专利名称:来自新陆早24与棉花纤维强度有关的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来自与高品质中长绒棉品种新陆早24纤维强度主效基因连锁的SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列)分子标记,用于提高棉花纤维品质的分子标记辅助选择，以提高选择的效率，加快育种步伐。
背景技术：
棉花是重要的纺织工业原料。棉花的生产在国民经济中占有重要的地位。我国棉花的生产在80年代前主要集中在产量的提高上，没有重视纤维品质的改良，使得我国的主栽棉品种大多产量较 高而品质较差。与美国相比，我国棉花纤维长度上有优势，但纤维比强度比美国稍差(杨伟华，项时康，唐淑荣等.2001,20年来我国自育棉花品种纤维品质分析.棉花学报.13(6):377-384)。随着纺织工业的飞速发展，棉花品种改良的速度落后于纺织技术的发展，目前我国棉花纤维质量可以满足纺织工业纺中、低档棉纱(32 40支纱)的要求，纺高支纱(60 80支)的原棉纤维所占比例较少。近年来，我国审定了一些长度在31mm以上，纤维 比强度在30cN/tex以上的陆地棉新品种，但品质类型单一，棉纤维品之间指标匹配不理想，大部分陆地棉栽培品种纤维比强度偏低，因此，培育优质的棉花品种，尤其是纤维比强度高的新品种，成为棉花育种工作的当务之急。
采用传统的育种方法提高现有陆地棉品种的纤维品质水平，首先要用具有高纤维强度基因渐渗的种质材料与现有陆地棉品种进行一系列杂交和回交，以打破纤维品质性状与产量性状之间的负相关，但是在每轮回交中都要对纤维品质进行检测，成本很高，工作量很大，而且只能等到收花结束一段时间后才能知道结果，另外，环境对纤维品质也有影响。这就要求必须有较大的育种群体,盲目性也加大,费时费力,成本加高,因此，品质育种进展缓慢。
利用分子标记技术可以在短时间对群体进行检测，且基因型可识别。利用目标性状与分子标记间的连锁关系，就可对目标性状进行选择，大大提高选择效率。国内外都很重视开展优质纤维品质基因的分子标记选择以用于标记辅助选择。Shappley等(1998)、Jiang等(1998)利用RFLP标记在F2中检测到40多个与纤维品质有关的QTL ;袁有禄等(2000-2001)及Zhang等(2003)利用异常棉高强纤维渐渗系7235与陆地棉遗传标准系TM-1为亲本构建了 F2和F2:3分离群体，鉴定出一个纤维强度的主效QTL，解释30%以上的表型变异，且在多个环境中均能检测到，已用于标记辅助选择。Mei (2004)在海陆种间F2群体中发现了 5个纤维品质的QTLs，虽然数目较少，但解释的表型变异较大，在22-42%之间。沈新莲等(2005)利用7235、PD6992和HS427三个陆地棉高强纤维种质系构建了 3个种内连锁图，共筛选到38个与纤维品质有关的QTL。胡文静等(2008)利用渝棉I号和7235的F2和F2:3分离群体，共筛选到36个纤维品质QTL。陈利(2008)利用陆地棉中棉所35和渝棉I号的F2与F2:3分离群体为材料共检测到5个纤维品质性状QTL，即I个纤维长度、2个纤维比强度和2个纤维细度。Qin等(2008)利用4个陆地棉品种，分两组杂交得到两个F1继续杂交，最后得到了一套F2分离群体，得到了一张包含285个SSR标记和一个形态学标记的遗传图谱，共2113.3cM,覆盖棉花基因组的42 %，共定位了 31个QTL，其中24个为显著性QTL ；31个QTL中有20个纤维品质QTL，其中5个为纤维强度的QTL。Zhu等(2008)利用HS46与MARCABUCAG8US-1-88的杂交组合配置了 188个系的RIL群体，用125个SSR标记构建了总长为965cM的遗传连锁图谱。在LOD >3.0的情况下，在LGUOl (未定到染色体上)检测到一个纤维伸长率的QTL，在A亚组染色体检测到17个纤维品质QTL，D亚组染色体检测到16个纤维品质QTL，这其中包括6个纤维强度的QTL。Chen等(2009)利用渐渗系7235与陆地棉遗传标准系TM-1杂交，再与TM-1回交得到3个RIL群体7TR-133，7TR-132，和7TR-214，利用3个群体在D8染色体上定位了 5个纤维强度的QTL，其中qFS_l能在3个群体中检测到，qFS-2和qFS-3能在两个群体中检测到。Zhang等(2009)利用杂交组合T586XYumian I得到大小为270的F2:7重组自交系，并利用SSR、SRAP、形态学标记和IT-1SJ等4种标记构建了一张604 (509个SSR，58个IT-1SJ，29个SRAP和8形态学标记)个位点的遗传连锁图谱，总长3140.9cmM,覆盖面花总基因组的70.6%。在5个环境下共检测到13个纤维品质的QTL，解释7.4% -43.1 %的表型变异，其中包括两个纤维强度的QTL。