一种更年安片的质量控制方法与流程

1.本发明涉及药品检测领域，具体涉及更年安片的质量控制方法，更具体地涉及更年安片的高效液相色谱指纹图谱检测及指纹图谱的建立。


背景技术：

2.更年安由制何首乌、首乌藤、熟地黄、地黄、五味子、泽泻、牡丹皮、钩藤、玄参、茯苓、仙茅、麦冬、浮小麦、磁石、珍珠母共15味药材经水煎、渗漉、浓缩等工艺精制而成。现有质量检测标准针对的是大黄素的含量高低评价更年安质量，然而处方中制何首乌和首乌藤才是更年安中发挥主要作用的两味药品。二者的有效成分均为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷。已有研究针对二者测定更年安中的6个活性成分的含量(hplc-dad法同时测定更年安中6个活性成分的含量，施法等，药物分析杂质2012,32(1))，但是该方法针对6种成分采用了6种检测波长分别测量，方法复杂。
3.中药指纹图谱是建立在中药化学成分系统研究基础上的一种综合的、可量化的中药质量控制手段，可以从整体上描述和评价其质量，具有信息量大、特征强、整体性等特点。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，指纹图谱能够全面地反映药物所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供一种更年安片的指纹图谱测定方法，通过此方法可以保证该中药片剂质量的稳定性、一致性和可控性，从而确保药物的安全性和有效性。
5.为了实现上述目的，本发明提供一种更年安片的指纹图谱测定方法，包含以下步骤：
6.(1)参照品溶液的制备
7.精密称取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加甲醇溶解制得参照品溶液；
8.(2)供试品溶液的制备
9.取所述更年安片，除去包衣，研细，加入甲醇溶液，加热回流，滤过，取续滤液即得。
10.(3)测定
11.吸取所述参照品溶液和供试品溶液，进行高效液相色谱分析，色谱条件如下:
12.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为260-296nm；以甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.8-1.2ml/min，柱温为20-30℃。
13.在本发明指纹图谱测定方法的一个具体实施方式中，其中步骤(3)中所述梯度程序为：
[0014][0015]
在本发明指纹图谱测定方法的一个具体实施方式中，所述步骤(3)中检测波长为270nm。
[0016]
在本发明指纹图谱测定方法的一个具体实施方式中，所述步骤(3)中柱温为20℃。
[0017]
本发明还提供一种更年安片指纹图谱建立方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)参照品溶液的制备
[0019]
精密称取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷对照品，加甲醇溶解制得参照品溶液；
[0020]
(2)供试品溶液的制备
[0021]
取所述更年片，除去包衣，研细，加入甲醇溶液，加热回流，滤过，取续滤液即得。
[0022]
(3)获得色谱图
[0023]
吸取所述参照品溶液和供试品溶液，进行高效液相色谱分析，色谱条件如下:
[0024]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为260-296nm；以甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.8-1.2ml/min，柱温为20-30℃，洗脱梯度如下：
[0025][0026]
(4)生成对照指纹图谱
[0027]
选择合格的多批所述更年安片的色谱图，以2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷峰为参照峰，得到10个共有峰的图谱，其中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷保留时间为55.2min、哈巴俄苷保留时间为92.2min、五味子醇甲保留时间为101.5min、五味子甲素保留时间为122.6min、五味子乙素保留时间为128.1min、仙茅苷保留时间为56.9min，10个共有峰的相对保留时间为：
[0028][0029]
在本发明更年安片指纹图谱建立方法的一个具体实施方式中，其中，所述步骤(3)中检测波长为270nm。
[0030]
本发明更年安片指纹图谱建立方法的一个具体实施方式中，所述步骤(3)中柱温为20℃。
[0031]
本发明针对更年安片药味繁多，成分复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反应药品的全面信息，建立了该制剂的指纹图谱检测方法，以更好、更有效的控制更年安片的质量。
附图说明
[0032]
图1：使用流动相系统1的指纹图谱
[0033]
图2：使用流动相系统2的指纹图谱
[0034]
图3：使用流动相系统3的指纹图谱
[0035]
图4：使用流动相系统4的指纹图谱
[0036]
图5：使用流动相系统5的指纹图谱
[0037]
图6：供试品超声提取或回流提取得到的指纹图谱
[0038]
图7：不同提取溶剂下得到的指纹图谱
[0039]
图8：不同柱温下的指纹图谱
[0040]
图9：采集140min内色谱信息的指纹图谱
[0041]
图10-1至图10-6分别为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷、哈巴俄苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、仙茅苷作为对照品进行成分确认的指纹图谱。
[0042]
图10-7：供试品图谱
[0043]
图11：多批次样品拟合生成的对照指纹图谱。
具体实施方式
[0044]
实施例1检测波长的选择
[0045]
首先采用dad检测器对供试品进行检测，考察样品色谱峰信息，筛选检测波长。
[0046]
