浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液，缓冲液含有0.1wt％的酪蛋白酸钠，0.3wt％的卡拉胶，0.05wt％的叠氮钠。用该缓冲液配制降钙素原校准品和质控品工作液，校准品共6个点，降钙素原浓度分别为0、0.1ng/ml、0.5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。质控品共2个点，浓度分别为0.2ng/ml和20ng/ml。
[0053]
清洗液的配制：配制0.175mol/l的koh溶液，所配清洗液中含有0.05mol/l的乙二醇月桂酸酯。
[0054]
电化学发光底物液的配制：配制ph为6.8，浓度为0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有0.05mol/l的三丙胺，0.1wt％的聚氧乙烯山梨糖醇酯，0.1wt％的叠氮钠。
[0055]
试剂分装及组装：将m试剂7ml/瓶、r1试剂10ml/瓶、r2试剂10ml/瓶、校准品/质控品工作液1ml/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃。将清洗液380ml/瓶，电化学发光底物液380ml/瓶单独包装，保存于室温。
[0056]
实施例2：试剂盒灵敏度测试按照实施例1方法，所制备试剂盒的灵敏度由最低检出限(lob)来确定，参照ep17
‑
a2对临床检测能力评估的要求，按照下述实验方法进行：通过检测空白样本20次，统计20测量结果的信号值(rlu)，计算其平均值m和标准差sd，得出m+2sd对应的rlu值。将其带入由空白样本和邻近低值样本的浓度
‑
rlu结果所拟合出的一次方程，计算出对应浓度即最低检出限(lob)。测试结果见表1。
[0057]
对比例1r1试剂的制备采用直接标记法，即用生物素n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯或其他长链生物素活化酯直接标记抗体的氨基，参照实例1中r1的制备方法。制备完成后，在与实施例2相同的条件下进行灵敏度测试。测试结果见表1。
[0058]
表1.试剂盒灵敏度测试结果
由上述结果可知，本发明采用间接标记法制备的试剂盒lob值为0.0049ng/ml，灵敏度高于采用直接标记法制备的试剂盒。目前市面上常用的生物素标记方法是直接标记法，即通过生物素n
‑
羟基琥珀酰亚胺活化酯或其他类型的活化酯标记抗体的氨基，而抗体的氨基往往呈随机分布，在标记过程中由于空间位阻作用或氨基恰好位于抗原抗体结合区域而导致抗原抗体的特异性识别受到抑制，从而影响诊断试剂的灵敏度。本发明所采用的间接标记法先通过在抗体表面添加巯基，然后再对巯基进行标记，通过外接铰链臂的形式减弱了空间位阻的作用，外加的巯基不会改变抗体原本的结构，不同巯基基团空间距离更远，基团间的相互影响可以忽略不计，从而完整保留抗体特异性识别能力，具有更高的灵敏度。
[0059]
实施例3：试剂盒重复性和稳定性测试试剂的重复性由cv值来确定，稳定性由37℃加速老化来确定，具体按下述实验方法进行：(1)检测浓度为0.5ng/ml、10ng/ml的两个样本，每个样本重复测10次，分别验证以酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物的结果，计算每个样本的变异系数，结果见表2。
[0060]
(2)将添加酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物的试剂放置于37℃，检测浓度为0.1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的三个样本，连续监测10天，结果见表3。
[0061]
对比例2试剂盒制备过程中，r1的配制不添加酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物，其余步骤与实施例1一致，使用与实施例3相同的方法测试其重复性和稳定性，结果见表2和表3。
[0062]
表2.试剂盒重复性测试结果表3.试剂盒稳定性测试结果
由上述结果可知，添加以酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物的试剂盒，经过10次测定后，两个测试样本的cv值仅为4.2％和3.7％，明显小于不添加共反应物的试剂盒，表明本发明添加共反应物的试剂盒具有更好的重复性。本发明添加共反应物的试剂盒在37℃条件下经10天的稳定性测试后，试剂基本无变化，稳定性优于未添加共反应物的试剂盒。
[0063]
实施例4：试剂盒抗干扰性和相关性测试将实施例1制备得到的添加酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物的试剂盒分别与目前市场上在售的主流进口试剂盒测试结果进行比对，添加共反应物的免疫诊断试剂盒与进口试剂盒相关性方程为y＝0.9121x+0.2202(r2＝0.9701，n＝48)，结果如图1所示。
[0064]
对比例3试剂盒的制备不添加酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物，其余步骤与实施例1一致，使用与实施例4相同的方法测试其抗干扰性和相关性，不添加共反应物的免疫诊断试剂盒与进口试剂盒相关性方程为y＝0.9029x+0.3139(r2＝0.8186，n＝48)，结果如图1所示。
[0065]
由图1和图2的结果可知，本发明添加酪蛋白酸钠、聚赖氨酸作为共反应物的试剂盒r2＝0.9701，抗干扰能力和相关性优于未添加共反应物的试剂盒。
[0066]
实施例5：试剂盒信噪比和线性范围测试在r2试剂中加入一定量的氨基三乙酸，不同浓度的氨基三乙酸具有不同的络合能力，合适浓度的氨基三乙酸可以作为反应增强剂，极大的提高反应的信号值，获得较宽线性范围。加入反应增强剂的结果见表4。
[0067]
对比例4在r2试剂中不含氨基三乙酸，试剂盒制备的其余步骤与实施例1一致，使用与实施例5相同的方法测试其信噪比并计算线性范围，不添加反应增强剂的结果见表4。
[0068]
表4.试剂盒信躁比测试结果
由结果可知，本发明提供的试剂盒制备方法中，r2的制备加入氨基三乙酸作为反应增强剂，与不添加氨基羧酸类物质的试剂盒进行对比，在不同的待检样品浓度范围都具有更高的信噪比，这也意味着依照本发明提供的方法制备的试剂盒具有更好的灵敏度。同时，随着待检样品浓度的升高，添加氨基三乙酸作为反应增强剂的试剂盒依然保持良好的线性，未添加增强剂的试剂盒反应已到达平台期。可见，添加反应增强剂有助于获得更宽的线性和检测范围。