专利名称：组合靶基因自动检测仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种组合靶基因自动检测仪。
随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，基因序列数据库正以前所未有的速度迅速增长。
然而，如何研究众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能成了本领域研究人员需要解决的课题，这就对大量的脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA序列测定及其分析提出了准确快速的要求。
基因芯片又称DNA芯片或生物芯片的出现为解决此类课题提供了可能的解决办法。
本发明的主要目的在于提供一种利用体外基因芯片技术对人类遗传病、肿瘤和传染性疾病进行基因诊断、基因分型以及法医学和环境分析的靶基因自动检测仪。
本发明所述的检测方法是利用微细加工技术直接在石英晶体上刻蚀出超簿石英谐振器阵列或单一的石英谐振器，然后将大量探针分子固定于镀有金或银膜层的石英晶体支持物上(晶体两侧通过银电极施加一定的电压)，而后在探针与标本进行杂交。由于杂交与否及数量会导致石英晶体谐振频率的改变，将石英晶体谐振频率的变化值输入数据处理系统，即可直观地显示标本的杂交情况和数量。
下面是本发明的
，通过下面的说明并结合以下的详细描述，可以更清楚地理解本发明的原理和构造，其中附图1是本发明所述的组合靶基因自动检测仪中采用的微型石英谐振阵列基因传感器芯片示意图；附图2是附图1所述的芯片的A-A向剖视图；附图3是本发明所述的组合靶基因自动检测仪中电极和探针固定情况示意图；附图4本发明所述的组合靶基因检测仪对HPV及LT检测结果示意图，其中，Y轴是频率减少值，X轴是时间；附图5是本发明所述的组合靶基因自动检测仪组成的流程示意图；附图6是本发明所述的组合靶基因自动检测仪的电路和各部件连接方式示意图。
下面是本发明上述附图的各部件的标号，其中，1探针层，2是上金(或银)膜层，3是石英晶体，4是下金(或银)膜层，5基座，6是银电极，7是探针(或者称已知基因片断)，8是支撑物。
下面是对本发明所述检测仪进行详细描述。
所谓基因芯片(Gene chip)，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱而判断样品中靶分子的存在极其数量。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。
本发明的特点是将基因芯片技术与压电传感器技术结合应用，现有技术中存在着多种基于不同原理而制作的基因芯片传感器，而本发明的贡献在于将基因芯片技术与压电传感器技术相结合，构成独特的检测方法。
由于本发明采用的是利用微细加工技术直接在石英晶体上刻蚀出超簿石英谐振器阵列，石英晶体谐振频率对晶体表面质量微细改变十分敏感，因而其质量检出限可达pg级。并且由于微细加工技术使其易于成批制备，可大大降低成本。
本发明所述的检测仪所采用的基本技术原理如下1、压电现象及压电原理晶体受外界机械压力的作用，在其表面上产生电荷的现象，称为压电效应。
1880年，雅克.居里和皮埃尔.居里兄弟首先发现石英等一些晶体的压电现象并指出，某些电介质物质，在沿一定方向受到外力的作用变形时，内部会产生极化现象，同时在其表面上产生电荷；当外力去掉以后，又重新回到不带电的状态；而且，晶体表面所形成的电荷和外加压力成正比。
现有技术将这种机械能转变为电能的现象，称为“顺压电效应”。