An等(2009)利用光子品系MD17分别与毛子栽培品种FM966和光子品系181杂交，构建两套F2分离群体，其中在MD17XFM966群体中检测到2个麦克隆值，I个纤维强度，2个纤维50%跨长和2个纤维2.5%跨长的QTL，纤维强度的QTL(qTl-cl6-l)与Guo等(2007)的研究一致。袁有禄、孙福鼎等(2009)专利申请(与棉花纤维强度主效基因连锁的分子标记)，利用中棉所41选系SGK9708和陆地棉优质品系0-153组合构建RIL群体，筛选出6个增效基因来自高值亲本0-153的纤维强度QTL，其中5个QTL位点多环境下稳定(专利申请公开号:CN 101613761A)。张科等(2009)利用陆地棉34B与海岛棉Giza70杂交，以陆地棉34B为轮回亲本，构建BC2F4:f^PBC2F4:7高代回交重组自交系群体，进行三年四个环境的试验，共定位了 27个纤维品质性状的QTL，其中在两环境下能检测到的有7个，包括两个纤维强的QTL0纤维品质所有QTL中有17个的增效基因来自海岛棉，单个QTL的贡献率在6-13%之间。孔广超等(2009)利用两个亲缘关系较远、棉花产量及纤维品质性状均存在较大差异的陆地棉品种HS46和MARCABUCAGSUS-1-88为亲本，通过改良行混合法培育而成的RIL群体为材料，进行了多年多环境的试验，共定位了 25个纤维品质的QTL，其中包括6个纤维强度的QTL。王义青等(2010)利用陆地棉鲁棉研21与高品质品系NM03102杂交，构建F2和F2:3分离群体，通过区间作图法，检测到了 20个纤维品质性状的QTL，其中，I个纤维强度的QTL和I个纤维整齐度的QTL与已有的报道一致，I个纤维强度的QTL和I个麦克隆值的QTL在两世代中稳定存在。梁燕等(2010)利用生产上推广的优良早熟陆地棉栽培品种中棉所36为受体亲本，海岛棉海I为供体亲本，选择培育了一套由303个单株组成的BC5F2染色体片段代换系。采用性状-标记间的单向方差分析，共定位了 33个与纤维品质性状有关的QTL，其中qUN-14-2、qBW-2-20、qFL-2-20和qMV_l_38这4个QTL存在一定的遗传稳定性，这些纤维品质性状的QTL中包括了 12个纤维强度的QTL。马靖等(2010)利用陆地棉优质品种渝棉I号、7235、丰产品种中棉所35为亲本，配置了三亲本杂交群体，利用复合区间作图法，共检测到了 10个纤维品质性状的QTL，解释6.5% -29.2%的表型变异，其中包括2个纤维强度的QTL，分别位于cl5和c25染色体上。
这些研究结果为纤维品质的辅助选择打下了良好的基础。但是，这些定位的QTLs有的缺乏稳定性和可靠性，有些在实验材料选择上没有考虑与育种选择相结合，难以应用于与育种实践中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种来自优质品种新陆早24与棉花纤维强度有关的分子标记，即:通过筛选来自优异纤维品质材料新陆早24中与棉花纤维强度主效基因连锁的SSR分子标记，进行DNA水平上的早期辅助选择，提高育种效率。
本发明提供的技术方案是:一种与棉花纤维强度主效基因位点连锁的分子标记，所述棉花纤维强度主效基因位点位于染色体c7上DPL0757-DPL0920标记区间内，与其连锁的标记为 DPL075713(i, DPL0852170, DPL092013(i。
本发明中，增效基因来自优质纤维亲本新陆早24，所述棉花纤维强度主效基因位点QTL命名为qFS-6-2，QTL的命名参考在水稻上的命名规则(MCCOUCH S R7Cho Y G7YanoM, et al.Report on QTL nomenclature[J].Rice Genet Newslett,1997,14:11-13.):q(数量性状)性状名称英文缩写(断裂比强度，FS)+ +所在连锁群代号(LG6)+QTL个数(LG6上第2个纤维强度QTL)。
一种所述的与棉花纤维强度主效基因位点连锁的分子标记的筛选方法，包括如下步骤:
(I)以鲁棉研28号和冀棉516为母本分别与新陆早24杂交构建F2、F2:3群体，其中，第一个群体以新陆早24为父本与转基因抗虫常规品种鲁棉研28号为母本杂交，获得F1种子，F1自交产生&，&自交得F2:3;另一个群体以新陆早24为父本，冀棉516为母本杂交，种植方法同第一个群体；
(2)提取上述F2分离群体及亲本的单株DNA ；
(3)采用SSR标记筛选棉花高强纤维标记，得到一个在两世代、两群体稳定存在纤维强度主效QTL，其位于位于染色体c`7上，与其连锁的标记为DPL075713Q，DPL0852170,DPL092013q ο
其中，3对SSR特征引物核苷酸序列为:
DPL0757引物，其正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ ID N0.2所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为130bp ；
