一种hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚的方法
技术领域：
：1.本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法。
背景技术：
：：2.茶鲜叶中富含多酚类物质，其含量约占茶鲜叶干重的18%-36%，其中儿茶素含量最高，约占多酚总量的70%。儿茶素化合物属于黄烷醇类，其基本结构是2-苯基苯并吡喃。茶叶中分离鉴定的儿茶素多为表型儿茶素，主要有四种，表儿茶素（ec）、表没食子儿茶素（egc）、表儿茶素没食子酸酯（ecg）、表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg），其中egcg在儿茶素中含量最高，占儿茶素总量的50%-80%，具有重要的保健功效。3.近年来，诸多研究证明绿茶的保健功效主要归因于egcg。egcg具有抗氧化、杀菌、抑病毒、消炎、减肥等多种功效。azambuja等研究表明，绿茶egcg具有抗炎活性，其作用机制为儿茶素可以清除体内活性氧，调节炎症信号通路，抑制炎症发生。茶提取物尤其是绿茶提取物和茶多酚可以抑制动物模型中不同器官肿瘤的形成和发展，实验证据表明，茶多酚特别是egcg，可抑制酶活性和信号转导途径，从而抑制细胞增殖和增强细胞凋亡，并抑制细胞入侵。suzuki等研究表明，绿茶具有抗癌、抗肥胖、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等活性，这些活性与egcg的功效密切关联。al-basher等研究表明，gcg可以通过抑制肝铁蓄积来改善铁超负荷引起的大鼠肝毒性，细胞凋亡和氧化应激，改善肝脏抗氧化能力。也有研究报道绿茶还可用来治疗泌尿结石，龋齿等疾病。此外，通过测定egcg含量，可以进行茶叶分级，茶叶处理工艺合理性判断，茶饮料质量辨析等，具有重要的应用意义。4.目前，已有多种方法用于测定茶叶及茶饮料中的儿茶素，如高效液相色谱-二极管阵列检测（hplc-dad）、高效液相色谱-质谱（hplc-ms），衍生后的气相色谱-质谱（gc-ms）等。最常用的方法始终基于hplc分离，然而，基于hplc的方法存在分析时间长和溶剂浪费的局限性。因此，需要一种通量和性价比高的方法来直观地表征茶产品中的egcg。技术实现要素：5.本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种以hptlc为分离检测平台，经快捷的fecl3衍生显影，再联用开源的数字化图片分析软件imagej建立一种高效、经济、可视化筛检方法。6.为了达到上述目的，本发明采用以下方案：一种hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法，其特征在于包括以下步骤:s1、制备标准溶液和衍生溶液egcg标准溶液：精确称取10.0mgegcg标准品，溶于甲醇并定容至10ml，得到1mg/ml标准储备液，4℃冰箱中避光保存，使用时按比例稀释至所需倍数；fecl3衍生溶液：准确称取5g无水三氯化铁标准品，加入100ml无水乙醇，混合均匀后，4℃冰箱中避光保存备用；s2、制备茶饮样品溶液取三种茶饮料适量于单独的离心管中，分别过0.45um水系滤膜后得到三种茶饮料样品溶液，在4℃冰箱中冷藏备用；s3、预洗硅胶板取硅胶板放于自动展开缸中，之后将10ml色谱级甲醇从仪器上部两侧槽中注入展开缸，以其作为流动相进行展开预洗，展开至硅胶板顶端后取出，最后用加热器在120°c条件下干燥20min，降至室温后，用锡纸包装并保存于密封袋中；s4、hptlc色谱展开采用0.5mpa氮气为载体，用100μl注射器吸取样品溶液，通过chromasprayi型点样仪进行精确点样于20cm×10cm的薄层板上，点样的条带长度6mm，条带距离底部10mm，距离左端25mm，对步骤s1和步骤s2制备的标准溶液1～25μl、三种茶饮料样品溶液分别10μl进行点样，在每次取样之间，注射器用甲醇和超纯水分别手动清洗三次，全部样品点样结束后用半自动展开缸进行展开，展开前在仪器的两侧槽内分别注入10ml相对应的流动相，展开完成后将硅胶板置于60°加热器上充分干燥5min，以便挥发去除薄层板上残留的有机溶剂；s5、fecl3变色反应及色谱结果成像将完成色谱分离后的硅胶板通过自动浸渍装置浸入fecl3衍生液中，移动速度3mm/s，停留时间3s，然后将蘸有fecl3衍生液的硅胶板置于薄层色谱加热器上50℃加热，当硅胶板黄棕色背景出现明显的黑色斑点后，使用配备佳能eos700d相机的成像系统对衍生后的硅胶板进行成像记录；s6、分析使用imagej软件中像素灰度转化-积分功能对数字化图像进行模拟扫描定量分析。