一种盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法与流程

1.本发明属于原料药的检测技术领域，尤其涉及一种盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法。


背景技术：

2.青风藤味苦、辛，性平，归肝脾经，被收录于2020版《中国药典》一部。青风藤具有祛风利湿、活血解毒的功能，临床上多用于治疗风湿性和类风湿性关节炎，强直性脊椎炎以及心律失常等。青风藤的主要有效成分为生物碱类成分，包括青藤碱、木兰花碱和蝙蝠葛碱等。其中的青藤碱是青风藤的指标性有效成分，具有广泛药理活性，包括镇痛、镇静、免疫抑制、降压、抗炎、抗心律失常等。
3.青藤碱水溶性较差，所以临床上常以其盐酸盐“盐酸青藤碱”入药。盐酸青藤碱制剂有片剂和注射剂等多种剂型，其原料药常用结晶工艺获得。目前常用液相色谱法检测盐酸青藤碱原料药。已报道的检测方法注重检测盐酸青藤碱含量，却忽视其中的杂质情况，不利于全面反映出盐酸青藤碱原料药品质。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法。
5.本发明采用的技术方案是：一种盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法。该方法包括以下步骤：
6.(1)供试品溶液配制
7.称取盐酸青藤碱原料药20mg，置于5ml容量瓶中，使用5％乙腈定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，或在12000rpm下离心10min，即得。
8.(2)在规定条件下运行液相色谱
9.规定条件是指：色谱柱：waters acquity uplc beh c
18
色谱柱(2.1mm
×
100 mm，1.7μm)；流动相：a相为1.0mmol/l甲酸铵溶液，用氨水调至 ph＝9.3，b相为溶于80％乙腈的1.0mmol/l甲酸铵溶液,用氨水调至 ph＝8.5；进样量：2.0μl；检测波长：210nm；柱温：35℃；流速： 0.300ml/min。梯度条件见下表。后运行时间为9min。
10.表1梯度条件
[0011][0012][0013]
将配好的样品注入液相色谱仪，按照规定条件运行，即可得到液相色谱图。图1为所得液相色谱图。其中12min左右的大峰为盐酸青藤碱。其他小峰均为杂质。
[0014]
a相流动相为碱性，ph值范围在9.0-11.0之间；进一步，优选值为ph 值＝9.3。
[0015]
b相流动相为碱性，ph值范围在8.2-9.4之间；进一步，优选值为ph 值＝8.5。
[0016]
b相流动相主要为乙腈，但含有一定比例的水，水比例范围在10％-30％之间；进一步，优选值为20％。
[0017]
盐酸青藤碱原料药的2个主要杂质峰(z2和z1号)在tr＝15.16min 和18.25min；2个次要杂质峰(c2和c1号)在tr＝5.32min和11.28 min。
[0018]
本发明提供的一种盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法的有益效果在于：相比现有方法，本发明方法检测盐酸青藤碱原料药中的杂质种类较多，有利于准确反映其质量，适合推广用于企业中盐酸青藤碱原料药的检测。
附图说明
[0019]
图1盐酸青藤碱原料药液相色谱指纹图谱
[0020]
图2多批次注射用盐酸青藤碱原料药
[0021]
图3多批次口服用盐酸青藤碱原料药
[0022]
图4盐酸青藤碱原料药指纹图谱
[0023]
图5不同检测波长下的盐酸青藤碱原料药色谱图
[0024]
其中红色为262nm，蓝色为228nm，黑色为210nm
[0025]
图6盐酸青藤碱注射用原料药相似度检测
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图2-4仅仅是本发明的一些实验例或实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图及本说明书的内容获得更多实验相关的信息(如实验方法等)。盐酸青藤碱原料药的2个主要杂质峰(z2和z1号)在tr＝15.16min 和18.25min；2个次要杂质峰(c2和c1号)在tr＝5.32min和11.28 min。
[0027]
本发明盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法，实现了更全面地反映出盐酸青藤碱原料药质量的发明目的。
[0028]
实验例
[0029]
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实验例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实验例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030]
需要说明的是，本发明说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等检测领域公知的重量单位。
[0031]
实验例
[0032]
1.检测波长的优化
[0033]
所建立的检测波长是通过以下实验确定的：通过比较262nm、228nm 以及210nm波长下的指纹谱图，发现上述几个波长下210nm检测得到的谱图色谱峰高度较平均，特征峰数量多，色谱峰吸收强度大。见图5。
