专利名称：使用碳溶胶标记物的免疫测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用待测定成分和通过将一种含水碳溶胶的颗粒直接偶联或吸收到所说成分上而获得的碳标记成分之间的相互反应活性，而在一种试验样品中测定一种特异性结合蛋白与其相应的可结合底物之间的反应成分的方法，该方法包括在反应期间或反应完成之后，随意地在将结合的和游离的标记成分分离出之后，在所述试验样品中或在分离后获得的组分之一中，采用一种适合于定量或定性指示待测成分的方法来检测碳标记物的存在和/或测出该标记物的量。
本发明进一步涉及通过将碳溶胶的颗粒直接偶联或吸附到一种成分上而制备碳标记的特异性结合蛋白和其相应的可结合底物之间的反应成分的方法，以及涉及一种用于检测含水试验样品中存在的免疫成分的组合物。
如本文所使用的，短语“特异性结合蛋白和相应的可结合底物之间的反应成分”是指可存在于细胞表面上的物质，或其部分，例如受体蛋白和抗原决定基，以及可存在于各种介质，尤其是体液，例如血浆，血清等或者细胞培养介质中的免疫化学物质如半抗原，抗原和抗体。
因此本发明涉及组织学的多个领域，例如组织和细胞染色，在该染色过程中不仅发生免疫化学反应，而且在胶体碳标记和其他(大)分子结构例如酶，链霉抗生物素蛋白，DNA和/或RNA等之间还发生偶合或吸附。除这些领域外，本发明还涉及免疫检测领域，例如用于诊断目的(在含水试验样品中测出抗体，抗原或半抗原)。
在下述的说明书部分中，将列举本发明在上面最后介绍的领域，例如诊断性免疫检测法中的应用以更详细地描述本发明，但是不应将本发明限于这些应用，因为其同样可适用于组织学和组织化学检测法。
在EP-A-0321008中已描述了如上述限定的方法(Van Doorn et al.)。如本文中所公开的，可以将不含有任何金属元素的由非金属元素和无机化合物组成的含水溶胶用作标志，并且本文所述的非金属元素之一应为碳。
美国专利No.4,760,030(Peterson et al)公开了一种检测样品中存在的特异性结合对成员(sbp成员)的方法。该方法包括一种利用在sbp成员存在下能凝集的不透明颗粒进行的凝集测定法。该不透明颗粒得自于具有0.2-5.0μm颗粒大小的碳颗粒。将碳颗粒结合到该sbp成员的特异性结合对象上，以使它们能在sbp成员存在下发生凝集。例如，如果待测定的sbp成员(即“被分析物”)是类风湿因子(即一种与IgG的Fc部分结合的自身抗体的不均一群体)，则制得一种含有碳粒和IgG的悬浮液。将试验后的检测介质的光密度(在波长为350至800nm处测定)与凝集试验前的检测介质的光密度进行比较，读出检验结果。光密度的改变表明该样本中存在所述的被分析物。为了避免碳粒自身凝集，在用sbp成员的特异性结合对象包被碳粒之前，将其悬浮于一种氨基酸，例如甘氨酸的水溶液中，并且该检测法是在一种含有其量足以降低不透明颗粒的自身凝集之氨基酸的检测介质中进行的。
另外，美国专利No.5,252,496(Kang et al.)告诉我们最好用稳定剂如聚亚烷基二醇或多糖类如葡聚糖预处理颗粒碳黑以把这些碳黑在水介质中的分散度增至最大程度。在用稳定剂预处理后，借助于一种半共价连接试剂例如荧光素-异硫氰酸盐将sbp成员连接到碳粒/稳定剂复合物上。接着必须用至少一种离子型或非离子型表面活性剂处理所得到的免疫化学标记物，以使该标记物能在水介质如水或低离子强度的缓冲液中悬浮。
Bergquist和Waller(J.Immunol.Meth.61，339-344(1983))公开了一种利用包含于印度墨水(Indiaink)中的碳粒测定样品中IgG抗体存在(如果有的话)的碳免疫测定法(CIA)。印度墨水具有特异的结合特性。例如它可以结合到兔IgG上，因此可用于检测方法中以检测出针对微粒抗原的兔IgG抗体。它也可以结合到葡萄球菌的膜上。所述膜含有已知其可与人IgG抗体结合的蛋白质A。这些特性使之适用于快速检测抗寄生虫鼠弓形体(Toxoplasmagondii)的人IgG抗体。该检验法包括将活性印度墨水与蛋白质A混合用以制备一种标记的试剂，然后将该试剂与鼠弓形体速殖子(起微粒抗原作用)与可疑含有抗鼠弓形体之人IgG抗体的样品相混合。在光学显微镜下读出该检验结果。阳性CIA反应的情况下，由于粘附到碳粒上而使鼠弓形体速殖子显示黑色，否则为白色。该CIA检验法很不灵敏，仅仅是由于其操作简单因而引起人们的兴趣。
令人满意的情况是，所使用的微粒碳标记物具有这样的特性例如成本价格低，容易(大量)制备，其光吸收值在宽波长范围内，在例如固相-，量杆(dipstick)-或凝集反应(抑制)溶胶颗粒(免疫)检测法中具有与其光学着色本底形成鲜明对照的光学特性，以及具有在胶体碳粒表面吸附宽范围完全相异的结合蛋白和/或可结合物质的能力。为了研制在敏感性、特异性和再现性方面具有可控制的检验性能的检测系统，全面了解胶体碳标记颗粒的表面特性是十分重要的。
尽管文献中已暗示可利用碳颗粒作为免疫检测法的标记物(Peterson et al.，Kang et al，Bergquist and Waller)，但这些例子中没有一个与这些碳颗粒具有的特性相适合，既没有了解碳颗粒性能，也没有了解碳颗粒大小。Peterson等人、Kang等人，以及Bergquist和Waller都证明在设想将结合蛋白与碳颗粒在含水介质中偶联之前，必须先用一种氨基酸如甘氨酸(Peterson et al)，一种聚亚烷基二醇或一种类似葡聚糖的多糖(Kanget al.)，或者在使用印度墨水碳颗粒的情况，使用其他稳定剂如阿拉伯胶和树脂(Bergquistand Waller)对这些碳颗粒进行稳定化处理。在不加入这些稳定剂的情况下，Peterson等人，Kang等人和Bergquist与Waller所述的碳颗粒便不能在例如纯水或低离子强度缓冲溶液等含水介质中形成一种稳定的，不发生自身凝集的胶体悬液。因此现有技术中介绍的这些稳定化的含水碳溶胶，要求在加入特异性结合蛋白或相应的可结合底物之前，向含水介质内的碳颗粒中加入稳定剂或其中存在稳定剂。
使用这种稳定化的含水碳溶胶作为免疫检测的标记系统具有几方面弊端-由于这些颗粒具有自发凝集的倾向，因而处理这些溶胶十分困难。
-没有证据证明结合蛋白与碳颗粒的表面实际上已发生了偶联。Peterson等人和Bergquist与Waller仅在凝集反应装置中使用了这些稳定化的含水碳溶胶。在怀疑有200-500nm大小的胶体颗粒存在时，抗体-抗原沉淀物的形成迫使这样的(大)颗粒发生共沉淀。
-由于首先用氨基酸，聚亚烷基二醇，类似葡聚糖的多糖，或树脂包裹碳颗粒的表面以便使胶体悬浮液在含水介质中保持稳定，所以很可能在随后的偶联步骤中将阻碍结合蛋白通过疏水作用直接偶联到碳颗粒的真正表面上。事实上，Kang等人需要一个耗时的偶联步骤，其中借助于一种额外的连接剂将该结合蛋白连接到碳标记物上。这样的偶联程序过于冗长并且将导致该检验方法的灵敏性和精确性发生变化，得到不能重复再现的结果。