7.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，步骤s4中展开采用以下具体参数，流动相中氯仿：丙酮：甲酸的体积比为12.5：7.5：2.2，湿度控制3min，预平衡5min，上行展开距离80mm。8.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，步骤s6的具体操作如下，首先将目标条带区域裁剪并保存为pc兼容格式，然后应用imagej软件中的“image-color-splitchannels”功能，将原始图片拆分为三个颜色通道，选出最佳颜色通道后，将该通道下裁剪好的目标区域，使用“analyze-gels”功能定义一个覆盖目标条带起始线和结束线的矩形，然后提取这些矩形在垂直方向上的像素灰度值，并使用“plotlanes”功能进行轮廓分析，然后将图形结果转换为可积分色谱图；最后通过“straightoption”选项绘制基线，使用积分工具“wandtool”定义色谱图中峰的峰面积，所获取的数据峰面积可直接用于定量分析。9.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，所述pc兼容格式为tif文件。10.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，所述三个颜色通道分别为blu通道、red通道、green通道。11.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，步骤s3中所述硅胶板的尺寸为10cm×20cm。12.作为本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的另一种改进，步骤s4中将1～25μl标准溶液和10μl样品溶液，以100nl/s的速度和0.2μl的预排体积进行喷涂于硅胶板上。13.综上所述，本发明相对于现有技术其有益效果是：本发明以hptlc为分离检测平台，经快捷的fecl3衍生显影，再联用开源的数字化图片分析软件imagej建立一种高效、经济、可视化筛检方法，此外，平行操作将衍生后的色谱板联用光密度扫描进行定量，将两种方法进行对比。它们的线性、准确度和精密度都非常接近，但使用imagej图像数字化处理软件代替光密度扫描仪将节省巨大的成本，因此具有很大的实际应用意义。附图说明14.图1（a）为薄层色谱分离衍生结果图；图1（b）为光密度扫描结果图；其中注：1～8：egcg含量依次150、200、300、500、800、1200、1700、2500ng/zone。15.图2为光密度扫描分析得到的egcg标曲图，其中标曲7个点依次对应图4的2～8号轨道。16.图3为没食子儿茶素没食子酸酯标准品（200、400和800ng/zone）和茶饮料样品提取物的hptlc分离和密度测定示意图，其中：（a）分离后hptlc板的图像；（b）分析物在不同条件下的荧光激发光谱；（c）通过密度测量获得的相应色谱图（氘灯和钨灯，620nm激发波长）；各轨道物质：1-200ngegcg；2-400ngegcg；3-800ngegcg；4-茶饮料1；5、6、7-茶饮料1+400ngegcg；8-茶饮料2；9、10、11-茶饮料3+800ngegcg；12-茶饮料1；13、14、15-茶饮料3+200ngegcg。17.图4为经imagej拆分成三个颜色通道的示意图；其中(a)blue;(b)red;(c)green；1～8：egcg含量依次150、200、300、500、800、1200、1700、2500ng/zone。