[0034]
2.流动相组成和ph值的优化
[0035]
供试品溶液制备方法为：称取盐酸青藤碱粗品5mg，置于5ml容量瓶中，使用5％乙腈定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。流动相a相中加入甲酸铵制成1、2、10mmol/l的甲酸铵溶液并加入氨水调节ph至10.0，b相为溶于80％乙腈的相应浓度的甲酸铵溶液，对比发现均能够对各成分实现良好分离，更进一步地，本发明a、b两相均选用1mmol/l的甲酸铵溶液。
[0036]
考察流动相ph值，加入氨水调节a相ph值为9.0-10.0，b相所加氨水与a相等量。通过对比进一步优选a相ph为9.3，能够对样品中各成分实现良好分离，此时b相ph为8.5。
[0037]
3.柱温的优化
[0038]
供试品溶液制备方法为：称取盐酸青藤碱原料药20mg，置于5ml 容量瓶中，使用5％乙腈定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。所对比的柱温为30℃、35℃、40℃。经对比发现30-40℃区间内都能实现较好的分离效果，更进一步地，本发明选择柱温为35℃。
[0039]
4.流动相流量的优化
[0040]
供试品溶液制备方法为：称取盐酸青藤碱原料药20mg，置于5ml 容量瓶中，使用
5％乙腈定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。所对比流速为0.250、0.300、0.350ml/min。经对比发现0.250—0.350ml/min区间内都能实现较好的分离效果，更进一步地，本发明选择流速为0.300ml/min。
[0041]
5.供试品制备溶剂的优化
[0042]
供试品溶液制备方法为：称取盐酸青藤碱原料药20mg，置于5ml 容量瓶中，使用溶剂定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。所对比溶剂为水、5％乙腈、10％甲醇、甲醇，对比发现杂质z1在5％乙腈所配置的样品溶液中峰面积更大，图谱在 20min后无杂质峰出现，且5％乙腈最为接近流动相初始比例，更进一步地，本发明选择供试品配置溶剂为5％乙腈。
[0043]
6.进样精密度考察
[0044]
取盐酸青藤碱原料药制备供试品溶液，连续进样6次，以盐酸青藤碱为参照峰，考察色谱峰各峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，从而考察仪器的精密度，实验结果如表1所示。
[0045]
表1盐酸青藤碱原料药指纹图谱方法学考察精密度实验结果
[0046][0047][0048]
7.重复性考察
[0049]
取盐酸青藤碱原料药六份，分别制备供试品溶液并进样，以盐酸青藤碱为参照峰，考察色谱峰各峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，从而考察方法的重复性，实验结果如表2所示。
[0050]
表2盐酸青藤碱原料药指纹图谱方法学考察重复性实验结果
[0051][0052]
8.稳定性考察
[0053]
取盐酸青藤碱原料药制备供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、 16h、24h进行检测，以盐酸青藤碱为参照峰，考察色谱峰各峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，从而考察供试品溶液的稳定性，实验结果如表3所示。
[0054]
表3盐酸青藤碱原料药指纹图谱方法学考察稳定性实验结果
[0055][0056]
9.多批次原料药的相似度
[0057]
以yz-200301为参照图谱，对照图谱生成方法为中位数，时间窗为0.1。
[0058]
10批次注射用盐酸青藤碱原料药的相似度为0.999～1.000之间，相似度很高。见图6
实施例
[0059]
盐酸青藤碱原料药的杂质指纹图谱分析方法，包括以下步骤：
[0060]
(3)供试品溶液配制
[0061]
称取盐酸青藤碱原料药20mg，置于5ml容量瓶中，使用5％乙腈定容，充分溶解，振荡均匀后使用0.22μm滤膜过滤，或在12000rpm下离心10min，即得。
[0062]
(4)在规定条件下运行液相色谱
[0063]
规定条件是指：色谱柱：waters acquity uplc beh c
18
色谱柱(2.1mm
×
100 mm，1.7μm)；流动相：a相为1.0mmol/l甲酸铵溶液，用氨水调至 ph＝9.3，b相为溶于80％乙腈的1.0mmol/l甲酸铵溶液,用氨水调至 ph＝8.5；进样量：2.0μl；检测波长：210nm；柱温：35℃；流速：0.300ml/min。梯度条件见下表。后运行时间为9min。
[0064]
表1梯度条件
[0065][0066]
将配好的样品注入液相色谱仪，按照规定条件运行，即可得到液相色谱图。如图1，其中12min左右的大峰为盐酸青藤碱。其他小峰均为杂质。
[0067]
a相流动相为碱性，ph值＝9.3。
[0068]
b相流动相为碱性，ph值＝8.5。
[0069]
b相流动相主要为乙腈，但含有一定比例的水为20％。
[0070]
盐酸青藤碱原料药的2个主要杂质峰(z2和z1号)在tr＝15.16min 和18.25min；2个次要杂质峰(c2和c1号)在tr＝5.32min和11.28 min。