-稳定化的含水碳溶胶是由稳定化成分和水中碳颗粒形成的复杂混合物，且每批形成的产物与另一批都有很大变异。由于这种变异，使得对溶胶的处理过程不易顺利完成，并且至少从经济角度上考虑是不十分令人满意的。
-用离子型或非离子型表面活性剂处理免疫化学碳标记物(Kang等人)可以导致(免疫)反应性降低(结合蛋白变性，或者例如sbp成员和其相应的可结合底物之间相互作用力降低)，或者导致固相化的可结合底物从碳颗粒上解吸附(Gershoni andPalade，Anal.Biochem.131，1(1983)；Spinola and Cannon，J.Immunol.Meth.81，161(1985)；Wedege and Svenneby，J.Immunol.Meth.88，233(1986)；Wedege et al，J.Immunol.Meth.113，51(1988)；Bird et al，J.Immunol.Meth.106，175(1988)；Stott，J.Immunol，Meth，119，153(1989)；Tyllianakis et al，J.Immunol.Meth.162，273(1993)]。
本发明的一个目的是提供一种含水碳溶胶，该溶胶实质上是未稳定化的，并且可在测定试验样品中特异性结合蛋白和相应的可结合底物之间反应成分的方法中用作标记物。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测试验样品中特异性结合蛋白和相应的可结合底物之间反应成分的方法，其中以实质上未稳定化的含水碳溶胶作为标记物。
本发明的再一个目的是提供一种特异性结合蛋白和相应的可结合底物之间的碳标记的反应成分(制备该成分的方法)，其中使用实质上未稳定化的含水碳溶胶标记所述成分。
就其在水介质中的分散能力而言，我们研究了各种类型的碳的特征和性能是否具有预期的值，涉及由我们制备的实质上未稳定化的含水碳溶胶得到的实验数据，我们估价了如由碳黑制造商给出的其特征和性能数据例如喷流(jetness)指数，表面积-N2，基本颗粒直径，酞酸二丁酯值，着色强度，易挥发成分含量，密度等。
令人吃惊的是，我们发现一种颗粒状碳黑作为实质上未稳定化的碳溶胶在含水介质中的分散度可以成分与参数酞酸二丁酯(dibutylphthalate，DBP)值，易挥发成分含量(VC)以及基本颗粒直径(PPD)具函数关系的模型。
估测到的线性预测值(V)的模型通式为V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD。
颗粒状碳黑具有阳性预测值(V＞0)表明该碳黑适于制备实质上未稳定化的含水碳溶胶。颗粒状碳黑的线性预测值V≤0表示该碳黑不适合于制备实质上未稳定化的含水碳溶胶。后一种碳黑需要加入稳定剂或有稳定剂存在时，才能形成稳定的含水碳溶胶(Peterson et al，Bergquist andWaller，Kang et al)。
所以我们已惊奇地发现，可以以一种可靠的方式预测某种特定的碳等级或类型是否适合于用作为制备实质上未稳定化的含水碳溶胶的起始材料。基于确定所研究的碳类型之特征的三个不同参数，可以进行所述的预测。
因此，根据本发明已经发现可以实现上述发明目的，更具体地说，可以制备实质上未稳定化的胶体碳颗粒，该碳颗粒可用作为标记物并且比上述其他标记物更为优越。
因此本发明提供了一种测定样品中存在被分析物或其存在量的方法，该方法包括将所述样品与一种碳标记的成分相接触，该成分由一种含水碳溶胶组成，该含水碳溶胶具有直接结合到胶体碳颗粒表面上的结合成分，该结合成分能特异地识别所述被分析物，检测存在或不存在得到的被分析物/碳颗粒复合物，作为所述样品中有被分析物存在的指征或作为确定被分析物的量的度量标准，所述方法特征在于碳黑具有线性预测值V＞0，其中，V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是根据DIN53601测定的以ml/100g数表示的酞酸二丁酯吸附值。
VC是易挥发成分的％含量，按照DIN53552测得的值；以及PPD是以毫微米数表示的平均基本颗粒直径；用该碳黑制备实质上未稳定化的含水碳溶胶；该溶胶用于制备所述碳标记成分。
本发明进一步提供了一种用于测定样品中被分析物的组合物，所述组合物含有一种含水碳溶胶，它具有直接结合到胶体碳颗粒之表面上的结合成分，该成分能特异地识别所述被分析物，其特征在于所述含水碳溶胶是一种实质上未稳定化的含水碳溶胶，来源于具有线性预测值V＞0的碳黑，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按DIN53601测得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯吸附值；
VC是按照DIN53552测定的易挥发成分的％含量；PPD是以毫微米数表示的基本颗粒直径的平均值。
本发明还提供了一种制备用于检测样品中被分析物之组合物的方法，包括制备一种含水碳溶胶，将一种结合成分直接结合到胶体碳颗粒表面上，所述的结合成分能特异地识别所述的被分析物，其特征在于所述含水碳溶胶是一种实质上未稳定化的含水碳溶胶，其来源于具有线性预测值V＞0的碳黑，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按DIN53601测得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯吸附值；VC是按照DIN53552测定的易挥发成分的％含量；PPD是以毫微米数表示的基本颗粒直径的平均值。
在本发明的一个实施方案中，被分析物选自于存在于细胞表面上的受体蛋白和抗原决定基组成的组中。在本发明的另一个实施方案中，被分析物选自于由半抗原，抗原，酶，抗体和抗体片段，DNA和RNA组成的组中。结合到胶体碳颗粒上的结合成分较好选自于由半抗原，抗原，酶，抗体和抗体片段，受体蛋白，抗原决定基，DNA和RNA组成的组中。优选的是基本胶体碳颗粒的平均颗粒大小为1-100nm，且实质上未稳定化的含水碳溶胶不含有稳定溶胶的试剂。该方法的优选实施方式是固相免疫测定法和免疫层析法(例如量杆免疫测定法)。
根据本发明，用于制备碳标记成分的含水碳溶胶是一种实质上未稳定化的碳黑水溶胶，碳黑的线性预测值V＞0，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是根据DIN53601测定的，以ml/100mg数表示的酞酸二丁酯吸附值；VC是按照DIN53552测定的易挥发性成分的％含量，PPD是以毫微米数表示的基本颗粒直径平均值。