18.图5(a)为“red”通道下egcg的标准曲线图；图5(b)位“green”通道下egcg的标准曲线图。具体实施方式19.以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。20.本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法中所采用的材料、试剂、仪器以及设备如下：1.材料与试剂egcg（》98.0%，纯度），阿拉丁公司；无水乙醇、氯仿、丙酮、甲酸（分析纯）、甲醇（色谱纯）、三氯化铁及其他化学试剂和溶剂，sigma公司；硅胶g60f254板（分析型，序列号hx61210829，规格10cm×20cm），德国merck公司；茶饮料样品，无锡欧尚超市。21.2.仪器与设备高效薄层色谱工作站（配有：研制点样仪原型机、100μl注射器，自制；adc-2自动展开仪、薄层色谱加热器ⅲ、tlc-scanner3薄层色谱扫描仪，瑞士camag公司）；providocsystem-dd70薄层成像系统，德国biostep公司。22.实施例1本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法，包括以下步骤：s1、标准溶液及衍生溶液制备egcg标准溶液：精确称取10.0mgegcg标准品，溶于甲醇并定容至10ml，得到1mg/mlegcg标准储备液，4℃冰箱中避光保存，使用时按比例稀释至所需倍数。23.fecl3衍生溶液：准确称取5g无水三氯化铁标准品，加入100ml无水乙醇，混合均匀后，4℃冰箱中避光保存备用。24.s2、样品预处理取三种茶饮料适量于离心管中，过0.45um水系滤膜后得到样品溶液，在4℃冰箱中冷藏备用。25.s3、硅胶板预洗实验中使用的所有硅胶板，使用前均需进行预洗前处理。取10cm×20cm的硅胶板放于adc-2自动展开缸中，之后将10ml色谱级甲醇从仪器上部两侧槽中注入展开缸，以其作为流动相进行展开预洗，展开至硅胶板顶端后取出，最后用tlc加热器iii在120°c条件下干燥20min，降至室温后，用锡纸包装并保存于密封袋中。26.s4、hptlc色谱展开采用0.5mpa氮气为载体，用chromasprayi型点样仪进行精确点样于20cm×10cm的薄层板上，注射器100μl，点样的条带长度6mm，条带距离底部10mm，距离左端25mm，条带间距自动计算。具体操作是将1～25μl标准溶液和10μl样品溶液，以100nl/s的速度和0.2μl的预排体积进行喷涂于硅胶板上。在每次取样之间，注射器用甲醇和超纯水分别手动清洗三次。点样结束后用adc-2（camag）半自动展开缸进行展开，展开前需在仪器的两侧槽内分别注入10ml相对应的流动相，展开采用以下具体参数：氯仿/丙酮/甲酸（12.5/7.5/2.2，v/v/v），湿度控制3min，预平衡5min，上行展开距离80mm，展开完成后系统自动结束，之后将硅胶板置于60°ctlc加热器iii上充分干燥5min，以便挥发去除薄层板上残留的有机溶剂，这对于获得干净的背景至关重要。27.s5、fecl3变色反应及色谱结果成像将完成色谱分离后的硅胶板通过自动浸渍装置浸入fecl3衍生液中，移动速度3mm/s，停留时间3s。然后将蘸有fecl3衍生液的硅胶板置于薄层色谱加热器上50℃加热。当硅胶板黄棕色背景出现明显的黑色斑点后，使用配备佳能eos700d相机的成像系统对衍生后的硅胶板进行成像记录，相机参数设定为：白光底部透射光源，自动对焦和校正。28.s6、图像数字化处理软件定量分析方法对于色谱分离结果的分析，使用imagej软件（1.52a版）中像素灰度转化-积分功能对数字化图像进行模拟扫描定量。具体操作如下，首先将目标条带区域裁剪并保存为pc兼容格式（.tif文件），然后应用imagej软件中的“image-color-splitchannels”功能，将原始图片拆分为三个颜色通道（blue、red、green），选出最佳颜色通道后，将该通道下裁剪好的目标区域，使用“analyze-gels”功能定义一个覆盖目标条带起始线和结束线的矩形，然后提取这些矩形在垂直方向上的像素灰度值，并使用“plotlanes”功能进行轮廓分析，然后将图形结果转换为可积分色谱图；最后通过“straightoption”选项绘制基线，使用积分工具“wandtool”定义色谱图中峰的峰面积，所获取的数据峰面积可直接用于定量分析。