相反，在电介质极化的方向上施加电场，它会产生机械变形；当去掉外加电场时，电介质的变形随之消失。
这种将电能转变成机械能的现象，被称为“逆压电效应”。
现有技术中将具有压电效应的电介质物质统称为压电材料。
在自然界中，大多数晶体都具有压电效应。但多数晶体的压电效应过于微弱，没有实用价值。
比较常见的压电材料有石英、陶瓷等，还包括一些合成和天然的聚合物，如聚偏氟乙烯及DNA、蛋白质等具有一定取向的生物结构，其中石英因其良好的机械、电化学和温度等综合性能，成为压电传感，特别是压电化学和压电生物传感的主要元件。
石英是一种各向异性晶体，按不同方向切割晶体，其物理性质(如弹性、压电效应、温度特性等)相差很大。
研究人员发现，当交变激励电压施加于压电晶体两侧的电极时，晶体会产生机械变形振荡，当交变电压频率达到晶体固有频率时，振幅加大，形成压电谐振，此特定频率称为谐振频率。
依据压电传感的敏感机理，用压电晶体为谐振结构，可以发现其输出信号(谐振频率)与晶体的物理尺寸和性质密切相关。
人们还观察到当晶体被涂上薄层物质以后，其振荡频率会发生相应变化。
Sauerbrey通过AT切割石英晶体在气相中振动首先推导出来有关晶体表面所载物质质量与谐振频移的关系式(2-1)，并以此为依据提出将压电晶体用做灵敏的微天平，故此式常称为Sauerbrey方程。ΔF=-2×Fq2μqρq×ΔmA---(2-1)]]>△F由涂层引起的频率变化值(Hz)。Fq基本响应频率。Fq=ν2tq=12tqμqρq]]>ν声波在空气中的传播速度。
tq石英的厚度(cm)。
μqAT-cut石英的剪切模数(2.947×1011g.cm-1.s-2)。
ρq石英的密度(2.648 g.cm-3)。
△m石英晶片的表面的涂层质量(g)。
A石英晶片的表面积(cm2)。(注意△m是石英晶片两面的涂层总质量，A是石英晶片的一面的表面积。)对于AT切割的石英晶体，其剪切模数(μq=2.95×1011dyn/cm2)和密度(ρq=2.648 g.cm-3)都是定值，将μq和ρq的值代入(2-1)式得到ΔF=-2.26×10-6×Fq2A×Δm---(2-2)]]>以上两式导出的前提是假定石英晶片上均匀沉积的涂层薄膜等效于增加同样质量的一层石英。即要求薄膜与石英是刚性结合的，也就是说电极表面上的质量在晶体振荡时不经受任何剪切形变，这样便可忽略膜层对于石英晶体密度和弹性的差异。
从Sauerbrey等式可以看出，石英晶片在气相中振荡时，△f与△m呈简单的线性关系，因此石英晶片可用来做非常敏感的质量检测器，其检测限可以达到ng级，甚至pg级水平。不过，已经有人证实将Sauerbrey等式应用于“刚性”涂层的研究时，△m/m应该小于等于2％(m是未被沉积前单位面积石英的质量)。
2、晶体液相振荡理论由于压电传感器均是通过测量振荡频率的变化来获取所需的信息，因而对在液相中振荡的晶体，首先遇到并必需了解的两个问题是①影响晶体振荡活性(活力)的因素有哪些，或者说晶体在不同性质溶液中的振荡区间由什么决定；②溶液性质对晶体振荡频率影响如何。只有解决了这两个问题，才能使晶体振荡(应用)体系拓宽，也才能准确地根据晶体振荡频率变化来获取质量传感的信息。
近年来，随着石英晶体液相振荡获得成功，人们对石英晶体液相振荡特性的认识越来越深入。石英晶体的应用范围也得到拓宽，特别是在生物学中的应用。研究人员发现，在液相中，石英晶体微天平不仅对质量敏感，而且会受到外界温度、气压、磁场起伏、冲击震荡、和液体密度、粘度、介电常数、电导、以及流过晶体的激励电流起伏等因素的影响。
已经有很多人在液体环境中进行了将压电石英晶体响应器做为检测器的研究，这些研究证实，质量负载和粘性耦合是导致压电石英晶体频率变化的两个主要作用机理。
因此，本发明的研究人员摸索了一套相适应的标本处理方法并严格控制检测条件；现有技术表明，在对压电石英晶体二端施加电压后，被施压的压电石英晶体频率施固定的，本发明的研究人员在此基础上，在压电晶体上固定探针，这样就会导致整体频率的变化，但是，变化后的频率仍然是固定值，如果单块晶体上只固化一个探针，那么就配备一个固化了同样探针的晶体作为参比检测，如果在同一块晶体通过刻蚀方法得到超簿石英谐振器阵列，就在该阵列选择固化同样探针的其中一个作为参比检测，这样就能扣除由上述因素造成的背景和因外界因素产生的频率漂移，获得稳定的基准频率和真实可靠的实验结果。
而不同的探针的固化带来的石英晶体的频率的变化是可以通过现有技术很容易检测到的。
3、杂交原理简介Watson和Crick等人于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型的概念。他们指出(1)DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成的，这两条链在化学上具有相反方向。即……P—5′—核糖—3′—P……的结构与……P—3′—核糖—5′—P……的结构相对。
(2)碱基成对有一定规律Chargaff等应用层析法对多种生物DNA的碱基组成进行分析，发现DNA中腺嘌呤数目(A)与胸腺嘧啶(T)的数目相等，胞嘧啶(C)的数目与鸟嘌呤(G)数目相等。因此，在DNA中有四种可能的碱基对A—T、T—A、G—C、C—G。
(3)两条链主要由碱基间的氢键相连碱基对的平面穿过螺旋轴，约与螺旋轴垂直。AT间可形成两条氢键，GC间可形成三条氢键。同时，对于DNA双螺旋的结构稳定而言，还需借助疏水键的作用力。
(4)由于四种碱基对都适合此模型，每条链可以有任意的碱基顺序，但由于碱基成对的规律性，如一条链的碱基顺序已确定，则另一条链必有相对应的碱基顺序。
由于DNA双螺旋结构主要靠氢键和疏水键维系，因此加热、酸碱、有机溶剂等凡是能破坏氢键和疏水键的因素都能引起变性，使DNA的双螺旋结构变为无规则线团。不同变性DNA片段之间，通过碱基互补配对进行的“复性”称为杂交。杂交不仅可以发生在DNA与DNA链间，也可在DNA与RNA链的同源序列之间进行。杂交过程中两条互补的单链DNA以非共价键方式形成双键杂合体。当其中一条链的序列已知时，通过检测杂交过程，就可以探明未知DNA样品中是否含有与已知序列互补的DNA存在。现在，杂交技术已广泛应用于DNA的研究中。
虽然长链DNA分子不是刚性的，而且每个核苷酸残基都有6个可以自由旋转的单链，使DNA双螺旋可能以不同的构象形式存在；但是干燥状况下的短链DNA分子仍然具有一定的刚性，而且固定在电极上的寡核苷酸的空间距离很小；由于固定后的DNA在晶片上是成膜的，加上固定的寡核苷酸探针的质量相对晶体自身质量而言非常小，因此能够满足本发明的实验要求。
本发明所述的将压电基因传感器用于靶基因检测的基本工作原理是在某个固体支持物上固定一段基因，具体地讲，所述的固定支持物可以是压电石英晶体，在压电石英晶体的二端通过银电极施加电压，从而得到一固定的频率，然后利用其在溶液中同与之互补的寡核苷酸进行杂交，杂交过程的质量负载和粘性耦合的变化通过导致石英压电晶体的频率变化，将该频率的变化值通过分析就可以得出是否杂交以及杂交的数量，从而实现了液相中具体的DNA的检测。已知基因片断在支持物上的固定情况如图3所示。
在本发明中，研究人员主要应用了石英晶体微天平QCM(Quartz CrystalMicrobalance)技术即压电传感器技术并结合基因芯片技术来检测DNA，并比较了不同固定方法对传感器响应时间、杂交效率等情况的影响。
