专利名称：生物活性探针及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测技术，特别涉及一种可直接检测生物分子活性的探针及制备方法和用途。
目前免疫检测技术中所使用的检测方法如文献1，杨宜为编著，“免疫检测技术”，科学出版社，158(1991)中所述的。免疫荧光技术是一种免疫分子检测技术，它以荧光染料为待测分子标记物，因为荧光染料(色素)不但能和抗体蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其它蛋白质结合，用于检测或定位各种抗体，识别和测定免疫分子活性。但是，这些方法必须以荧光色素为待测分子标记物，而要求所用的荧光色素具有一定的荧光效率或量子产量，以及其他条件，但大多数荧光色素不能满足这些条件；在该技术中还要求制备高效价的特异性抗血清，为此，免疫的抗体必须高度提纯，这将造成工艺上麻烦。还要经过标本染色，再用昂贵的荧光显微镜观察。虽然该方法特异性强，速度快(染色步骤和显微镜检查能在1-2小时内完成)，敏感性高。但是，该方法中的非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，工艺过程也比较复杂。需要特殊昂贵的荧光显微镜。并制备出的染色标本只能作短期观察，不能长期保存。荧光的强度随Ph值和荧光染料与抗体的比例而改变，而且对荧光强度的判定带有一定的主观性。
在免疫检测技术中还使用一种免疫酶技术的检测方法如文献2，朱培坤，“免疫酶技术”，山东科学技术出版社，3(1983)中所述的。最初发展的免疫酶检测方法是使酶与抗原或抗体结合，用于检查组织中相应的抗原和抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫染色，底无显色后用肉眼或分光度计来判断结果。也就是说免疫酶技术是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的免疫分子检测技术。该方法的敏感性和特异性同免疫荧光技术相当，它不需特殊的荧光显微镜，应用范围广泛。但是该方法中使酶与抗体(或抗原)交联起来的工艺与条件，直接影响酶标抗体(或抗原)的活性，从而影响免疫酶技术的使用。只有获得一定数量的纯化酶才能用于对抗体(或抗原)的标记，或者在非标记免疫酶技术中作为抗原使用。在免疫酶技术的固相载体方法中，固相载体的选择是否合适，会直接影响实验结果。在免疫酶技术的组织化学方法中，则要注意消除组织中内源酶染色与非特异性染色的干扰，否则会使实验达不到预期的目的。
另外在免疫检测技术中还有一种检测方法如文献1，杨宜为编著，“免疫检测技术”，科学出版社，158(1991)中所述的“放射免疫测定”方法。该方法是目前使用最广泛的免疫分子检测方法，它有特异性强，灵敏度高，能够精确地测定体液中的微量活性物质的优点。但是，严重的缺点是，不得不使用放射性物质为分子标记物，同时需要特殊的检测仪器和安全防护器材，造成实验设备昂贵，实验操作要求严格，实验室中各种试剂、各种仪器、各个步骤等方面的细微变化，都可能造成测定误差。由于该技术使用放射物质，所以易对环境和操作者造成污染和伤害。
本发明的目的在于克服上述已有技术的缺点和不足，为了检测过程中既不使用放射性物质又不使用标记物，尽可能减少影响检测结果的因素；为了提高检测灵敏度，可直接实时检测生物分子活性和生物分子作用的动态过程，从而提供一种可用于内分泌学、免疫病理学、血液学、寄生虫学、微生物学、人体及动物病毒学、植物病毒学、兽医学、肿瘤学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学、医学及药物学、食品卫生学等学科；可用于医院临床疾病和健康状况诊断；并且使用简单，价格低廉的快速生物活性探针及制备方法和用途。
本发明的目的是这样实现的本发明提供的生物活性探针包括三层结构；第一层为固体基片，第二层为在固体基片上经化学方法处理形成亲或疏水极化表面层；然后在此表面上制备一层具有生物活性的单分子吸附膜层，以形成探测生物活性的感应表面膜层为第三层。
将上述已制作好的感应表面膜层放入含有待测活性分子的溶液中，利用探针上的具有生物活性的感应表面及生物分子的特异结合性，溶液中的活性分子与感应表面上的相应活性分子相结合，而形成复合分子，使感应表面的形貌发生变化，即出现表面复合膜层或复合分子进入溶液使原表面的感应膜层部分或全部消失。此表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统观察到，以此判定溶液中生物活性存在与否。
本发明提供的生物活性探针的制备方法依下列步骤进行
1、固体基片表面处理。