DPL0852引物，其正向序列如SEQ ID N0.3所示，反向序列如SEQ ID N0.4所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为170bp ；
DPL0920引物，其正向序列如SEQ ID N0.5所示，反向序列如SEQ ID N0.6所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为130bp。
上述第(3)步中，首先，用SSR引物筛选新陆早24和鲁棉研28号亲本的DNA多态性，获得多态性引物和多态性位点，利用这些有多态性的引物对F2群体单株进行筛选，利用F2群体单株的多态性结果构建遗传连锁图谱，并结合F2和F2:3的纤维品质测定结果，定位相关QTL ;然后，根据定位结果，挑选QTL聚集出现的第6连锁群上的4对SSR引物即:DPL0757、DPL0852、DPL0920、BNL1694，对新陆早24和冀棉516亲本的DNA多态性进行分析，获得3对有多态性引物即:DPL0757、DPL0852、DPL0920和所述的3个标记位点，并构建遗传连锁图谱和定位QTL。
上述用SSR引物筛选新陆早24和鲁棉研28号亲本的DNA多态性，其中，PCR扩增反应体系为 IOul 体系，其中 IOXbuffer 1.0ul, IOmMd NTPs 0.5ul，Taq 酶(5U/ul)0.lul，模板 DNA 1.2ul, ddH20 6.2ul，IOuM 的正向引物 0.5ul，IOuM 的反向引物 0.5ul。PCR 热反应程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，循环30次，最后72°C延伸2min，4°C保存；在TC-512和东胜龙EDC-810扩增仪上进行扩增，PCR扩增产物在8%聚丙烯凝胶中电泳，银染显色，记录结果。
本发明具有以下有益效果:
本发明涉及一个与棉花纤维强度主效基因有关的位点qFS-6-2，增效基因来自优异纤维品质亲本新陆早24，且在两个世代的和匕3)，两个群体(鲁棉研28号X新陆早24、冀棉516X新陆早24)中均稳定存在。解释的表型变异分别为17.26%,6.72%,8.09%,8.29%。加性效应较大，分别为1.0274,1.1226、0.755、0.9241。定位的QTL，稳定、可靠，用于进行DNA水平上的早期辅助选择，提高育种效率。
图1为本发明F2群体(鲁棉研28号X新陆早24)部分分子标记连锁图谱及QTL位置。
图2为F2群体(冀棉516X新陆早24)部分分子标记连锁图谱及QTL位置。
图中的标记采用“引物名称/特异标记相应条带的分子量”的形式，“/”后的分子量与文中引物名称的下标数字相对应。
qFS-6-2在两图中都位于染色体c7的DPL0757-DPL0920标记区间内，与其连锁的标记为DPL075713Q， DPL0852170, DPL0920⑶。在鲁棉研28号群体的遗传连锁图中，该QTL的峰值位于56cM，与DPL075713Q，DPL0852170, DPL0920130等3个标记的遗传距离分别为1.5cM、
0.3cM和8.7CM。在冀棉516群体的遗传连锁图中，该QTL的峰值位于6cM，与DPL0757130,DPL0852170, DPL0920130等3个标记的遗传距离分别为3.2cM、21cM和6.2cM。
具体实施方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
本发明与棉花纤维强度主效基因连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的:
(I)第一个群体以晚熟，优质中长绒棉新陆早24为父本与转基因抗虫常规品种鲁棉研28号为母本，配制杂交组合，年底F1自交加代获得F2种子，第二年春将(鲁棉研28号X新陆早24)F2种种植获得238个单株。将所有F2单株自交获得F2:3种子。第三年种植238个F2:3家系种子。每个家系随机选择15株。分别于第二年、第三年秋吐絮后取样，每个家系随机收获30个正常吐絮铃。对亲本F2单株及F2:3棉样进行纤维品质检测。检测指标包括断裂比强度、上半部平均长度、麦克隆值、整齐度指数和纤维伸长率，采用HVICC校准水平。
第二个群体以高产、抗病、优质棉花新品种冀棉516为母本与新陆早24配制杂交组合，共256个F2单株，对应256个F2:3家系。种植方法同上。
(2)(鲁棉研28号X新陆早24)和(冀棉516X新陆早24)F2分离群体的单株DNA 的提取采用 CTAB 法(Paterson et al.，1993)[0030](3)采用SSR标记进行棉花高强纤维标记的筛选。共选用7638对SSR引物，筛选新陆早24和鲁棉研28号亲本的DNA多态性，其中以NAU编号的引物为南京农业大学开发，共 2278 对(引物来源:① http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRIMER_NAU.xls !② Han ZG, Guo WZ, et al., Genetic mappingof EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreum inallotetraploid cotton.Mol Gen Genomics 2004，272:308-327) ;#BNL 编号的引物为美国布鲁海文国家实验室开发，共687对(引物来源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/BNL_primer_marker_inf0.xls);以 CGR>DPL>SHIN、DC等编号的引物为孟山都公司开发，共2937对(引物来源:①http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRIMER_MON.xls ;② Xiao J, Wu K, Fang DD,et al., New SSR markers for use in cotton(Gossypium spp.) improvement, Journalof Cotton Science，2009，13:75-157.);以HAU编号的引物为华中农业大学开发，共408对(弓I 物来源:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRMER_HAU.xls);以JESPR、Gh编号的引物为美国德州农工大学开发，共1013对(引物来源:① http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRIMER_JESPR.xls ；② http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRIMER_GH.xls);以CIR编号的引物为国际农业研究发展中心开发，共121对(引物来源:① http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_project_data/CMD_PRIMER_CIR.xls ；(2) Nguyen TB, Giband M, Brottier P, et al., Wide coverage of the tetraploidcotton genome using newly developed microsatellite markers.Theor Appl Genet,2004,109 =167-175) ;TMB编号的引物为美国农业部农业研究服务署开发，共194对(引物来源文献:http://www.cottonmarker.0rg/cmd_downloads/ssr_pro ject_data/CMD_PRIMER_TMB.xls)，共获得225对多态性引物和238个多态性位点，利用这些有多态性的引物对F2群体单株进行筛选，利用F2群体单株的多态性结果构建遗传连锁图谱，并结合F2和F213的纤维品质测定结果，定位相关QTL，根据定位结果，挑选QTL聚集出现的第6连锁群上的 4 对 SSR 引物(DPL0757、DPL0852、DPL0920、BNL1694)，对新陆早 24 和冀棉 516 亲本的DNA多态性进行分析，获得 3对有多态性引物(DPL0757、DPL0852、DPL0920)和3个标记位点(3对引物序列和扩增片段大小见表I)，并构建遗传连锁图谱和定位QTL。本实施例中，所用的SSR引物分别由上海英骏生物技术有限公司、上海生工生物工程有限公司和北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR扩增反应体系为IOul体系，其中IOXbuffer
1.0ul, IOmMd NTPs 0.5ul，Taq酶(5U/ul)0.lul，模板DNA 1.2uLddH2O 6.2ul，IOuM的正向引物0.5ul，IOuM的反向引物0.5ul。PCR热反应程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，循环30次，最后72°C延伸2min，4°C保存；在TC-512和东胜龙EDC-810扩增仪上进行扩增，PCR扩增产物在8%聚丙烯凝胶中电泳，银染显色，记录结果。
表13对特征引物序列和扩增片段大小
权利要求
1.一种与陆地棉新陆早24纤维强度主效基因位点连锁的分子标记，其特征在于:所述棉花纤维强度主效基因位点位于染色体c7上DPL0757-DPL0920标记区间内，与所述位点连锁的标记为 DPL0757130，DPL0852170, DPL092013(i。
2.—种权利要求
