专利名称:基于多功能探针的单细胞/单分子成像光/电综合测试仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞的成像和分析领域，特别涉及一种基于原子力显微镜的单细胞/单分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪及其制作方法。
背景技术：
扫描隧道显微镜(STM)最早被发明并用于导体或半导体表面形貌和电学性质的研究。其原理是将尖锐的纳米金属探针针尖紧靠导体或半导体样品的表面，并在二者之间施加一电位差，通过检测隧道电流实现成像。
随后发明的原子力显微镜(AFM)使得非导体材料原子尺度成像成为可能，它通过检测待测样品表面与一个微型力敏感元件(探针)之间极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。目前，通过进一步改进，AFM除可用于不同材料表面形貌表征之外，也被广泛应用于材料电学、磁学、分子间作用力等多方面性质的研究，例如:采用导电探针可同时获得表面形貌和表面电学性质图谱；采用磁性探针可同时获得表面形貌和表面磁学性质图谱；采用修饰过的探针，可用于分子间相互作用力的研究；通过使用液态样品池，可实现液体中材料表面成像；采用电化学样品池，可在进行电化学反应的同时，实时监测材料表面形貌的变化；通过与拉曼光谱联用，可同时获得表面形貌和材料表面的拉曼光谱图。
AFM也被广泛的应用于生命科学的研究中。它可以直接用于细胞表面形貌观察，从而研究细胞的黏附、运动等过程；可以直接用于观测细胞膜上蛋白质通道在不同条件下的开关状态；通过探针表面修饰，可以研究受体-配体或抗原-抗体之间的相互作用；通过与倒置荧光显微镜联用，可同时获取细胞表面形貌、细胞光学显微图片和细胞荧光染色图片。虽然AFM为生命科学的研究提供了诸多便利，但是它还存在以下不足:(I)无法测定细胞释放或溶液环境中存在的小分子；(2)无法测定单个细胞内部代谢过程中生化指标的变化；
(3)无法实现细胞内亚细胞及分子水平的定位研究；(4)无法在获取细胞表面形貌后，在纳米尺度定位定量检测细胞内亚细胞及分子水平的光/电信号。
现有的基于纳米光纤探针的单细胞检测仪，虽然具有高灵敏度，可以实现单细胞级别的检测，相比于传统的需要粉碎数以百万计的细胞的检测手段，需要的细胞样品量大大减少，提高了亚细胞水平的生物分子学的研究水平与早期疾病检测的成功率。但是其不足之处在于:(I)微操作系统定位不够精确，尚在微米级；(2)无法实现细胞表面成像；(3)无法建立细胞释放生化分子与细胞膜表面性质/通道位置之间的相关性；(4)检测与定位仅在亚细胞水平。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种能同时实现原子力显微成像与光/电分析的多功能纳米探针；以及制造一种基于原子力显微镜的单细胞/单生物分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪。
本发明的目的是这样实现的: 本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的:
本发明提供的多功能纳米探针，包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层；所述光纤层为由多模光纤拉制、弯曲成的纳米探针。
进一步,所述纳米探针尖端为通过激光加热的方法弯曲形成AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层。
进一步，所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成尖端为2-10纳米的探针。
进一步，所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层。
进一步，所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层。
进一步，所述绝缘层为在尖端裸露的纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成的绝缘层。
进一步，还包括与所述多功能纳米探针相配合的样品池，所述样品池包括由聚二甲基硅氧烷制备的柱状透明容器壁和与透明容器壁配合的玻璃底；所述玻璃底上溅射上对电极和参比电极；所述对电极材料为金属钼，呈不封闭环状沿容器壁内侧排布，且一端延伸至透明容器壁外侧；所述参比电极材料为金属银，呈长方形一端位于容器壁内侧，一端延伸至透明容器壁外侧，且与对电极不能重合。
本发明的目的之二是通过以下技术方案来实现的:
本发明提供的单细胞/单分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪，包括数据采集与分析单元、光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统、光子探测单元、样品池、多功能纳米探针和原子力显微镜系统；
所述数据采集与分析单元，用于接收并分析电学检测单元和光子探测单元的数据信
号;
所述光源单元，用于生成波长和强度均可调的激励光信号，并通过光纤层发射至待测样品；