a、首先把所需大小的固体基片表面经常规的清洁处理；b、表面亲水化处理将上述清洁处理干净的固体基片在清洗液1中清洗5分钟；再放入清洗液2中清洗5分钟后，即得表面亲水化处理的固体基片；其中清洗液配方如下清洗液1组分H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶NH4OH(浓度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗液2组分H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶HCl(浓度37％ wt)=6∶1∶1(V/V)c、或者表面疏水化处理将上述亲水化处理好的固体基片放入按4∶1(V/V)=三氯乙烯∶硅烷的溶液中，浸泡5分钟，即得表面疏水化处理的固体基片；2、具有生物活性的感应膜层制备将固体基片表面经亲水化处理或表面疏水化处理好的固体基片的一端浸入生物分子溶液内自然吸附生物分子，浸泡的时间根据溶液浓度来定，以吸附饱和为止，取出后用去离子水洗净，即得具有感应表面的生物分子的活性探针。
其中所述的固体基片包括半导体材料(硅片、锗片等)、玻璃、金属、塑料和固体复合材料，如半导体表面镀金属膜的基片等。
其中所述的生物分子包括各种具有特异性结合的生物分子。
本发明的生物分子活性探针可对多种生物分子溶液(如人体的体液、血液去细胞后的液体、尿液去不溶物等生物分子溶液)进行生物分子的活性检测，将具有感应表面的生物分子的活性探针的一部分浸入待测分析物溶液，经一定反应时间(时间长短根据溶液浓度而定)，溶液中的分子与感应表面上的分子特异性结合，形成分子复合物，使感应表面的形貌发生变化，即出现表面复合膜层或复合分子进入溶液，使原表面的感应膜层部分或全部消失。此表面形貌的变化可以通过椭偏成像系统观察到，以此判定溶液中生物活性存在与否。
本发明的用途包括1)优化免疫测定；2)筛选，鉴定受体或配体；
3)免疫特异识别机理的研究；4)内分泌激素检测；5)生物活性探测；6)药物筛选；7)常规门诊免疫检测。
可用于内分泌学、免疫病理学、血液学、寄生虫学、微生物学、人体及动物病毒学、植物病毒学、兽医学、肿瘤学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学、医学及药物学、食品卫生学等学科的研究。
可用于医院临床疾病和健康状况诊断。
本发明的优点及效果1、本发明提供的生物活性探针克服了已有检测方法必须要标记物的缺点，使用本发明的探针进行检测无须标记物；2、对待测分析物无特殊要求；待测样品用量少；只需几微升至几百微升；3、直接测量非纯化分析物；4、可以通过椭偏成像系统直接观察到溶液中生物活性存在与否，实时检测生物分子活性作用的动态过程；5、能够有效排除非特异性吸附、脱吸附或表面污染带来的误差，具有分辨和排除干扰信号能力；6该方法操作简单、只需两步，检测速度快，一般性检测只需30分钟7、检测灵敏度高，同放射免疫方法的灵敏度相当；8、适用范围广，可在气、液相中进行检测。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明
图1是本发明生物活性探针的结构示意2是本发明生物活性探针进行检测的变化示意图实施例1按图1制作一抗IgG生物活性探针，图1中抗IgG生物活性探针包括以下三层组成1-固体基片；2-亲或疏水极化处理表面层；3-具有生物活性的感应膜层。
其制备一抗IgG生物活性探针的方法如下
1)表面处理(疏水处理)将按常规清洗干净的6×20mm2的硅片(1)先在清洗液1中清洗5分钟，再在清洗液2中清洗5分钟进行亲水处理；清洗液1H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶NH4OH(浓度37％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗液2H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶HCl(浓度25％wt)=6∶1∶1(V/V)；将亲水处理好的该表面放入4∶1(V/V)三氯乙烯∶硅烷，浸泡5分钟，即得到疏水极化处理表面层(2)；2)具有生物活性的感应膜层(3)的制备将上述制备好的基片的一部分浸入人血免疫球蛋白G(IgG)(1mg/ml)溶液内自然吸附，持续30分钟时间，然后取出，用去离子水洗净，即得具有探测抗IgG的感应表面层(3)的生物活性探针。
3)用于进行抗IgG活性探测如图2所示，将上述制备好的部分感应表面浸入待测抗人血免疫球蛋白G(IgG0.1mg/ml的分子溶液(不同的生物活性探针，可以浸入任意种生物分子溶液进行检测)，以自然吸附饱和为止，如果溶液中有抗IgG分子，那麽溶液中抗IgG分子与感应表面上的IgG分子特异性结合，形成IgG/抗IgG分子复合物，使感应表面出现表面分子复合膜层，可以通过椭偏成像系统观察到，以此判定溶液中抗IgG生物活性存在。
上述3)的探针和检测方法可用于免疫学研究及多种免疫检测。
实施例2制备一种抗HSA活性探针1)表面处理(亲水处理)将6×20mm2的硅片上镀金膜(50纳米厚)为固体基片(1)，在清洗液2H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶HCl(浓度37％wt)=6∶1∶1(V/V)中处理5分钟，得到亲水极化处理表面层(2)；2)具有生物活性的感应膜层(3)的制备将亲水处理的基片的一部分浸入人血清白蛋白HSA(1mg/ml)溶液内自然吸附，持续30分钟时间，然后取出、洗净即得到在亲水处理的基片上有一层具有探测抗HSA的感应表面层(3)，而成为一种抗HSA活性探针。
