专利名称:一种室温提取花生种子中总rna的方法
技术领域：
本发明涉及一种室温提取花生种子中总RNA的方法，属于生物技术技术领域：
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背景技术：
花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的油料作物和经济作物，含人体所必须的各种氨基酸，是食用油的重要来源。我国是花生生产大国，全国花生产量占油料作物总产量的一半以上，同时也是世界上花生出口量最多的国家，出口量占世界总量的40%。当前，随着人们消费水平的提高及对植物油日益增长的需求，提高花生的产量和油脂品质已具有重大意义。已有研究表明，决定食用植物油脂品质的关键因素是脂肪酸的构成。在花生脂肪酸研究中，对控制花生脂肪酸相关酶基因在花生不同部位的表达模式进行分析及其重要，而花生总RNA提取过程中DNA污染对半定量RT-PCR的影响尤为严重。不同的RNA提 取方法对花生同一组织材料提取的结果差异很大。
花生种子总RNA提取是花生分子生物学实验中的必备技术，目前因为花生中多糖、多酚等次生代谢物质较多，总RNA提取相对困难。使用CTAB法、SDS法及常规试剂盒对花生总RNA的提取存在提取量少、降解严重及DNA污染等问题，严重阻碍了花生脂肪酸的研究工作。
公开号为CN101935648A(申请号201010281633.6)的中国专利，公开了一种提取RNA的方法和试剂盒。提取RNA的方法为样品与裂解液混匀，离心收集上清与1/2体积无水乙醇混匀，结合于O. 45 μ m玻璃纤维素膜后，用去蛋白液和漂洗液洗涤，最后洗脱吸附的RNA。上述方法，还包括裂解细胞与助提剂混匀，离心去除多糖多酚类物质。提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液，还包括助提剂。
公开号为CN101638651A(申请号200910094704.9)的中国专利，公开了一种利用
异硫氰酸胍-氯仿抽提、TRIS饱和酚纯化植物RNA的抽提方法。本发明改良了传统的异硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚纯化两步法，分别从红皮梨的叶片和果皮、葡萄的叶片和果肉、果皮组织以及草莓果实和新疆紫草愈伤组织中提取到了高质量的总RNA。该方法的抽提缓冲液中含有异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和B-巯基乙醇，既能高效裂解植物细胞释放RNA，有效抑制RNA酶的活性，还能防止酚类物质的氧化和排除次生代谢物质的干扰。第二步用TRIS饱和酚纯化粗提RNA溶液，能除去与RNA共沉淀的多糖和蛋白质。
上述专利虽然部分解决了杂质对结果的影响，但上述方法操作繁琐，操作周期长，且对实验温度等条件要求苛刻，因此导致该方法的可再现性较差，实验结果的准确性不高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种室温提取花生种子中总RNA的方法。该方法提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点，同时可为花生基因克隆、定量表达分析及功能研究等分子生物学实验研究奠定基础。[0008]一种室温提取花生种子中总RNA的方法，步骤如下
(I)在液氮冷却并去除RNA酶的条件下研磨花生未成熟种子，研磨时间为O. 5
I.5min，得花生冻干粉；
(2)将步骤(I)制得的花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20 32°C、12000 13000rpm离心5 7min，取上清液，得一次离心上清液；加入β -巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮避免多酚类物质的影响；
(3)将步骤(2)制得的一次离心上清液中加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20 32°C、12000 13000rpm离心5 7min,取上清液,得二次离心上清液；
(4)将步骤(3)制得的二次离心上清液中加入异丙醇混合，-20 _25°C静置10 15min, 20 32°C > 12000 13000rpm离心5 7min,取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。
所述步骤(2)中每百毫克花生冻干粉中加入Trizol试剂为700 900μ1、2%β-巯基乙醇15 20μ 1、2%聚乙烯吡咯烷酮15 20 μ I。
所述步骤(2)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液为苯酚、氯仿和异戊醇按体积比
25 24 I混合制得。
所述步骤(2)中的振荡为涡旋振荡15 25s。
所述步骤(3)中氯仿/异戊醇混合液为氯仿和异戊醇按体积比24 I混合制得。
所述步骤⑵和步骤(3)中的静置为2 6°C静置3 7min。
所述步骤(4)中的醇洗为75%乙醇洗涤。
所述步骤(4)中的复溶为灭菌DEPC (焦碳酸二乙酯)水溶解。
本发明具有以下优点
I、本发明所述方法离心步骤在20 32°C的室温下操作，且各步骤操作时间较原有技术时间短，从而缩短了 RNA被降解的时间，因此，重复性好，操作时间短，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。
2、本发明所述方法利用巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮去除多糖及多酚类物质对RNA的干扰及影响；同时利用苯酚/氯仿/异戊醇抽提次数少，减少了 RNA在提取过程中的损失。
3、本发明所述方法具有鉴定效率高，成本低，周期短等优点。提取的RNA可直接进行下游半定量RT-PCR、RACE和Real-time PCR等分子生物学研究。
图I、本发明提取的花生种子总RNA琼脂糖凝胶电泳图；
其中I、花生果针入土后10天的未成熟种子总RNA，2、花生果针入土后20天的未成熟种子总RNA，3、花生果针入土后30天的未成熟种子总RNA，4、花生果针入土后40天的未成熟种子总RNA，5、花生果针入土后50天的未成熟种子总RNA，6、花生果针入土后60天的未成熟种子总RNA，7、花生果针入土后70天的未成熟种子总RNA。
图2、花生种子各发育时期Real-time PCR扩增曲线图；
图3、花生种子各发育时期Real-time PCR熔解峰图；
图4、花生种子各发育时期AhFatB基因半定量RT-PCR结果；[0029]图5、花生种子个发育时期AhFatB基因Real-time PCR结果。