所述电学检测单元，用于发射激励电信号，并接收检测反应后的电信号，所述电学检测单元的信号发射端通过纳米电极层与信号接收端连接；
所述细胞样品定位系统，用于移动及定位盛有待测样品的样品池；
所述光子探测单元，用于接收通过待测细胞光信号和检测细胞光信号的强度，所述细胞光信号通过滤波器和倒置显微镜发送；
所述多功能纳米探针，用于同时实现原子力显微成像与光/电分析；
所述样品池，用于承载待测细胞；
所述原子力显微镜系统，用于精确移动多功能纳米探针，实现样品表面纳米级别定位以及细胞内亚细胞以及分子水平定位，并用于获取样品纳米结构形貌信息；
所述光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统、光子探测单元分别与数据采集与分析单元电连接。
进一步，所述多功能纳米探针，包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层；所述光纤层为由多模光纤拉制弯曲成的纳米探针；所述纳米探针尖端为通过激光加热的方法弯曲形成的AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层；所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成2-10纳米的探针；所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层；所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层；所述绝缘层为在尖端裸露的纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成的绝缘层。
进一步，所述样品池包括由聚二甲基硅氧烷制备的柱状透明容器壁和与透明容器壁配合的玻璃底；所述玻璃底上溅射上对电极和参比电极；所述对电极材料为金属钼，呈不封闭环状沿容器壁内侧排布，且一端延伸至透明容器壁外侧；所述参比电极材料为金属银，呈长方形一端位于容器壁内侧，一端延伸至透明容器壁外侧，且与对电极不能重合。
本发明的优点在于:本发明提供一种基于原子力显微镜的单细胞/单生物分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪，在原子力显微镜的基础上，应用纳米电学探针、纳米光学探针以及原子力显微成像等技术制成一能同时实现成像与光/电分析的多功能纳米探针，进而提供一种全新的单细胞/单生物分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪。该发明包含能对单细胞/单分子原子力扫描成像并同时进行光/电检测的纳米探针制作方法、样品池的制作方法及相关的光学、电学与力学的测试分析仪器。
该测试仪基于原子力显微镜，极大的提高了时空分辨率和可检测的靶标物范围，不仅可对活体细胞及在细胞中发挥重要生物化学作用的生物分子成像，还可以同时利用纳米电学和光学探针定量分析细胞生物分子及其相互作用，实时检测分析单细胞内的生物化学机制。因此，该仪器将能广泛用于生物及医学中在亚细胞和分子水平的基础研究和疾病检测，对于肿瘤早期诊断、药物开发、食品科学与农业科学的发展意义重大。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
图1为纳米AFM双功能探针结构示意图；
图2为样品池结构俯视图；
图3为样品池结构侧面图；
图4为本发明的结构示意图。
图中，数据采集与分析单元-1、光源单元-2、电学检测单元_3、细胞样品定位系统_4、光子探测单元-5、样品池_6、多功能纳米探针_7、原子力显微镜系统-8、倒置显微镜_9、光纤层-71、纳米电极层-72、绝缘层-73、激光反射层-74、对电极-61、参比电极-62。
具体实施方式
以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
图1为纳米AFM双功能探针结构不意图，图2为样品池结构俯视图，图3为样品池结构侧面图，图4为本发明的结构示意图，如图所示:本发明提供的多功能纳米探针，能同时实现原子力显微成像与光/电分析的多功能纳米探针。该探针在对单细胞或单个生物分子表面成像时，能同时向细胞发射预设的激励的光和电信号并接收细胞或生物分子反应的光和电信号，进行定量光/电检测分析。综合的成像、光或电检测分析能比单纯的成像，光检测或电分析提供更多的信息，从而为单细胞及单分子水平检测提供极其强大的分析手段。
该双功能探针包括光纤层71和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层72、绝缘层73 ;所述光纤层为由多模光纤拉制成的纳米探针。
所述纳米探针尖端为通过弯曲形成AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层74。
所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成2-10纳米的探针。
所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层。