3)用本实施例制作的抗HSA活性探针的检测过程将部分感应表面浸入待测抗HSA分子溶液(0.1mg/ml)，经一定反应时间，溶液中抗HSA分子与感应表面上的HSA分子特异性结合，形成HSA/抗HSA分子复合物，使感应表面出现表面分子复合膜层，可以通过椭偏成像系统观察到，以此判定溶液中抗HSA生物活性存在。实施例3制备一种抗BSA活性探针1)表面处理(疏水处理)将清洗干净的6×20mm2硅片先在清洗液1中清洗5分钟，再在清洗液2中清洗5分钟；清洗1液H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶NH4OH(浓度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗2液H2O∶H2O2(浓度30％ wt)∶HCl(浓度37％wt)=6∶1∶1(V/V)；将该硅片表面放入4∶1(V/V)三氯乙烯∶硅烷，浸泡5分钟，即得到在硅片上疏水极化处理表面层(2)；2)具有生物活性的感应膜层(3)的制备将表面疏水处理的硅片的一部分浸入牛血清白蛋白BSA(1mg/ml)溶液内自然吸附，持续30分钟时间，然后取出，洗净，即得到在表面疏水处理的硅片上具有探测抗BSA的感应膜层(3)，而作成一种抗BSA活性探针。
3)本实施例制备的抗BSA活性探针应用实时液相抗BSA活性探测过程将部分感应表面浸入样品池中，在样品池中加入抗BSA溶液，通过椭偏成像系统实时拍摄牛血清白蛋白与其抗体特异性结合过程。随着时间的延长BSA/抗BSA分子复合物膜层逐渐增厚，直到膜层厚度不再变化时停止拍摄。根据膜层厚度的变化就可判定抗BSA生物活性。
权利要求
1.一种生物活性探针，其特征在于包括三层结构，第一层为固体基片，第二层为在固体基片上经化学方法处理形成亲或疏水极化表面层；第三层为在第二层上吸附一层具有生物活性的感应表面膜层。
2.按权利要求1所述的一种生物活性探针，其特征在于所说的固体基片包括半导体材料、玻璃、金属、塑料和固体复合材料。
3.按权利要求1所述的一种生物活性探针，其特征在于所说的半导体材料包括硅片、锗片、砷化镓、镉、硒。
4.按权利要求1所述的一种生物活性探针，其特征在于所说的固体复合材料包括半导体表面镀金属膜的基片和玻璃、金属、塑料材料表面镀金属膜。
5.一种制备权利要求1所述的生物活性探针的方法，其特征在于依下列步骤进行(1)固体基片表面极化改性处理a、首先把所需大小的固体基片(1)表面经常规的清洁处理；b、将上述清洁处理干净的固体基片(1)在清洗液1中清洗5分钟，再放入清洗液2中清洗5分钟，得到具有表面亲水极化处理层(2)的固体基片；其中清洗液配方如下清洗1液组分H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶NH4OH(浓度25％wt)=5∶1∶1(V/V)；清洗2液组分H2O∶H2O2(浓度30％wt)∶HCl(浓度37％wt)=6∶1∶1(V/V)；(2)具有生物活性的感应膜层的制备将固体基片表面经亲水化处理或表面疏水化处理好的固体基片的一端浸入生物分子溶液内自然吸附生物分子，浸泡的时间根据溶液浓度来定，以吸附饱和为止，取出后用去离子水洗净。
6.按权利要求5所述的生物活性探针的制备方法，其特征在于所述的固体基片表面处理，还包括表面疏水化处理，将亲水化处理好固体基片再放入按4∶1(V/V)=三氯乙烯∶硅烷的溶液中，浸泡5分钟；
7.按权利要求5所述的生物活性探针的制备方法，其特征在于所述的生物分子溶液包括各种具有特异性结合的生物分子配制的溶液。
8.应用权利要求1的生物活性探针检测生物分子溶液中生物活性的方法，其特征在于将具有感应表面的生物分子的活性探针的一部分浸入待测分析物溶液，经溶液中的分子与感应表面上的分子特异性结合反应，其反应时间取决于溶液浓度，形成分子复合物，使感应表面的形貌发生变化，在表面出现复合膜层或复合分子进入溶液，使原表面的感应膜层部分或全部消失；该表面形貌的变化再通过椭偏成像系统观察到，判定溶液中生物分子生物活性存在与否。
全文摘要
本发明涉及一种可直接检测生物分子活性的探针及制备方法和用途。该探针由固体基片和经处理形成亲或疏水极化表面,在该表面上制备一层具有生物活性的单分子吸附膜层作为探测生物活性的感应表面膜层组成。将活性探针的一部分浸入待测分析物溶液,经溶液中的分子与感应表面上的分子特异性结合反应,形成分子复合物,使感应表面的形貌发生变化,该表面形貌的变化再通过椭偏成像系统观察到,判定溶液中生物活性存在与否。
文档编号G01N33/50GK1289045SQ9911948
公开日2001年3月28日 申请日期1999年9月20日 优先权日1999年9月20日
发明者靳刚 申请人:中国科学院力学研究所