1所述的与陆地棉新陆早24纤维强度主效基因位点连锁的分子标记的筛选方法，包括如下步骤: (1)以鲁棉研28号和冀棉516为母本分别与新陆早24杂交构建F2、F2:3群体，其中，第一个群体以新陆早24为父本与转基因抗虫常规品种鲁棉研28号为母本杂交，获得F1种子，F1自交产生F2, F2自交得F2:3;另一个群体以新陆早24为父本，冀棉516为母本杂交，种植方法同第一个群体； (2)提取上述F2分离群体及亲本的单株DNA； (3)采用SSR标记筛选棉花高强纤维标记，得到一个在两世代、两群体稳定存在纤维强度主效QTL，其位于染色体c7上，与其连锁的标记DPL075713Q，DPL0852170, DPL0920130， 筛选对象:两对亲本，新陆早24与鲁棉研28号、新陆早24与冀棉516， 筛选步骤:用不同引物对两对亲本DNA进行PCR扩增，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色显示扩增条带，亲本间条带存在差异，则此对引物为这对亲本的多态性引物， 引物结构:其中，3对SSR特征引物核苷酸序列为: DPL0757引物，其正向序列如SEQ ID N0.1所示，反向序列如SEQ ID N0.2所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为130bp ； DPL0852引物，其正向序列如SEQ ID N0.3所示，反向序列如SEQ ID N0.4所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为170bp ； DPL0920引物，其正向序列如SEQ ID N0.5所示，反向序列如SEQ ID N0.6所示，用该引物扩增出的新陆早24号特异标记，条带分子量为130bp ； QTL定位方法:用有多态性的引物对F2群体单株进行筛选，利用F2群体单株的多态性结果构建遗传连锁图谱，采用作图软件Jionmap3.0进行标记连锁分析；结合两套F2群体和F2:3家系纤维品质测定结果,利用QTL作图软件Windows QTL Cartographer〗.5,选用复合区间作图法进行QTL定位。
3.根据权利要求
2所述的筛选方法，其特征在于:第(3)步中，首先，用SSR引物筛选新陆早24和鲁棉研28号亲本的DNA多态性，获得多态性引物和多态性位点，利用这些有多态性的引物对F2群体单株进行筛选，利用F2群体单株的多态性结果构建遗传连锁图谱，并结合F2和F2:3的纤维品质测定结果，定位相关QTL ;然后，根据定位结果，挑选QTL聚集出现的第6连锁群上的4对SSR引物，即:DPL0757、DPL0852、DPL0920、BNL1694，对新陆早24和冀棉516亲本的DNA多态性进行分析，获得3对有多态性引物即:DPL0757、DPL0852、DPL0920和与纤维强度主效QTL连锁的标记DPL075713Q，DPL085217(i，DPL092013Q，并构建遗传连锁图谱和定位QTL。
4.根据权利要求
3所述的筛选方法，其特征在于:用SSR引物筛选新陆早24和鲁棉研28号亲本的DNA多态性，PCR扩增反应体系为10 μ I体系，其中IOXbuffer 1.0 μ I7IOmMdNTPs 0.5 μ 1， 浓度为 5υ/μ I 的 Taq 酶 0.1 μ 1，模板 DNA 1.2 μ 1，ddH20 6.2μ 1，10μΜ 的正向引物0.5μ 1，10μΜ的反向引物0.5μ I ;PCR热反应程序为:95°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，循环30次，最后72°C延伸2min，4°C保存；在1'(>512和东胜龙EDC-810扩增仪上进行扩增，PCR扩增产物在8%聚丙烯凝胶中电泳，银染显色，记录 结果。
专利摘要
本发明公开了一种与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记，用以下方法获得的以新陆早24为父本，鲁棉研28号和冀棉516为母本，分别构建两个F2和F2:3分离群体。用SSR引物进行亲本间(鲁棉研28号和新陆早24)多态性筛选，利用F2构建遗传连锁图谱，进行两世代QTL定位。根据定位结果，挑选与高强纤维主效基因连锁的SSR标记对亲本新陆早24和冀棉516的DNA多态性进行分析，并构建遗传连锁图谱和定位QTL。一个纤维强度主效QTL(qFS-6-2)在两个群体两个世代都稳定检测到，位于染色体c7的DPL0757-DPL0920标记区间内，增效基因来自亲本新陆早24，qFS-6-2的连锁标记为DPL0757130，DPL0852170，DPL0920130。利用本发明标记进行分子标记辅助选择，可提高棉花纤维强度的选择效率。
文档编号C12Q1/68GKCN102181442 B发布类型授权 专利申请号CN 201110119441
公开日2013年7月10日 申请日期2011年5月10日
发明者袁友禄, 孔凡金, 李俊文, 龚举武, 石玉真, 刘爱英, 商海红, 龚万奎, 王涛 申请人:中国农业科学院棉花研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),