所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层。
所述绝缘层为在纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成的绝缘层。
本发明提供与多功能纳米探针配合使用的样品池，可供上述多功能纳米探针实现AFM实时扫描和光/电分析。包括透明微型电解池、对电极61、参比电62极的可用于AFM实时扫描成像、电化学和光学测试及信号采集的样品池。
包括由聚二甲基硅氧烷制备的柱状透明容器壁和与透明容器壁配合的玻璃底；所述玻璃底上溅射上对电极和参比电极；所述对电极材料为金属钼，呈不封闭环状沿容器壁内侧排布，且一端延伸至透明容器壁外侧；所述参比电极材料为金属银，呈长方形一端位于容器壁内侧，一端延伸至透明容器壁外侧，且与对电极不能重合。
本发明还包括一种与多功能纳米探针和样品池配合使用的同步综合测试仪，如图4，包括数据采集与分析单元1、光源单元2、电学检测单元3、细胞样品定位系统4、光子探测单元5、样品池6、多功能纳米探针7和原子力显微镜系统8 ；
所述数据采集与分析单元，用于接收并分析电学检测单元和光子探测单元的数据信
号;
所述光源单元，用于生成波长和强度均可调的激励光信号，并通过光纤层发射至待测样品；
所述电学检测单元，用于发射激励电信号，并接收检测反应后的电信号，所述电学检测单元的信号发射端通过纳米电极层与信号接收端连接；
所述细胞样品定位系统，用于移动及定位盛有待测样品的样品池；
所述光子探测单元，用于接收通过待测细胞光信号和检测细胞光信号的强度，所述细胞光信号通过滤波器和倒置显微镜9发送；
所述多功能纳米探针，用于同时实现原子力显微成像与光/电分析；
所述样品池，用于承载待测细胞；
所述原子力显微镜系统，用于精确移动多功能纳米探针，实现样品表面纳米级别定位以及细胞内亚细胞以及分子水平定位，并用于获取样品纳米结构形貌信息；
所述光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统、光子探测单元分别与数据采集与分析单元电连接。
所述多功能纳米探针，包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层；所述光纤层为由多模光纤拉制成的纳米探针；所述纳米探针尖端为激光加热的方法弯曲形成AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层；所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成2-10纳米的探针；所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层；所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层。
所述样品池包括由聚二甲基硅氧烷制备的透明容器和与透明容器配合的玻璃盖；所述玻璃盖上溅射上环状钼电极和参比电极。
本发明提供的一种基于原子力显微镜的单细胞/单生物分子实时成像与光/电分析同步综合测试仪，它既可以用来获取单细胞或单生物分子在纳米尺度的结构信息，也可以定量获取细胞内、细胞释放或溶液环境中的生化分子信息，并建立二者之间的联系。该测试仪极大的提高了单细胞或单分子检测的时空分辨率和可检测的靶标物范围，可实现实时检测分析单细胞内的生物化学机制。该仪器可广泛用于生物及医学中在亚细胞和分子水平的基础研究和疾病检测，对于肿瘤早期诊断、药物开发、食品科学与农业科学的发展意义重大。
能同时实现原子力显微成像与光/电分析的多功能纳米探针(图1)的制作方法，具体步骤为:1)采用激光加热的方法结合刻蚀的方法将直径为400微米的多模光纤拉制成2-10纳米探针；2)在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层作为纳米电极层；3)在纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成一层绝缘层，在共聚之前将纳米探针尖端约5-10纳米浸入乙醇溶液中；4)采用激光加热的方法将步骤3)处理后得到的样品弯曲成AFM探针；6)在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层。
可供上述多功能纳米探针实现AFM实时扫描和光/电分析的样品池(图2和图3)制作方法，具体步骤为:1)在玻璃盖玻片上溅射上环状钼电极；2)在玻璃盖玻片上溅射上银的参比电极；2)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备的样品池侧壁与玻璃盖玻片黏合。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求
及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
权利要求
1.多功能纳米探针，其特征在于:包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层；所述光纤层为由多模光纤拉制、弯曲成的纳米探针。