术语“实质上未稳定化的碳水溶胶”或“实质上未稳定化的胶体碳颗粒”是指一种水介质如纯水或含有低离子强度的缓冲系统中的碳溶胶，其中所述碳溶胶不需要添加任何稳定剂进行稳定，并且更好是不含有任何稳定剂。术语“实质上未稳定化的”是指包括所有含有一种具有稳定溶胶作用的物质但在没有所述物质时也稳定的含水碳溶胶。但是最优选的是所述实质上未稳定化的碳水溶胶不含有稳定溶胶的试剂。
根据由实验确定的用作为制备实质上未稳定化的碳水溶胶的起始材料的特定碳黑的用途，估算颗粒状碳黑的特征和性能(例如喷流指数，表面积-N2，基本颗粒直径，酞酸二丁酯值，着色强度，易挥发成分含量，密度等)。由于测出的可分散性有双重可变性--粒状碳黑是可分散的也可以不可分散的，如实质上未稳定化的含水碳溶胶--从而推测该模型的随机部分遵循二次式分布。根据分对数连接函数(logit linkfunction)，该模型的定数部分，即可变DBP，VC和PPD的线性组合与从属可变项，即作为实质上未稳定化碳水溶胶时颗粒碳黑在水介质中的分散度有关(Mc Cullagh and Nelden，Generalized Linear Models，2nd Edition，1989，Chapter4，Chapman and Hall，ISBN0-412-31760-5)。使用一种广义化的线性模型(Generalized Linear Model)，将分散度与作为前面介绍的各种颗粒碳黑之特征和性能的所有可能组合之函数求出的模型。采用统计学的计算机软件包Genstat(Payne and Lane(eds.)，1987，Genstat 5 Reference Manual，Clarendon Press，Oxford)对该模型的数据进行拟合。
令人惊奇的是，发现这些拟合模型的三个变量，即DBP值，易挥发成分含量(VC)和基本颗粒直径(PPD)的线性组合与作为实质上未稳定化的含水碳溶胶的颗粒碳黑的分散度有关。
所述三个参数的第一个，DBP值是根据DIN53601测得的酞酸二丁酯(dibutylphthalate)吸附值(DBP，ml/100g)，它是次级颗粒结构的量度。
第二个参数，易挥发成分含量VC(％表示)是根据DIN53552将碳样品于950℃温度下维持7分钟而确定的。较大的易挥发成分含量表示有较多的极性基团的表面氧化作用。
第三个参数是基本碳颗粒直径平均值PPD(毫微米表示)，该值是根据电子显微镜下测得的数目和大小而计算出来的。
估测的线性预测值(V)的模型通式是
V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD。
由分对数的连接函数的倒数限定的不同颗粒状碳黑在碳(其可作为实质上未稳定化碳溶胶分散于水介质中(分散度＝1))以及在颗粒状碳黑(其不能作为实质上未稳定化的碳溶胶分散于水介质中(分散度＝0))中的分布Disp.(％)＝100×[ev/(1＋ev)]。
特定颗粒状碳黑的正线性预测值(V＞0)以及Disp.＞50％表明该碳黑适合于制备实质上未稳定化的含水碳溶胶。当特定颗粒碳黑的线性预测值V≤0并且其Disp.≤50％时，表明该碳黑不适合于制备实质上未稳定化的含水碳溶胶。后一种碳黑需要加入或存在稳定剂才能形成稳定化的含水碳溶胶(Peterson et al.Bergquist andWaller，Kang et al)。
Kang等人使用例如V-值在-28.90和-171.40之间变化的并且其Disp.＜＜50的Cabot颗粒碳黑，结果表明该碳黑不适用于制备实质上未稳定化的含水碳溶胶。
表1和
图1都显示了各种颗粒状碳黑在分散度＝1的碳(Disp.1碳；能作为实质上未稳定化的碳溶胶分散于水介质中)和在分散度＝0的碳(Disp.0碳，不能作为实质上未稳定化的碳溶胶分散于水介质中)中的分布，其数值是根据实验数据和预测值(V和分散度)得到的。
表1
<p>表中结果表明所研究的颗粒状碳黑中，Degussa颗粒碳黑Farbruss FW200，Farbruss FW2，Spezial -schwarz SS6，Spezial -schwarz SS5，Spezial -schwarz SS4，Printex 150T，Spezial -schwarz SS250和Spezial -schwarz SS100在水介质中分散为实质上未稳定化的碳溶胶。
在测定试验样品中一种特异性结合蛋白和相应的可结合底物之间的一种或多种反应成分的方法中，利用实质上未稳定化的胶体碳颗粒作为标记物比其他标记物具有几方面优点，例如成本耗费低，易于(大量)制备，在宽的波长范围内有光吸收值，在例如固相-，量杆-或凝集反应(抑制)溶胶颗粒(免疫)测定法中具有与光着色本底相反的光学特征，以及将各种各样完全不同的结合蛋白和/或可结合底物吸收到胶体碳颗粒表面的能力。
本发明所使用的实质上未稳定化的碳溶胶颗粒比稳定化的胶体碳粒，并且也比其他胶体粒标记物具有许多优越性。令人惊奇的是，我们发现不利用任何稳定剂或其他成分，即未稳定化的含水碳溶胶，在水介质中制备稳定化的胶体碳悬浮液是十分容易的。合适的碳的例子有几种类型的颗粒状槽法碳黑(channelblack)/炉碳黑碳(furnaceblack)。
在测定试验样品中特异性结合蛋白和相应可结合底物之间的一种或多种反应成分的方法中，用作为一种标记物时，这种未稳定化的含水碳溶胶与由Peterson等人，Kang等人和Bergquist与Waller描述的稳定化的含水碳溶胶相比，其具有几个优点。
这些优点包括-上文介绍的碳能在例如纯水或本身有低离子强度的缓冲液等水介质中不需要加入稳定剂复合混合物(例如氨基酸，聚亚烷基二醇，葡聚糖，如多糖，树脂或洗涤剂)以及防腐剂便可以形成稳定的胶体悬浮液。
-上文介绍的碳是按预定的严格限定的大小级别提供的，它覆盖了整个胶体颗粒范围，在用EDTA和HCl纯化后，不需要按照Peterson等人描述的方法在研钵中将碳初步研磨。在制备碳标记的初始阶段，Kang等人也提到了将粗制的碳材料与稳定剂的混合物一起研磨。
-上文介绍的碳起始材料可以大批量地获得。并且能够减少一批与另一批之间的变异(如用印度墨水，参见Bergquist and Waller)。因此，已经发现就颗粒碳黑的特征和性能而言，碳溶胶的重复再现性并不是要紧的问题。
-未稳定化含水碳溶胶价格低，并容易大批量地制备，十分稳定，并因而具有长的货架期。
-由于在将大分子(例如蛋白质，抗原，DNA/RNA偶联到胶体碳颗粒上之前或期间在未稳定化的含水碳溶胶中没有任何稳定剂，在胶体碳颗粒表面、大分子和所有可能的活性(例如疏水性)结合位点之间存在真正的直接相互作用。
而且，通过例如物理吸附将大分子偶联到胶体碳颗粒上的条件是已知的，并且可受到严格的限定和控制(对大多部印度墨水的组分尚没作限定(Bergquist and Waller)，并且甘氨酸或葡聚糖、碳颗粒和结合蛋白之间的相互作用也还留有或多或少的不甚明确处(Peterson et al，Kang et al))。