供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，研细，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w,频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0047]
采用ods-4色谱柱，柱温30℃，流速0.8ml/min，乙腈为流动相a，水溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱。进样10ul，采集时间150min，
[0048][0049]
更年安片的处方中有地黄、首乌藤、制何首乌等12味药材，其质量控制成分分别为首乌藤、制何首乌，这两种成分最大吸收在270nm～330nm之间。样品在260nm-296nm波段内色谱吸收丰富，比较样品在260nm、270nm、280nm、296nm处色谱峰情况，270nm的指纹图谱信息量比较多，能够更加充分地体现本品的化学成分，且基线漂移不大，且其余药材成分在270nm处均有吸收，选择270nm做为检测波长。
[0050]
实施例2流动相系统选择
[0051]
供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，研细，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w,频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0052]
采用ods-4色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，考察乙腈-0.05％磷酸溶液、甲醇-0.1％磷酸溶液等系统进行试验。
[0053]
(1)系统1：
[0054]
乙腈为流动相a，0.05％磷酸溶液为流动相b，采集时间50min，洗脱梯度见下表，结果见附图1。
[0055][0056]
(2)系统2：乙腈为流动相a，0.05％磷酸溶液为流动相b，采集时间140min，洗脱梯度见下表，结果见附图2。
[0057][0058]
(3)系统3：甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，采集时间140min，洗脱梯度见下表，结果见附图3。
[0059][0060]
(4)系统4：甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，采集时间140min，洗脱梯度见下表，结果见附图4。
[0061][0062][0063]
(5)系统5：甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，采集时间140min，洗脱梯度见下表，结果见附图5。
[0064][0065]
如上实验可见，甲醇-0.1％磷酸溶液体系(系统5)对更年安片的供试品溶液色谱峰分离效果最好，峰形良好、基线平稳，达到要求的分离度。
[0066]
实施例3提取方式考察
[0067]
取本品20片，除去包衣，研细，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0068]
取本品20片，除去包衣，研细，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量,加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0069]
照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
[0070]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ods-4色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，s/n:7af37032)，以甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为270nm；柱温为25℃。
[0071][0072]
精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见下表、附图6。
[0073][0074]
由上表可知，采用回流提取时，所获取指纹图谱信息量较多，峰响应值较大，故选用回流提取。
[0075]
实施例4提取溶剂考察
[0076]
取本品20片，除去包衣，研细，取3g,精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、无水乙醇20ml，密塞，称定重量,加热回流1小时，放冷，再称定重量，用分别用水、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0077]
测定方法同实施例3。结果见下表，附图7。
[0078]
[0079][0080]
实施例5柱温的考察
[0081]
在色谱指纹图谱测定中，柱温往往会影响分离效果，发明人分别在20℃、25℃、30℃三个柱温条件下，对更年安片供试品溶液的指纹图谱进行分析。其他条件如实施例8。结果表明在20℃时色谱峰分离效果好且基线平稳，故最优选择20℃为检测时柱温。参见附图8。
[0082]
实施例6色谱信息采集时间确定
[0083]
参照品溶液和供试品溶液的制备同实施例8。为考察色谱信息采集时间，对本品进行检测，色谱条件如下：色谱柱为：ods-4色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；检测波长270nm；柱温20℃；流速1.0ml/min；进样量10μl；流动相：以甲醇为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表进行梯度洗脱。结果见附图9，140min后无色谱峰，故只采集140min内的色谱信息。
[0084][0085]
2-o-β-d-葡萄糖苷保留时间为55.2min、哈巴俄苷保留时间为92.2min、五味子醇甲保留时间为101.5min、五味子甲素保留时间为122.6min、五味子乙素保留时间为128.1min、仙茅苷保留时间为56.9min，10个共有峰的相对保留时间为：
[0096]