2.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:所述纳米探针尖端为通过激光加热的方法弯曲形成AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层。
3.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成尖端为2-10纳米的探针。
4.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层。
5.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层。
6.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:所述绝缘层为在尖端裸露的纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成的绝缘层。
7.根据权利要求
1所述的多功能纳米探针，其特征在于:还包括与所述多功能纳米探针相配合的样品池，所述样品池包括由聚二甲基硅氧烷制备的柱状透明容器壁和与透明容器壁配合的玻璃底；所述玻璃底上溅射上对电极和参比电极；所述对电极材料为金属钼，呈不封闭环状沿容器壁内侧排布，且一端延伸至透明容器壁外侧；所述参比电极材料为金属银，呈长方形一端位于容器壁内侧，一端延伸至透明容器壁外侧，且与对电极不能重合。
8.与权利要求
1-7任一项所述的多功能纳米探针相配合的单细胞/单分子成像光/电综合测试仪，其特征在于:包括数据采集与分析单元、光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统、光子探测单元、样品池、多功能纳米探针和原子力显微镜系统； 所述数据采集与分析单元，用于接收并分析电学检测单元和光子探测单元的数据信号; 所述光源单元，用于生成波长和强度均可调的激励光信号，并通过光纤层发射至待测样品； 所述电学检测单元，用于发射激励电信号，并接收检测反应后的电信号，所述电学检测单元的信号发射端通过纳米电极层与信号接收端连接； 所述细胞样品定位系统，用于移动及定位盛有待测样品的样品池； 所述光子探测单元，用于接收通过待测细胞光信号和检测细胞光信号的强度，所述细胞光信号通过滤波器和倒置显微镜发送； 所述多功能纳米探针，用于同时实现原子力显微成像与光/电分析； 所述样品池，用于承载待测细胞； 所述原子力显微镜系统，用于精确移动多功能纳米探针，实现样品表面纳米级别定位以及细胞内亚细胞以及分子水平定位，并用于获取样品纳米结构形貌信息； 所述光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统、光子探测单元分别与数据采集与分析单元电连接。
9.根据权利要求
8所述的单细胞/单分子成像光/电综合测试仪，其特征在于:所述多功能纳米探针，包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层；所述光纤层为由多模光纤拉制弯曲成的纳米探针；所述纳米探针尖端为通过激光加热的方法弯曲形成的AFM探针；在所述AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层作为激光反射层；所述纳米探针通过将直径为400微米的多模光纤拉制成尖端为2-10纳米的探针；所述纳米电极层为在纳米探针的侧壁溅射上1-3纳米厚的金涂层；所述激光反射层为在AFM探针的背面溅射上10-30纳米厚的金涂层；所述绝缘层为在尖端裸露的纳米电极层的外壁通过2-烯丙基苯酚和苯酚的共聚反应形成的绝缘层。
10.根据权利要求
8所述的单细胞/单分子成像光/电综合测试仪，其特征在于:所述样品池包括由聚二甲基硅氧烷制备的柱状透明容器壁和与透明容器壁配合的玻璃底；所述玻璃底上溅射上对电极和参比电极；所述对电极材料为金属钼，呈不封闭环状沿容器壁内侧排布，且一端延伸至透明容器壁外侧；所述参比电极材料为金属银，呈长方形一端位于容器壁内侧，一端延伸至 透明容器壁外侧，且与对电极不能重合。
专利摘要
本发明公开了一种基于多功能探针的单细胞/单分子成像光/电综合测试仪，包括有多功能纳米探针、样品池、原子力显微镜系统以及分别与数据采集与分析单元连接的光源单元、电学检测单元、细胞样品定位系统和光子探测单元。多功能纳米探针包括光纤层和依次包裹于光纤层外壁的纳米电极层、绝缘层。本发明提供的同步综合测试仪包括能对单细胞/单分子原子力扫描成像并同时进行光/电检测的纳米探针制作方法、样品池的制作方法及相关的光学、电学与力学的测试分析仪器。极大的提高了时空分辨率和可检测的靶标物范围，能广泛用于生物及医学中在亚细胞和分子水平的基础研究和疾病检测，对于肿瘤早期诊断、药物开发、食品科学与农业科学的发展意义重大。
文档编号G01Q60/38GKCN103197102SQ201310075154
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月8日
发明者李长明, 鲁志松, 郑昕婷 申请人:西南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan