一种测定花生籽仁内源激素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种测定花生籽仁内源激素的方法。
【背景技术】
[0002] 植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移作用部位，在 极低浓度下就有明显的生理效应的微量物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素。
[0003] 植物激素与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与 萌发以及离体组织培养等方面息息相关，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。 这种调节的灵活性和多样性，可通过使用外源激素或人工合成植物生长调节剂的浓度与配 比变化，进而改变内源激素水平与平衡来实现。植物内源激素对植物体生长发育过程的调 节，并不是单一激素作用的结果，而是多种激素之间相互作用的结果。因此，开展生理水平 的多种内源激素检测及相关的前处理技术的研宄是探索植物激素生理作用的基础工作。
[0004] 植物内源激素的测定方法很多，根据其原理主要分为三类：生物鉴定法、免疫学方 法和物理化学法。高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)分析 植物内源激素以来，由于其具有灵敏度高和选择性、重复性好及分析速度快等特点，已在除 乙烯外的四大类植物激素和生长调节剂的研宄领域中得到不断发展。植物内源激素对植 物的各种生理活动起着重要的调节作用，因此，对其进行精确的定量检测成为学界关注的 焦点之一。
[0005] 现有技术利用高效液相色谱法测定籽粒中内源激素的含量，普遍是使用聚乙烯吡 咯烷酮去除花生籽粒中的酚类，但是聚乙烯吡咯烷酮为水溶性的，对提取效果产生影响；在 酸性条件下3-吲哚乙酸、脱落酸和赤霉素三种激素能被最大限度的提取，而细胞分裂素只 有在碱性条件下才能被提取，现有技术将四种激素一起提取，大大减少了激素的提取量，导 致最终检测结果不准确；现有技术采取等度脱洗，导致谱图出现峰图重叠、过度密集、拖尾 等问题，内源激素得不到良好的分离；同时还存在操作复杂，成本高，一次只可处理一个样 品，耗时，待测物在提取过程中的损失大等问题。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种测定花生籽仁内源激素的方 法。通过该方法可以将内源激素最大限度的提取，在提取过程中内源激素的损失小，得到的 高效液相色谱图目标峰无重叠、无拖尾。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种测定花生籽仁内源激素的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)花生籽仁用液氮研磨成粉，称取l.Og置于离心管中，加入4_6mL体积分数为 80%的预冷甲醇，摇匀，在0-4°C避光浸提12-24h，得到浸提样品；
[0010] (2)将步骤⑴得到的浸提样品在0-4°C以3000-4000r/min的转速离心20min， 收集第一上清液，得到残渣；
[0011] (3)将步骤⑵得到的残渣再次使用4-6mL体积分数为80%的预冷甲醇浸提，并 在0°C冰水混合物中振荡2-4小时，然后在0-4°C以3500-4500r/min的转速离心15min，得 到第二上清液，合并步骤（2)得到的第一上清液和所述第二上清液，得到上清液；
[0012] (4)将步骤（3)得到的上清液在30_38°C下旋转减压蒸发，去除上清液中的甲醇， 得到浓缩液；
[0013] (5)将步骤⑷得到的浓缩液用等体积的三氯甲烷萃取三次，留取上层水相，然后 向水相中加入交联聚乙烯吡咯烷酮振荡5-10min去除酚类，再以4500-5000r/min的转速离 心5min，得到第三上清液；
[0014] (6)将步骤（5)得到的第三上清液用lmol/L的盐酸调节至酸性，用等体积的乙酸 乙酯萃取三次，合并上层酯相用氮吹仪吹干，得到残留物一；下层水相用0. 5mol/LNaOH调 节至碱性，用等体积的体积分数为80%的水饱和正丁醇萃取三次，合并上层酯相后用氮吹 仪吹干，得到残留物二；
[0015] (7)将步骤（6)得到的残留物一和残留物分别用0. 8-1. 2ml甲醇水混合液溶解，甲 醇与水的体积比为45:55,过微孔滤膜后用高效液相色谱仪进行分析，高效液相色谱采用梯 度脱洗。
[0016] 进一步，步骤（1)中所述甲醇中混合有27-32mg/L的二乙基二硫代氨基甲酸钠。
[0017] 进一步，步骤（1)和（3)中所述预冷甲醇为将甲醇放置4°C环境中12-24h所得。
[0018] 进一步，步骤（5)中所述交联聚乙烯吡咯烷酮的用量为l_3mg。
[0019] 进一步，步骤（6)中所述酸性溶液pH值为2. 5-2. 8,所述碱性溶液pH值为 8. 0-8. 5 〇
[0020] 进一步，步骤（7)中所述水中混合有体积分数为0. 4-0. 5%的冰醋酸。
[0021] 进一步，步骤（7)中所述微孔滤膜为0. 22ym。
[0022] 进一步，步骤（7)和步骤（8)中所述高效液相色谱仪柱温为28-32°C，流动相流速 为0? 8-lml/min，紫外检测波长为254nm。
[0023] 进一步，步骤（7)中所述梯度脱洗条件如下表1，甲醇与水的总量为100份。
[0024] 本发明和现有技术比较，具有以下有益效果：
[0025] (1)使用甲醇代替现有技术中的乙腈，能大大节约实验成本；
[0026] (2)采用不溶于水的交联聚乙烯吡咯烷酮，待其吸附完杂质后，可以通过离心直接 将其除去，不会对后续实验产生影响；
[0027] (3)在酸性条件下3-吲哚乙酸、脱落酸和赤霉素三种激素能被最大限度的提取， 而细胞分裂素只有在碱性条件下才能被提取，所以本发明将四种激素在不同的PH条件下 提取，使各种激素都能得到最大程度的提取，保证最终结果的准确性；
[0028] (4)植物内源激素在提取过程中极易降解，氮气为惰性气体，采用氮吹仪能对激素 进行保护，使之尽量减少降解带来的损失；
[0029] (5)氮吹仪一次可以处理多个样品，大大缩短实验时间；
[0030] (6)采用直径0. 22ym的有机滤膜，可以过滤更小的杂质，保护色谱柱，增加其使 用寿命，减少成本；
[0031] (7)采用甲醇和水（冰醋酸0.5% )作为流动相进行梯度洗脱，经过反复测试确 定出稳定的洗脱条件，使不同种类的内源激素得到良好的分离，避免了多种植物内源激素 出现峰图重叠、过度密集、拖尾等问题；
[0032] (8)流动相的速度提高一倍，大大节约了实验时间。
【附图说明】
[0033] 图1为吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素标准样品色谱图；
[0034] 图2为细胞分裂素标准样品色谱图；
[0035] 图3为本发明实施例二的花生籽仁中吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素的色谱图；
[0036] 图4为本发明实施例二的花生籽仁中细胞分裂素的色谱图；
[0037] 图5为本发明实施例三的花生籽仁中吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素的色谱图；
[0038] 图6为本发明实施例三的花生籽仁中细胞分裂素的色谱图；
[0039] 图7为本发明实施例四的花生籽仁中吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素的色谱图；
[0040] 图8为本发明实施例四的花生籽仁中细胞分裂素的色谱图。
【具体实施方式】
[0041] 为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对 本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0042] 实施例一：
[0043] 一种测定花生籽仁内源激素的方法，包括以下步骤：
[0044] (1)花生籽仁用液氮研磨成粉，称取l.Og置于离心管中，加入4-6mL体积分数为 80%的预冷甲醇，所述甲醇中混合有27-32mg/L的二乙基二硫代氨基甲酸钠作为抗氧化 剂，摇匀，在〇-4°C避光浸提12-24h，得到浸提样品，所述预冷甲醇为将甲醇放置4°C环境中 12-24h所得，使用甲醇代替现有技术中的乙腈能大大节约实验成本；
[0045] (2)将步骤⑴得到的浸提样品在0-4°C以3000-5000r/min的转速离心20min，收 集第一上清液，得到残渣；
[0046] (3)将步骤（2)得到的残渣再次使用4-6mL体积分数为80%的预冷甲醇浸提，该 步骤中所用预冷甲醇的量与步骤（1)的用量相同，并在〇°C冰水混合物中振荡2-4小时，所 述预冷甲醇为将甲醇放置4°C环境中12-24h所得，然后在4°C以3500-4500r/min的转速离 心15min，得到第二上清液，合并步骤（2)得到的第一上清液和所述第二上清液，得到上清 液；
[0047] (4)将步骤（3)得到的上清液在30_38°C下旋转减压蒸发，去除上清液中的甲醇， 得到浓缩液；
[0048] (5)将步骤⑷得到的浓缩液用等体积的三氯甲烷萃取三次，留取上层水相，然后 向水相中加入l_3mg交联聚乙烯吡咯烷酮振荡5-10min去除酚类，再以4500-5000r/min的 转速离心5min，交联聚乙烯吡咯烷酮及其吸附的杂质会沉积在离心管底部，不会对提取结 果产生影响，得到第三上清液，内源激素溶于第三上清液中；
[0049] (6)