压电基因传感器是基于体声波器件-压电石英谐振器对其表面质量变化的敏感(质量灵敏度可达ng级)，无须杂交指示剂直接检测传感器表面的DNA杂交反应，此类传感器也有称为体声波和石英(晶体)微/纳天平DNA传感器。在传感器DNA探针固定化方法的研究中，Nicolili等用LB膜技术在石英谐振器上沉积得到与脂肪胺混合的ssDNA的单分子层，有很好的杂交反应活性；Fawcett等在传感器表面分别用疏水性的聚苯烯、聚乙烯和丙烯酸的共聚物交联固定探针，初步探讨了高分子在研制DNA传感器中的应用。由于生物大分子易在亲水性表面吸附，为使探针活性达到最大，同时降低非特异性的吸附，应尽可能减弱传感器表面除探针位点外的生物亲和性，在疏水性高分子表面接上反应位点可能成为杂交型DNA传感器的理想表面。
过去压电基因传感器多是比较杂交前后传感器干燥表面的质量变化进行检测，随着液相压电传感器技术的成熟，通过现场监测杂交过程，使压电基因传感器更为简便和快捷；同时也可进行表面杂交过程动力学的研究，为基因传感器的优化提供依据。这方面率先开展研究的是Okahato实验室，他们测定了10到30-mer寡核苷酸双链互补结合的平衡常数、结合及离解的速度常数等动力学参数以及表面的杂交结合量；并通过改变探针的固定方法、探针和靶基因的长度、错配的碱基数、杂交温度、杂交液离子强度等因素，详细研究了传感器表面杂交过程动力学特性。
基因探针-单链DNA片段(寡核苷酸)在传感器表面的固定化，是基因传感器的首要和基本条件。
本发明所述的检测仪所采用的探针固化方法包括有吸附法、共价键合法和组合法三种的任何一种，采用现有技术中的后两类方法，虽然可得到牢固的探针修饰层，但其表面杂交反应活性位点少，且方法复杂。
但是，本发明的研究人员注意到，利用具备某些结构的分子的自组装作用，制备末端修饰的探针，使其在表面自然形成稳定、高度有序的单分子层(SAMs)，无疑具有理想的反应活性，本发明优选采用巯基进行末端修饰，即优选采用巯基共价键结合法。
前述各种基因传感器中，无需标记或杂交指示剂的SPR和压电传感器易于大批量制备，技术简便快捷，可进行实时现场监测，所需设备也较简单便宜。这两类传感器已成为基因传感器研究的主流。
基因传感器发展的一个具有重要意义的趋势是构制微型基因传感器阵列即基因传感器芯片。至今除前已提及的用SPR显微技术进行的尝试外，Arlinghaus等用溅射激发共振离子化微探针技术检测用同位素标记DNA与基因传感器芯片的杂交，而本发明采用了区别于上述现有技术的微型压电石英谐振器阵列构制了本发明所述的靶基因组自动检测系统。
本发明所述的靶基因组自动检测仪的组成和操作步骤如下该仪器的主要操作为首先进行标本采集处理，然后通过进样系统将标本加入杂交反应系统(杂交反应系统是指由基座、芯片、导线构成的多道(孔)反应装置)；杂交反应系统将标本和探针接触后的频率变化参数以及对比检测参数的数据反馈给数据采集及处理系统(数据采集及处理系统包括了多道测试采集和实时中央信号处理)，所述的多道测试采集实际上是对多个压电石英晶体上的探针或一块压电石英晶体阵列上的多个探针因和标本结合而产生的参数的变化依序采集；实时中央信号处理最终以分道数据显示、数据综合处理、图像显示得以表现。
实际上，本发明所述的微型压电石英谐振器可以是单块石英晶体固化一种探针，也可以采用微型压电石英谐振器阵列，这样就可以在一块石英晶体上被刻蚀的大量小块上设有大量的探针，见附图1，通常设有至少9种探针。
本发明可以采用在一个芯片上标记不同种类的探针(即多种特异的基因片段--核苷酸序列)。探针种类的不同，检测的基因信息就不同；如果仅标记一种探针，可对不同来源的多个标本进行同种基因信息的检测和分析(如某种病原体乙肝病毒等)；如标记多种探针，即可对一个标本的多种基因信息进行诊断和分析(如检测肝炎时，可以固定多种探针检测甲、乙、丙等肝炎)。
本发明所述的将压电基因传感器芯片用于靶基因检测的基本工作原理是在某个固体支持物上固定一段基因，具体地讲，所述的固定支持物可以是压电石英晶体，在压电石英晶体的二端通过银电极施加电压，从而得到一固定的频率，然后利用其在溶液中同与之互补的寡核苷酸进行杂交，杂交过程的质量负载和粘性耦合的变化通过导致石英压电晶体的频率变化，将该频率的变化值通过分析就可以得出是否杂交以及杂交的数量，从而实现了液相中具体的DNA的检测。已知基因片断在支持物上的固定情况如图3所示。
下面是本发明的所述的检测仪中的微型压电石英谐振器阵列基因传感器芯片归纳其中，本发明所述的微型压电石英谐振器阵列基因传感器芯片包括被刻蚀成阵列的AT切石英晶体3，在石英晶体的下表面镀有金属膜层4，在石英晶体阵的上表面镀有呈相同阵列的金属膜层2，在呈阵列的上金属膜层2的上表面固化有探针阵列层1，相应的探针7处固定有电极6，下金属膜层与基座5热压键合；所述的阵列数至少为一个，优选至少为六个，最好至少为九个；其中，所述阵列的块数和被固化的探针层1的数量是相同的；所述阵列所呈现的块之间设有沟槽9；所述的金属膜层可以是金膜层或银膜层；所述的电极是银电极；所述的基座是玻璃基座；为了减小其它因素的影响，在所述阵列中固化有同样探针中的一个被作为参比检测；本发明采用的固化方法可以是吸附法、共价键合法和组合法，但优选采用巯基末端修饰共价键结合法。
本发明所述的靶基因组自动检测仪的操作步骤如下1．标本处理标本中核酸的提取，内切酶处理(不同标本用不同的酶)根据不同的样本进行目的片段的分离提纯等；2．若芯片非一次性使用，在进样测试前进行电极清洗，本发明所述的检测仪优选使用一次性芯片；3．启动电脑操作软件程序，内容包括进样、实时监控、信号处理、图像显示系统及结果分析；4．由经进样孔进样将标本合探针接触使之产生杂交反应；5．根据电脑数据及图像得到测试结果；6．清洗进样池及反应池；7．循环操作。
本发明所述的靶基因组自动检测仪采用了生物工程学、分子生物学、传感器、微细加工技术等，其主要用途包括对疾病的诊断(传染性疾病、遗传病、肿瘤、心血管疾病等)、基因突变的检测、新药物的研制开发和环境监测。
本发明所述的靶基因组自动检测仪的检测性能如下表1所示表1
本发明所述的靶基因组自动检测仪的优点如下本发明所采用的微型压电石英谐振器阵列构制的芯片的灵敏度可达pg级；特异性与目前所用标记检测技术相同。
本发明所述的靶基因自动检测仪具备可原位测定、无需标记、随时可获得检测信息、体积较小、便于携带、使用方便、成本低廉等优点，适合于临床和野外环境检测。
表2本发明所述的检测方法和检测仪与常规方法的性/价比较
注ELISA和培养法是目前临床广泛应用检测病原体的方法本发明所述的靶基因自动检测仪的保护范围可见权利要求，但不仅限于此，在本发明构思下对本发明所述的检测仪所作的部件组合的改变都应该在本发明的保护范围之内。
下面是实施例，所述的实施例只是用来说明本发明，而不是用来限定本发明的。
实施例1采用上述本发明的检测仪，用30bp的Hpv18(7021-7050)片段和20bp的毒素原性大肠杆菌(ETEC)产生的不耐热肠毒素(LT)片段固定于芯片上，对标本进行检测，见图4，由图4可知，当反应约5分钟时达平衡，此时芯片震荡频率减少约40-50HZ，其中，■连线为标本阴性对照，▲连线为对HPV的测试结果，X连线为对LT的测试结果。
实施例2表3和表4是用常规培养方法、PCR方法和组合靶基因自动检测仪分别对结核杆菌、淋球菌(已确知有无的标本)检测的结果比较。