总之，将大分子结合到未稳定化的碳溶胶上是十分容易的。得到的碳/大分子结合物产生的结果就其敏感性、特异性和精确性来说，不仅可靠，而且重复性好。
上文介绍的碳是按预定的严格限定的大小级别提供的。优选的是基本碳颗粒具有平均值为1至大约100nm范围的粒径。由于生产和制造过程包括将用作为起始材料的碳氢化合物加热、蒸发、燃烧以及粉碎，因而可能在冷却期间某些基本颗粒一起融合成较大的，较高级结构的颗粒，称作为“二级颗粒”。特定的颗粒状碳黑的基本和二级颗粒的表面特性是相同的，因而就它们在水介质如水或低离子强度缓冲液中的胶体化学稳定性来说它们的行为是相似的。优选的是平均颗粒大小不超过400nm的二级颗粒。更优选的是胶体碳颗粒的平均颗粒大小在1到200nm范围内。
未稳定化含水碳溶胶具有的颗粒大小使之非常适合用作为例如免疫层析测定法中的标记物。这样的免疫层析测定法的一个优选的实例是量杆(dipstick)测定法，在该方法中固相载体(纸条)是由多孔或纤维材料例如天然或合成多聚物和硝酸纤维素或尼龙等衍生物构成的，该材料的孔径大小在0.20μm和15μm之间，并且纸条厚度约为100μm。通过吸附、吸收或共价结合将抗体或抗原固定在该纸条上。将含有与固定的结合对成员具特异反应性之被分析物的样品材料加到载体材料上，并且使之通过纸条层析移动，其中被分析物通过与其相应的结合对成员发生反应而被固定。然后采用例如洗涤步骤而除去未发生反应的样品材料，对于夹层型检测法，在上述步骤之后，则将碳标记的试剂加到载体材料上。
由于碳颗粒大小相对较小，因而所述碳标记试剂易于通过层析迁移，并且能够与固定的被分析物发生反应和固相化。
将液体形式的碳标记的试剂加到载体材料上，但也可以换另一种方法，即在例如一种次可溶性蛋白质和/或多糖存在下将其喷洒到层析介质上并干燥之。在这种情况下，在合适的溶剂例如样品或层析传输溶剂存在下，碳标记的试剂可以快速地重新溶解。
碳溶胶的制备和使用实质上未稳定化的含水碳溶胶的制备是非常容易的并且价格低廉的。在根据线性预测值V＞0选择了一种合适的颗粒性碳黑，并且向一定量的选出的干炭粉中加入纯水或低离子强度的缓冲液之后，可以采用几种方法例如借助于超声波发生器得到稳定的碳黑溶胶。实质上未稳定化的(但都是稳定的！)的碳溶胶可强烈地稀释于水或低离子强度的缓冲液中。在加入过量的NaCl之后，经稀释的溶胶形成絮状，在几分钟内形成一种黑色絮状沉淀，并出现透明的无色上清液。将这种形成絮状沉淀的现象用作为监测大分子物理吸附到碳颗粒上的一种手段，但仅限于未稳定化的含水碳溶胶的情况。
在适当条件下，例如向稀释的未稳定化含水碳溶胶中加入一种大分子在低离子强度缓冲液中形成的悬浮液后，经轻轻混合后，将会导致大分子借助于它们之间的疏水作用偶联剂胶体碳颗粒的表面上。由于该大分子的包被，胶体碳颗粒将受到保护，免于由于加入过量NaCl到碳/大分子-结合物悬浮液中而产生絮状沉淀。
设立一个系统的实验，其中将特定大分子的量增加后，与固定量的未稳定化的含水碳溶胶一起在严格限定和控制的条件下进行保温，当达到特定的大分子/胶体碳颗粒比例时，加入过量的NaCl将不再导致溶胶出现絮状沉淀。所述大分子的量，所谓的“最小保护量”(MPA)在大分子偶联到未稳定化含水碳溶胶的步骤中是一个重要的参数，并且在其他参数中，MPA的值取决于所偶合的大分子的性质、胶体颗粒的特性和量、偶联条件如pH值及离子强度。
因此，通过实施一个絮状沉淀试验和测定MPA值，可以弄清大分子是否可偶联到未稳定化的含水碳溶胶上，但也可以经离心而将碳/大分子结合物沉淀后检测上清液的光吸收值而(双重地)检查这种偶联作用。在向未稳定化的含水碳溶胶中加入最小保护量的大分子，并在适当条件下进行短时间保温后，将碳-大分子结合物反复离心；并且紧接着将逐次得到的沉淀物重新悬浮于没有任何(其他)大分子的水介质中，向该悬浮的沉淀中加入NaCl后仍不产生絮状沉淀。该结果表明已经形成了不可逆的大分子-碳键。
大分子(例如-种抗体)在胶体碳颗粒表面上的这种强烈的吸附作用使未稳定化的含水碳溶胶不仅适合于在凝集反应(抑制)免疫检测法中作为一种标记物，也使之适合于在所有种类的固相免疫检测法例如膜层析免疫检测法中用作产生信号的标志。考虑到其可在此类层析免疫测定中用作标志物，故本发明所述的不同品种的未稳定化的含水碳溶胶中经过相对充分限制的颗粒大小分布还比Peterson等人，Bergquist和Waller以及Kang等人所述的含水碳溶胶有更多优点。
在制备实质上未稳定化的含水碳溶胶中，匀浆化步骤较好的是用超声处理，但也可以通过将碳粒和没有稳定剂的水介质的混合物一起振荡或煮沸(有或没有搅拌)来实现。
将碳加在纯水或在低离子强度的缓冲液中进行超声处理，接着在将该胶体碳悬液与一种大分子在低离子强度缓冲液中的悬浮液于轻轻混合条件下混合的过程，相对于研制用于各种各样免疫检测法的碳溶胶颗粒标记物而言是一种简便，价廉和快速的途径。
在经超声处理(短时间)匀浆化的步骤期间，向碳粉和水的混合物加入大分子(如蛋白质)在低离子强度缓冲液中制成的悬浮液(最终的大分子量在MPA-水平)可导致携带所述大分子的胶体碳颗粒标记物的形成，然后将其用于免疫检测中。
用碳溶胶颗粒标记的免疫成分可用作试剂，通常与其他试剂合用，以证明和定量检验含水介质例如血浆，血清等体液或细胞培养基中存在的例如半抗原、抗原、抗体和DNA/RNA，因而它适用于各种免疫化学技术，如可适用于放射免疫检测法和酶免疫检测法中。
因此，本发明还涉及适用这样的免疫化学技术的，并且含有作为最重要成分的一种免疫成分的试剂盒。
常规免疫化学技术之一是竞争性免疫检测法，该方法可用证实和检测一种免疫成分。例如为了验证一种特定抗原的存在，该方法包括将含有未知量之抗原的试验样品与经过预先测定其量的用碳标记的所需测定的该抗原和抗该抗原的一种不溶性抗体相接触，或者与预先测定其量的不溶性抗原和针对所述抗原并用碳标记的抗体相接触。
在反应完成之后，测定结果或游离组分中的碳的量，可以定性或定量地指示待检测的抗原。Mutatismutandis，一种类似方法适用于检测其他免疫成分。
通常使用的其他方法是所谓的“夹心”分析技术，该技术也特别适合于使用由本发明所述碳标记的一种成分。按照这些技术，在必须检测抗原的情况下，通过将一种免疫成分例如一种抗体偶联到固体载体上，而使其不被溶解。
该固体载体是例如反应容器的内表面，在该容器中进行免疫化学反应。基于硝酸纤维素或基于在尼龙膜的量杆或聚苯乙烯棒也可用作为固相载体。在第一次保温之后，可能紧接着有一个洗涤步骤，第二次保温是用碳标记抗体进行的，之后在结合或游离相中测定所述的碳。
用碳标记的免疫成分也使其本身能够用于所谓的均质免疫检测法中，即不必要将在免疫化学反应中结合的标记的免疫成分与仍然游离的相应成分进行分离的免疫检测法。这种检测法具有易于操作、非常快速地提供所需信息，并且自动地将其自身提供出来的优点。
在实际检测中，例如在微量滴定板的孔中将含有待测抗原的试验样品(或标准溶液)与标记的抗原一起保温。抗原和(标记的)抗体之间的免疫化学反应将导致凝集。于是诱导发生的颗粒在碳溶胶中的凝集伴随有光吸收值的变化，这种变化即可借助例如分光光度计或用裸眼进行监测。
为了确定小抗原，其在免疫化学方面是单价的，则使用基于相同原理的凝集-抑制反应。
除了上面提到的技术，尚有无数的以碳标记的免疫成分作为试剂的其他免疫化学技术。但是，更优选的是，本发明方法是一种固相免疫检测法，更具体地说是一种免疫层析检测法，例如一种量杆(dipstick)免疫检测法。
被分析物可以是存在于液体试验样品的溶液中的可溶性物质。优选的是，被分析物选自于由受体蛋白和细胞表面上的抗原决定基组成的组中，或者特别是对于含有溶液中的可溶性分析物的液体样品，则选自于由半抗原，抗原和抗体组成的组中。
优选的是，结合到胶体碳颗粒上的结合成分选自于由半抗原，抗原，抗体，DNA和RNA组成的组中。
可按照许多已知技术检测在反应混合物的某些相中碳的性质和/或浓度。
图1显示在水介质中线性预测值(V)与Degussa/Cabot颗粒状碳黑分散度之间的关系。将实验数据(Disp.1或Disp.0)对计算出的V值作图。
性线预测值(V)是由下列公式确定的V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；其中DBP是酞酸二丁酯吸附值，VC是挥发成分含量，且PPD是以毫微米数表示的基本颗粒直径。
实施例除非另有说明，下文中描述的所有步骤都是在室温下完成的。
碳溶胶的制备方法A超声处理母液将1克碳(Degussa，Printex 150T)悬浮于蒸馏水中达到终体积为100ml(1％(w/v)。借助于一个Branson250型超声波发生器输出控制3～27Watt，20KHz将该悬浮液，匀浆处理15分钟(该悬液的超声处理也可以在冰上进行)。
形成由平均基本粒径为29nm的球状碳粒组成的深黑的胶体碳悬液，将该贮备C-悬液保存于4℃下。
方法B超声处理将方法A的步骤应用于Degussa颗粒状碳黑Farbruss FW200.FarbrussFW2，Spezialschwarz6，Spezialschwarz 5，Spezialschwarz4，Spezialschwarz 250以及Spezialschwarz 100。
形成该悬液是由平均基本粒径分别为13，13，17，20，25，56和50nm之球状碳粒组成的深黑胶体碳悬液，将该贮备C-悬液保存于4℃下。
方法C涡动和差速离心。
向0.05g碳(Degussa，Printex 150T)中加入蒸馏水至终体积为5ml(1％w/v)。在一个涡动混合器中以2500rpm转速旋转10分钟以使该悬液匀浆化。经以13,800×g离心10分钟将该悬液洗三次，并将每次的沉淀物重新悬浮于5ml蒸馏水中。最后，以1,000×g将该悬液离心10分钟，以除去聚集的胶体碳粒。小心地滗去清液，保存在4℃下。
考虑到在悬液的操作过程中出现材料丢失的情况，将碳浓度校准至分光光度法测得在500nm波长处的吸收值为1。
方法D煮沸和差速离心将蒸馏水加到0.25g碳(Degussa，Printex 150T)中至终体积为25ml(1％w/v)。在用磁性搅拌器搅拌的同时，将该悬液置于密封玻璃容器中于加热平板上缓慢地煮沸15分钟。冷却至室温后，按照方法C对该悬液进行差速离心。
碳溶胶的使用实施例1将经线性梯度系列稀释的羊抗-人纤维蛋白原抗体点样于硝酸纤维素滤膜条上，以检测人的纤维蛋白原。制备碳颗粒-纤维蛋白原结合物在使用之前(例如蛋白质的物理吸附)，用2.5mM Tris-HCl，pH8.5将贮存的碳(C)悬浮液(按照方法A制得)稀释5倍。
将15mg牛纤维蛋白原，i-s型(Sigma)溶于5ml的2.5mM Tris-HCl，pH8.5中--A溶液；将15mg人纤维蛋白原，组分I(Sigma)也溶于5ml的2.5mM Tris-HCl，pH8.5中--溶液B。
向5ml A溶液和5ml B溶液中各加入5ml溶于2.5mM Tris-HCl，pH8.5中的0.2％(w/v)C-溶胶。在搅拌条件下将悬浮液保温3-4小时。随后，用5mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5，以13,636×g离心15分钟将所形成的结合物洗3次。将每个洗涤步骤中形成的最初上清液再次以13,666×g离心15分钟，之后将形成的沉淀合并在一起。额外的这一离心步骤用于最大程度地减少材料损失。在第三次和最后一次的洗涤步骤之后，将沉淀物重新悬浮于初始体积的一半的溶液中(该碳浓度还是为0.2％(w/v))。将洗涤后的结合物保存于4℃黑暗环境下。
制备其上点有经线性系列稀释的羊抗人纤维蛋白原抗体的硝酸纤维素条将下列线性系列稀释度的多克隆羊抗人纤维蛋白原抗体点样于硝酸纤维素膜(Schleicher and Schuell，具有0.45μm孔径的BA85/23型)上10000ng；500ng；250ng；125ng；62ng；31ng；15ng；8ng；4ng；2ng。
用10mM PBS，pH7.2制备系列稀释液。每个点使用1μl溶液；点直径＜2mm。
点样后，将该膜在空气中干燥3小时。在10mMPBS，2％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH7.2中，将膜于37℃浸泡1.5小时，以封闭硝酸纤维素膜上的空白位置。将该膜再次风干，之后将其固定到粘附性塑料载体材料(Costar Serocluster Platesealers)上，最后剪切成5×5mm大小的条。将条在黑暗和室温下干燥。
试验步骤在可加盖(stoppable)的4.5ml聚苯乙烯管(Greiner)中，将“羊抗人纤维蛋白原条”与下列物质一起保温AB1mlC-人纤维蛋白原 1mlC-牛纤维蛋白原结合物结合物500μl 2.5mM Tris-HCl pH8.5 500μl 2.5mM Tris-HCl pH8.5500μl 20mM Tris-HCl 500μl 20mM Tris-HCl600mM NaCl 600mM NaCl1％(w/v)酪蛋白 1％(w/v)酪蛋白0.2％(w/v)吐温-20 0.2％(w/v)吐温-200.02％(w/v)NaN30.02％(w/v)NaN3pH8.5 pH8.5在试验A中，将纸条保温5分钟后显示出5个清晰带色的强度减弱的点(100(-62ng)。
在保温1.5小时后，这些点达到其最大颜色强度。
在试验B中，纸条未显示任何颜色。
实施例2-借助单克隆大鼠抗小鼠κ/λ(RAMκ/λ)结合物检测单克隆小鼠免疫球蛋白之同种型的同种型试验检测物理吸附于胶体碳粒上之单克隆大鼠抗小鼠κ/λ(RAMκ/λ)抗体的“最小保护量”(MPA)最小保护量(MPA)是保护1升特定胶体悬液免于在14.3gNaCl/l(终浓度)发生电解诱导的结絮所必需之大分子的最小量。MPA值不仅取决于发生偶联的条件，而且依赖于所偶联的分子的大小以及在1升特定胶体悬液中存在的所有颗粒的总有效表面。