29.为了进一步验证本发明hptlc图像分析快速定量茶中茶多酚(egcg)的方法的精确性,本发明作以下平行试验:hptlc-光密度检测方法定量茶饮料中egcg,具体操作如下：在hptlc分离中，对硅胶板分离效果评估的方法一般是目测检视法。使用0.1mg/mlegcg标准溶液依次点样1.5ul、2ul、3ul、5ul、8ul、12ul、17ul、25ul，egcg标准溶液经hptlc分离后，再用fecl3浸渍后，fecl3均匀分布于整块薄层板上，含有egcg的区域（图1（a）各轨道的变色区域）由黄棕色变为黑色，而其他区域则保持黄棕色不变。使用不同流动相进行hptlc分离条件优化，结果表明，在流动相为氯仿-丙酮-甲酸（体积比12.5：7.5：2.2）时，egcg的比移值（rf）为0.21，同一轨道上的目标物质与干扰杂质能够实现良好的分离。将分离浸渍干燥后的结果图使用tlc-scanner3薄层色谱扫描仪扫描8个轨道，结果如图1（b），发现视觉极限值为2号轨道分离斑点，所以标准曲线的制作舍弃1号轨道分离斑点，标准曲线绘制结果如图2，选择2-8号轨道的7个点得到标准曲线为y=3.1762x-178.26，r2=0.9974;选择2-6号轨道的5个点得到标准曲线为y=3.5009x-358.67，r2=0.9997，可知选择2-6号轨道5个点制作的标准曲线线性关系更好且满足定量要求。30.选取优化后的流动相进行色谱分离，得到图3（a）的分离结果，接着把样品板分离结果在吸光模式下进行密度测量，以获得准确的定量。为了确定最佳激发波长，预先分析了hptlc板上egcg的全波长扫描光谱。如图3（b）所示，显然egcg标准品在620nm处有最大光吸收，同时样品轨道中的egcg条带显示出相同的光谱轮廓，表明潜在基质对egcg吸光光谱的影响不显著。此外，还评估了不同光源的性能，包括氘灯、钨灯、氘灯和钨灯以及汞灯。通过比较，选择了氘灯和钨灯，因为它不仅提供了最高的峰强度，而且有助于使色谱图平滑，如图3（c）所示。因此，将620nm光（氘灯和钨灯）用于定量测量。31.hptlc-光密度方法的定量能力为了进一步评估优化后光密度的定量能力，在标准曲线的基础上确定方法的检测限（lod）和定量限（loq）。egcg在200～1200ng/zone范围内具有良好的线性关系（r2=0.9997）。根据德国din32645方法以至少95%的置信区间确定方法的lod和loq，通过计算得出egcg的lod和loq分别为25ng/zone和50ng/zone，将样品提取物的上样量固定在10ml，这相当于茶饮料样品中egcg的lod和loq分别为2.5mg/kg和5mg/kg，如果需要，可通过使用更大的上样量来增加检测能力。在任何情况下，即使在极低水平下，该检测能力应足以定量检测egcg，因为茶饮料中茶多酚（儿茶素类约占20%）的浓度一般约为50-80mg/g。同时该方法也取得了非常高的精密度（rsd《3.2%），因此建立的hptlc-光密度方法用于测定egcg含量具有很强的实用性。32.hptlc-光密度方法的准确性表1hptlc-光密度的准确性和精密度评估table1accuracyandprecisionevaluationofhptlc-光密度注：a数值为3次测定的平均值b数值为3次平行分析下色谱峰面积的相对标准偏差rsd为了进一步评估优化后hptlc-光密度方法的准确性，选取3种茶饮料进行加标回收率实验。具体实施是在选取的茶饮料1、茶饮料2、茶饮料3样品中分别添加浓度为20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg的egcg的标准溶液，结果如表2所示，添加不同浓度的egcg的标准溶液后，茶饮料1、茶饮料2、茶饮料3的回收率分别在103.5%～110.8%、95.3%～111.2%、99.3%～111.2%之间，表明hptlc-光密度方法对样品中egcg的测定具有较高的准确性。其中不同样品的加标回收率均独立于标品添加量，表明该方法对不同基质样品中egcg的测定也同样适用。33.hptlc-imagej定量方法的建立经imagej软件将hptlc分离结果图拆分为blue、red、green三个色彩通道，如图4所示，我们可明显看出blue通道下目标斑点不显现，于是，接下来我们选择red和green两种颜色通道制作标准曲线，标准曲线制作结果如图5，取2～6轨道的五个点制作标准曲线，在“red”通道下，200～1200ng/zone范围内标准曲线为y=11.87x-1961.2，r2=0.9983；在“green”通道下，200～1200ng/zone范围内标准曲线为y=14.535x-1619.9，r2=0.9995，因此选择相关性更高的“green”通道下得到的标准曲线进行后续分析。34.hptlc-imagej方法验证hptlc-imagej方法的定量能力在200～1200ng/zone范围内，“green”颜色通道下，egcg具有良好的线性关系（r2=0.9995）。根据德国din32645方法以至少95%的置信区间确定方法的lod和loq，通过计算得出egcg的lod和loq分别为34ng/zone和68ng/zone，将样品提取物的上样量固定在10ml，这相当于茶饮料样品中egcg的lod和loq分别为3.4mg/kg和6.8mg/kg，如果需要，可通过使用更大的上样量来增加检测能力。35.hptlc-imagej方法的准确性表2hptlc-imagej的准确性和精密度评估table2.accuracyandprecisionevaluationofhptlc-imagej注：a数值为3次测定的平均值b数值为3次平行分析下色谱峰面积的相对标准偏差rsd在选取的茶饮料1、茶饮料2、茶饮料3样品中分别添加浓度为20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg的egcg的标准溶液，结果如表2-1所示，添加不同浓度的egcg的标准溶液后，茶饮料1、茶饮料2、茶饮料3的回收率分别在102.4%～110.8%、102.3%～118.8%、100.3%～113.5%之间，表明hptlc-光密度扫描对样品中egcg的测定具有较高的准确性。三次平行分析得到的rsd《6.7%，证明所建方法具有良好的精密度。36.两种方法对比：hptlc-imagej和hptlc-光密度的线性相关系数相差不大且都达到0.999以上；两种方法的回收率也都满足要求，表明两种方法都具有良好的准确性；两种方法的精密度也相差不大，hptlc-imagej略优于hptlc-光密度扫描。综上，hptlc-imagej可以较好的代替hptlc-光密度扫描，实现方法经济、高效、准确有效的目标。37.表3方法对比结论本发明建立了hptlc-imagej和hptlc-光密度两种快速检测茶饮料中活性物质egcg含量的方法。在hptlc-imagej方法中“green”通道下图像分析得到的标准曲线相关性系数高于“red”通道，因此，实验分析都在“green”通道下进行。将两种方法进行对比，它们的线性、准确度和精密度都非常接近，但使用imagej图像数字化处理软件代替光密度扫描仪将节省巨大的成本，因此具有很大的实际应用意义。38.本发明公开了以hptlc分析平台，平行使用图像分析法和光密度法，建立并对比两种快速检测茶饮料中egcg含量的方法；以三种市售茶饮料为代表性样品，对比两种方法的应用性能，评估图像分析替代仪器依赖的光密度检测作为茶饮料中egcg含量检测的新型方法的先进性。结果显示，hptlc-图像分析方法、hptlc-光密度方法检测的定量限分别为6.8mg/kg、5mg/kg，都足以定量茶饮料中egcg；两种方法目标物在200-1200ng/zone浓度范围内线性相关系数相差不大且都达到0.999以上；两种方法的回收率都满足要求，表明两种方法都具有良好的准确性；两种方法的精密度也相差不大。综上，在hptlc检测技术中,简单易用的图像分析可以较好的代替昂贵的仪器化光密度扫描，提高方法的性价比和实用性。39.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12当前第1页12