具体实施方式
下面结合
及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所用实验用品处理及试剂配制说明
RNA提取过程中要使用的枪头、枪头盒、离心管等塑料器皿应使用O. 1% DEPC水浸泡4h后高压蒸汽灭菌，烘干；
研钵用氯仿润洗消毒；研钵、药匙及玻璃器皿应用铝箔纸包好后于烘箱中180°C干热灭菌6-8h ；
75 % 乙醇用 O. I % DEPC H2O 配制。
实施例
一种室温提取花生种子中总RNA的方法，步骤如下
I)分别称取花生果针入土后10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天(10-70DAP)的未成熟种子IOOmg于酒精烧过并液氮冷却的研钵中，加液氮研磨I分钟，制得花生冻干粉；
2)将步骤I)制得的花生冻干粉加入到含有800 μ I Trizol的I. 5ΕΡ管中，并加入2% β-巯基乙醇18μ I和2%聚乙烯吡咯烷酮18 μ 1，以避免多酚类物质的影响；涡旋振荡20s后加500 μ I苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25 : 24 : I)，充分混匀，静置Imin ；13000rpm，24°C离心5min ;取上清液，得一次离心上清液；
3)将步骤2)制得的一次离心上清液转入新的I. 5ml离心管中，加500 μ I氯仿/异戊醇(体积比24 I)，充分混匀，静置Imin ;13000rpm，24°C离心5min ;取上清液，得二次离心上清液；
4)取步骤3)制得的二次离心上清液转入新的I. 5ml离心管中，然后加500 μ I异丙醇，-20°C静置IOmin ;然后13000rpm，24°C离心5min，取沉淀，加入75%乙醇洗涤沉淀，13000rpm，24°C离心2min，弃上清；在超净工作台上吹干后加灭菌的O. 1% DEPC H2O溶解，即得花生种子中总RNA。
花生种子总RNA完整性及纯度检测
1)1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测上述制得的花生种子总RNA样品，由图I可见，5s、18s、28s条带清晰、整齐,28s条带亮度接近是18s条带亮度的两倍,说明所提取的花生种子总RNA具有完整性较好。
2)取上述制得的花生种子总RNA样品，用灭菌的O. I % DEPC H2O稀释20倍，以灭菌的O. 1% DEPC H2O为空白对照，利用紫外分光光度计测230nm、260nm、280nm波长处得OD
值。计算A26tlA28tl和A26tZA23tl比值。检测结果表明，所提取的花生种子总RNA A26(l/A28(l比值在I. 8-2. O之间，A260A230比值大于2. O,说明RNA纯度较好。具体花生种子总RNA纯度及得率检测结果参见下表
权利要求
1.ー种室温提取花生未成熟种子中总RNA的方法，步骤如下 (1)在液氮冷却并去除RNA酶的条件下研磨花生未成熟种子，研磨时间为0.5 I.5min，得花生冻干粉； (2)将步骤(I)制得的花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入巯基こ醇和聚こ烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20 32°C、12000 13000rpm离心5 7min，取上清液，得一次离心上清液； (3)将步骤(2)制得的一次离心上清液中加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20 32°C > 12000 13000rpm离心5 7min,取上清液,得二次离心上清液； (4)将步骤(3)制得的二次离心上清液中加入异丙醇混合，-20 -25°C静置10 15min, 20 32°C、12000 13000rpm离心5 7min,取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得； 所述步骤(2)中每百毫克花生冻干粉中加入Trizol试剂为700 900yl、2% fi-巯基こ醇15 20iil、2%聚こ烯吡咯烷酮15 20iil。
2.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中苯酚/氯仿/异戊醇混合液为苯酚、氯仿和异戊醇按体积比25:24:1混合制得。
3.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的振荡为涡旋振荡15 25s0
4.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中氯仿/异戊醇混合液为氯仿和异戊醇按体积比24:1混合制得。
5.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的静置为2 6°C静置3 7min。
6.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的醇洗为75%こ醇洗涤。
7.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的复溶为灭菌DEPC水溶解。
专利摘要
本发明涉及一种室温提取花生种子中总RNA的方法，属于生物技术技术领域：
。包括如下步骤(1)研磨花生未成熟种子，制得花生冻干粉；(2)将花生冻干粉加入Trizol试剂，然后加入β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮振荡，再加入苯酚/氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(3)加入氯仿/异戊醇混合液混合，静置，20～32℃离心，取上清液；(4)加入异丙醇混合，静置，20～32℃离心，取沉淀，醇洗后，干燥，复溶，即得。该方法离心步骤在20～32℃完成，且操作时间较原有技术时间短，从而缩短了RNA被降解的时间，重复性好，提取的花生种子总RNA具有得率高、完整性好等优点。
文档编号C12N15/10GKCN102220312 B发布类型授权 专利申请号CN 201110123513
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月13日
发明者毕玉平, 陈高, 彭振英, 范仲学, 张斌, 张燕, 李兰 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),