试验按下列步骤进行检查碳溶胶(0.01％(w/v)Degussa Printex 150T溶于2.5mMTris-HCl，pH10.5中)的pH值，如果必要，调pH至10.5。将制备在2.5mMTris-HCl pH10.5中含有0.94mg/ml的RAMκ/λ-蛋白质的母液，并且利用相同缓冲液进行稀释，以便达到在2.5mM Tris-HCl，pH10.5中0-0.94mg/ml RAMκ/λ的线性浓度范围。向100μl的各种RAMκ/λ-蛋白质溶液中加入500μl碳溶胶(在2.5mMTris-HCl，pH10.5中含0.01％(w/v)Degussa Printex 150T)，然后用涡动混合器彻底混合之。保温10分钟后，向各碳溶胶/蛋白质悬液中加入100μl的10％(w/v)NaCl溶液，然后再次彻底混合。在加入10％(w/v)NaCl溶液后恰好5分钟时，肉眼观察各溶胶/蛋白质悬液，筛选显示有黑色块的悬液，这些碳块趋向于快速地发生絮凝作用而形成黑色沉淀和透明的无色上清液。
该试验的对照组是1、用500μl碳溶胶+2×100μl 2.5mM Tris-HCl，pH10.5制成的模拟碳溶胶，该碳溶胶已受到RAMκ/λ-蛋白质的完全保护；2、500μl碳溶胶+100μl 2.5mMTris-HCl，pH10.5+100μl10％(w/v)NaCl溶液，以确定发生完全絮凝对反应混合物的外观产生的肉眼可见的影响。
这种絮凝试验的结果显示要保护500μl溶于2.5mM Tris-HCl，pH10.5中的0.01％(w/v)Degussa Printex150T碳溶胶免于由于加入14.3g/l NaCl而发生的絮凝作用，至少需要37.5μg的RAMκ/λ-蛋白质。
所以，在所述的偶联条件下，RAMκ/λ-蛋白质的MPA值为75mg方可足以保护1升(1000ml)溶于2.5mM Tris-HCl，pH10.5中含0.01％(w/v)Degussa Printex 150T碳溶胶免于发生电解诱导的絮凝作用。
制备碳颗粒-RAM结合物用蒸馏水将贮备碳(C)溶液(按方法A制得)稀释100倍，其后用1M K2CO3溶液调pH至10.4。
从溶于20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH8.0的4.5mg/ml RAM(Euroclone)贮备液开始，向10ml溶胶(～75μg RAM/ml碳溶胶)中加入167μlRAM蛋白质悬液。将该悬液搅拌保温60分钟。随后，经用2.5mM Tris-HCl，5mMNaCl，1％(w/v)BSA，0.05％(w/v)NaN3，pH8.5，以13,800×g离心15分钟，将所形成的结合洗三次。将洗涤后的结合物保存于4℃黑暗条件下。
试验步聚在可加盖的聚苯乙烯管(Greiner)中将4.5ml HBT亚同种型检测的试条(HBT，no.L10.10/L10.20)与下列溶液一起保温A.500μl20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)酪蛋白，0.2％(w/v)Tween-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl加有溶于RPMI(Gibco)中的10μg/ml IgG1和10μg/ml IgG3，10％(v/v)胎牛血清1ml C-RAM结合物或者B.500μl 200mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)酪蛋白，0.2％(w/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl RPMI(Gibco)，10(v/v)胎牛血清1ml C-RAM结合物保温5-30分钟后，同时(小心地)连续振荡含有纸条的试管，读出试验结果
条A显示在位点1.3和κ处有特异性着色点，条B未显示任何着色。
实施例3-借助(胶体)碳抗hCG结合物检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)的一和二步骤试验条制备碳颗粒抗α-hCG结合物方法1在物理吸附抗α-h小鼠单克隆抗体(MAB)之前，用5mM KH2PO4缓冲液，pH6.2将贮备C悬液(Degussa Spezialschwarz4)稀释5倍。
向1ml溶于5mM KH2PO4缓冲液，pH6.2中的0.2％(w/v)碳溶胶中加入抗α-hCG MAB(750μg/ml溶胶)。将该悬浮液振荡保温3小时。随后，用5mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5经13,636×g离心15分钟，将所形成的结合物洗三次。再次在各个洗涤步骤中最初形成的上清液以13,636×g离心15分钟，其后，合并沉淀。也可参见实施例1。在第三次和最后一次洗涤步骤之后，将沉淀重新悬浮于起始体积中。将经洗涤的结合物保存4℃黑暗环境下。
方法2另外，亦可向8mg干燥碳粉(例如Degussa Spezialschwarz 100)中加入4ml抗α-hCG MAB(含有溶于5mMKH2PO4缓冲液；pH6.2中的750μg抗α-hCG MAB/ml制成碳颗粒抗α-hCG结合物。在冰上用Branson250型超声波发生器(输出控制3-27 Watt，20KHz)将含有750μg抗-hCG MAB/ml 0.2％(w/v)碳颗粒的悬液匀浆化处理1分钟。
形成一种深黑的，胶体碳颗粒/抗α-hCGMAB-结合物的稳定悬液。为了除去未结合的抗α-hCG MAB，通过离心洗涤形成的结合物(参见方法1)。
制备硝酸纤维素条用a、线性系列稀释的抗β-hCG小鼠单克隆抗体(MAB)在其上点样；b.一条含有大鼠抗-小鼠单克隆抗体的隙线(slot)(阴性试验隙线)和一条含有抗β-hCG MAB的隙线(阳性试验隙线)印迹于其上以制备硝酸纤维素纸条。
a.参见实施例1用溶于10mM PBS，pH7.2中的经线性系列稀释的1000ng，500ng；250ng；125ng；62ng；31ng；15ng；8ng；4ng；2ng抗β-hCG MAB点样。
b.使用真空缝隙印迹装置(PR-600，Hoefer Scientific Instruments)将含有1000ng大鼠抗小鼠单克隆抗体的隙线和含有500ng抗β-hCG MAB的隙线吸印到硝酸纤维素膜(Schleicher andSchuell，AE-99型，其孔径为8.0μm)上，在吸印后将该膜风干3小时。
将膜在10mM PBS，2％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH7.2中于37℃浸泡1.5小时，以封闭硝酸纤维素膜的空余位置。将该膜再次风干，然后固定到粘附性塑料载体材料(Costar Serocluster Platesealers)上，并最后切成10×75mm大小。
将条在黑暗中和室温下干燥保存。
检验步聚二步骤法体外实验在一可加盖的4.5ml聚苯乙烯试管(Greiner)中，在振荡条件下将七个“抗β-hCG条”系列与下列溶液预保温500μl 20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl 2.5mM Tris-HCl，pH8.5，添加有一定量的纯化的hCG(Sigma)，该量在将所述缓冲液合并之后使hCG的终浓度为50；5；1；0.5；0.1；0.05或0单位/ml。
预保温之后，将该条用10mM PBS-T，pH7.2浸泡3次，并用蒸馏水浸泡一次。该条与下列溶液后保温500μl 20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)酪蛋白，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl 2.5mM Tris-HCl，pH8.51ml C溶胶抗β-hCG结合物对于hCG浓度(50-0.1U/ml)，在约5分钟后出现最初的4个点。在保温1小时后，50U/ml hCG的条上显示强度减弱的7个点；5U/ml hCG的条上显示强度减弱的5个点；1U/ml hCG的条上显示强度减弱的4个点；0.5U/ml hCG的条上显示强度减弱的4个点；0.1U/ml hcG的条上显示强度减弱的4个点；0.05U/ml hCG的条上显示低强度的4个点；0U/ml hCG的条上完全未显示有点。
体内实验在可加盖的4.5ml试管中，于振荡条件下将两个“抗β-hCG纸条”与下列溶液一起预保温对照条250μl 2.5mM Tris-HCl，pH8.5250μl 20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl怀孕前四周未怀孕妇女的尿；试验条250μl 2.5mM Tris-HCl，pH8.5250μl 20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl上述阴性试验中同一妇女怀孕后16天时的尿。
预保温之后，将条用10mM PBS-T，pH7.2浸泡3次，并用蒸馏水浸泡1次。将条与下列溶液后保温500μl 2.5mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)酪蛋白，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5500μl 2.5mM Tris-HCl，pH8.51ml C-溶胶抗α-hCG结合物。
几分钟之后，试验条上出现3个点，其中对照条甚至在保温过夜后也未显示有任何点。
试验步骤一步骤法在加10μl 10mM PBS-T，1％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH7.2(移动液)的位置上将带有RAM和抗β-hCG MAB之隙线的两条硝酸纤维素条(Schleicher和Schuell，AE99型)预先润湿，之后立即将10μl碳溶胶抗α-hCG结合物加到相同的施加位置上。
继后，将条上的施加位置的一端浸于玻璃容器中，玻璃容器分别装有2ml加有40U/ml hCG的移动液(阳性试验)，2ml加有5mU/ml hcG(阳性试验)的移动，以及2ml不加hCG的移动液(阴性试验)。当液体前沿已经通过条的整个长度(需要3-5分钟)时，阳性试验条上显示有黑色的RAM隙线和抗β-hCG隙线，而在阴性试验条上仅显示出RAM隙线有颜色。
实施例4-用于借助(胶体)碳抗hCG结合物测定人绒毛促性腺激素(hCG)的一步骤免疫层析试验条制备碳颗粒抗α-hCG结合物将针对hCG之α-亚单位的单克隆抗体(MAb)溶解于5mM磷酸盐缓冲液，pH6.7中，并在同样缓冲液中与胶体碳(Printex 150T)悬液(2mg/ml；由方法A制备)一起保温至终蛋白质浓度为0.75mg/ml。在保温和洗涤之后(参见实施例3)，将最后的沉淀物重新悬浮于5mMTris-HCl，1％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5中达到原体积。将结合物贮存于4℃玻璃管中。
制备硝酸纤维素纸条利用Linomat IV(CAMAG)，以每0.5cmlμl(1μg)的速度将抗β-hCG和RAM(对照)MAB(参见实施例3)行式喷洒在硝酸纤维素条(Schleicher and Schuell，AE99型)上。用0.1M硼酸盐，1％(w/v)BSA，5％(w/v)茧蜜糖二霉菌酸酯(trehalose)，0.05％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.9封闭该条。
一步骤实验将该条置于有样品窗和试验结果窗的装置中。缓冲未怀孕妇女尿(终浓度为0.5M Tris/HCl，0.05％(v/v)吐温-20，pH8.5)，并用一系列稀释的5-300mlU/ml的hCG阻制之。将阻制的人尿(50μl)置于贮液滤膜上放入样品窗中。约1分钟后显示结果。该试验程度的敏感性为10ml U hCG/ml。
实施例5-用碳溶胶颗粒免疫检测法检测人血清白蛋白(HSA)制备碳颗粒抗αHSA结合物将抗HSA单克隆抗体(0.75mg/ml终浓度)偶联到在2.5mM Tris-HCl，pH8中的胶体碳颗粒(Degussa Spezialschwarz100，0.2％(w/v)上。在室温下将该悬液缓慢搅拌3小时。为估测是否吸附成功，按实施例2所述方法进行絮凝试验。按实施例1的方法将该稳定的结合物洗3次。将最后的沉淀重新悬浮缓冲液至初始体积。将该结合物贮存于4℃下。
制备硝酸纤维素条将HSA在10mM PBS，pH7.4中稀释的8份系列稀释液(1000至7.8ng)点样到硝酸纤维素条(Schleicher和Schuell，BA-85/23，孔径为0.45μm)上，在100mM PBS，2％(w/v)BSA，0.02％(w/v)NaN3，pH7.4中将干燥的条在37℃下封闭90分钟。用Serocluster Plate封口机(Costar，Cambridge，UK)给条加封塑料背衬。
一步骤实验以SPIA程式检测HSA。将条置于4.5ml塑料管(Greiner)中，并在含有250μl缓冲液(即20mM Tris-HCl，600mMNaCl，1％(w/v)BSA，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5)，700μl蒸馏水和50μl的胶体碳单克隆抗体结合物的悬浮液中保温(30分钟至16小时)。经肉眼观察和计算机影像分析估测结果。肉眼可检测出点样到条上之7ng HSA的量。经计算机影像分析定量各点的平均灰色水平(grey level)。灰色水平大小以点样之HSA的量的对数函数表示。对于所使用的胶体碳结合物，可以明显地区分出7-500ng HSA样点的平均灰色水平。所绘制的曲线的形状与由相应的ELISA法获得的曲线差不多。
在竞争试验程式中，将已经点样62ng HSA的硝酸纤维素条各置于终体积为1ml，含有250μl，20mM Tris-HCl，600mM NaCl，1％(w/v)BSA，0.2％(v/v)吐温-20，0.02％(w/v)NaN3，pH8.5的相同缓冲缓液中保温，该缓冲液含有渐增量并与胶体碳-抗HSA单克隆抗体结合物混合的游离HSA(0.25至6.75ug)。肉眼观察和计算机影像分析估测抑制率。肉眼观察判断已将0.25μg的游离HSA作为抑制量。对这些结果的数字化分析，在灰色水平和所加入的游离HSA的量的对数值之间给出很好相关性(r＝0.996)。
权利要求
1.一种检测样品中存在的被分析物或其量的方法，包括使所选样品与碳标记的成分接触，该成分包括具有直接结合到胶体碳颗粒表面上的结合成分的含水碳溶胶，其中结合成分能够特异性地识别所述的被分析物，并测定存在或不存在得到的被分析物/碳颗粒复合物，以作为所述样品中存在被分析物或量度被分析物之量的特征，所述方法特征在于具有线性预测值V＞0的碳黑，其中V＝-138.954－0.987×BPD＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按DIN53601测得的以ml/100g数表示的酞酸二丁酯吸附值；VC是按DIN53552测定得的以％表示的易挥发成分含量；PPD是以毫微米表示的平均基本颗粒直径；将该碳黑用于制备实质上非稳定化的含水碳溶胶，该溶胶用于制备所述碳标记的成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的被分析物选自于由受体蛋白和细胞表面上的抗原决定基组成的组中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中被分析物选自于由半抗原、抗原、酶、抗体和抗体片段、DNA和RNA组成的组中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中结合到胶体碳颗粒上的结合成分选自于由半抗原，抗原，酶，抗体和抗体片段，受体蛋白，抗原决定基，DNA和RNA组成的组中。
5.根据权利要求1所述的方法，其为一种固相免疫检测法。
6.根据权利要求1所述的方法，其为一种免疫层析检测法。
7.根据权利要求1所述的方法，其为一种量杆(dipstick)免疫检测法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中的基本胶体碳颗粒的平均基本颗粒大小在1-100nm范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的实质上非稳定化的含水碳溶胶不含有溶胶稳定剂。
10.用于测定样品中被分析物的组合物，所述组合物含有一种含水碳溶胶，其具有直接结合到胶体碳颗粒表面上的一种能特异性识别所述被分析物的结合成分，其特征在于所述含水碳溶胶是一种实质上未稳定化的含水碳溶胶，来源于具有线性预测值V＞0的碳黑，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按DIN53601得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯的吸附酯；VC是按DIN53552测得的以％表示的易挥发成分含量；PPD是以毫微米数表示的平均基本颗粒直径。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中结合到胶体碳颗粒上的结合成分选自于由半抗原、抗原、酶、抗体和抗体片段、受体蛋白、抗原决定基、DNA和RNA组成的组中。
12.一种制备用于检测样品中被分析物之组合物的方法，该方法包括制备含水碳溶胶，直接结合到胶体碳颗粒表面上的一种能特异地识别所述被分析物的结合成分，其特征在于所述含水碳溶胶是一种实质上未稳定化的含水碳溶胶，其来源于具有线预测值V＞0的碳黑，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按照DIN53601测得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯的吸附值；VC是按照DIN53552测得到的以％表示的易挥发成分含量，PPD是以毫微米数表示平均基本颗粒直径。
13.具有线性预测因子值V＞0的碳黑的应用，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按照DIN53601测得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯的吸附值，VC是按照DIN53552测定得的以％表示的易挥发成分含量，PPD是以毫微米数表示的平均基本颗粒直径，其用于制备一种实质上非稳定化的含水碳溶胶，该溶胶具有直接结合到胶体碳粒表面上的一种物质，该物质选自于由半抗原、抗原、酶、抗体和抗体片段、受体蛋白、抗原决定基、DNA和RNA组成的组中。
14.具有线性预测值V＞0的碳黑的实质上未稳定化的含水碳溶胶的应用，其中V＝-138.954－0.987×DBP＋15.609×VC＋3.994×PPD；DBP是按照DIN53601测得的，以ml/100g数表示的酞酸二丁酯的吸附值；VC是按照DIN53552测得的以％表示的易发成分含量；PPD是以毫微米数表示的平均基本颗粒直径，其用于标记一种选自于由半抗原、抗原、酶、抗体和抗体片段、受体蛋白、抗原决定基、DNA和RNA组成的组中的物质，用于制备一种碳标记的免疫检测试剂。
全文摘要
测定样品中存在被分析物或其量的方法，通过使该样品与碳标记的成分相接触，该成分含有线性预测值V＞0的碳黑的实质上未稳定化的含水碳溶胶，其中V＝-138.954-0.987×DBP+15.609×VC+3.994×PPD；
文档编号G01N33/53GK1114423SQ9510546
公开日1996年1月3日 申请日期1995年5月12日 优先权日1994年5月12日
发明者亚特·冯·阿默朗根, 简·赫尔曼·威克斯, 露西尼·伯纳蒂娜·约翰娜·玛丽亚·贝伦森, 艾伯特·威廉·雅克布·冯·多尔恩 申请人:荷兰农业研究所