表3所示的30份淋球菌标本中阴性标本为1、8、9、10、11、14、15、18、19、20、21、22、23、26、27，其余均为阳性；表4所示的30份结核杆菌标本中阴性标本为1、6、7、9、11、18、19、21、22、27、28，其余均为阳性。
比较检测结果可以看出，常规培养方法比较准确和客观，但灵敏度有限，PCR方法灵敏度高但易出现假阳性，由实验数据可得无论准确度还是灵敏度，本发明所述的自动靶基因检测仪的检测效果是优于这两种方法的。
表5是本发明所述检测仪的电路示意。
本发明所述的检测仪，除了芯片外，电路的各部分都可以采纳现有技术中的电路，本发明的贡献之一是将各检测电路组合并结合本发明所述的芯片以达到本发明的目的本发明所述的靶基因自动检测仪的特点是DNA芯片和传感器技术相的组合，具有如下优点1、价格低廉，便于携带；2、使用方便，可原位和实时监测；3、无需标记，可长期保存，反应第三敏感性高；4、可同时检测多组标本。
表1．淋球菌临床检验结果报告
表2．结核杆菌临床检验结果报告
表3
权利要求
1.组合靶基因自动检测仪，其特征在于所述的检测仪包括进样系统、杂交反应系统、数据采集及处理系统、多道测试采集系统和实时中央信号处理系统。
2.根据权利要求1所述的检测仪，其特征在于所述的杂交反应系统包括基座、芯片、导线。
3.根据权利要求1所述的检测仪，其特征在于所述的数据采集及处理系统包括多道测试采集和实时中央信号处理。
4.根据权利要求1所述的检测仪，其特征在于所述的多道测试采集实际上是对多个压电石英晶体上的探针或一块压电石英晶体阵列上的多个探针因和标本结合而产生的参数的变化依序采集。
5.根据权利要求1所述的检测仪，其特征在于所述的实时中央信号处理最终以分道数据显示、数据综合处理、图像显示得以表现。
6.根据权利要求1所述的检测仪，其特征在于所述的芯片包括被刻蚀成阵列的AT切石英晶体3，在石英晶体的下表面镀有金膜层或银膜层4，在石英晶体阵的上表面镀有呈相同阵列的金膜层或银膜层2，在呈阵列的上金膜层或银膜层2的上表面固化有探针阵列层1，相应的探针7处固定有银电极6，下金膜层或银膜层层与玻璃基座5热压键合。
7.根据权利要求6所述的芯片，其特征在于所述的阵列数至少为为九个；所述的阵列数和被固化的探针层1的数量是相同的。
8.根据权利要求1、6、7、8任一项所述的芯片，其特征在于所述的阵列所呈现的块之间设有沟槽9，
9.根据权利要求1所述的基因传感器芯片，其特征在于所述阵列中固化有同样探针中的一个被作为参比检测。
10.根据权利要求6所述的基因传感器芯片，其特征在于所述的探针固化优选采用巯基末端修饰共价键结合法。
全文摘要
本发明涉及的是一种组合靶基因自动检测仪;该检测仪包括进样系统、微型石英谐振阵列基因传感器芯片、杂交反应系统、和数据处理系统,本发明主要是利用微细加工技术直接在压电石英晶体上刻蚀出超薄石英谐振器阵列,然后固化大量的探针,所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析而得到所需要的数据,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足;本发明所述的靶基因自动检测仪具备可原位测定、无需标记、随时可获得检测信息、体积较小、便于携带、使用方便、成本低廉等优点。
文档编号G01N35/00GK1296185SQ9912357
公开日2001年5月23日 申请日期1999年11月10日 优先权日1999年11月10日
发明者府伟灵, 汪江华, 刘明华, 王颖莹 申请人:重庆西南医院